Monika Brzychczy-Włoch1,Tomasz Gosiewski1, Małgorzata Bodaszewska1, Katarzyna Talaga1, Joanna Natkaniec1, Paweł Adamski2, Piotr B. Heczko1
Występowanie genów kodujących białka z rodziny Alp u Streptococcus agalactiae
*1 Katedra Mikrobiologii, Uniwersytet Jagielloński Collegium Medicum, Kraków, Kierownik: prof. dr hab. med. Piotr B. Heczko
2 Instytut Ochrony Przyrody, Polska Akademia Nauk, Kraków, Kierownik: prof. dr hab. H. Okarma
Detekcję genów bca, epsilon, alp2, alp3, alp4 oraz rib, kodujących białka z rodziny Alp (ang. alpha-like protein family), będące istotnymi czynnikami wirulencji paciorkowców grupy B (GBS), przeprowadzono metodą PCR multipleks. Analizie poddano szczepy Streptococcus agalactiae reprezentujące różne serotypy (Ia, Ib, II, III, IV, i V), które zostały wyizolowane od zdrowych kobiet ciężarnych. Poszukiwane geny występowały pojedynczo we wszystkich badanych izolatach, przy czym dominowały szczepy z genem epsilon (27%), następnie rib (21%) oraz alp2 (21%), bca (17%) i alp3 (14%). w badanej populacji nie stwierdzono szczepów z genem alp4. Wykazano statystycznie istotną zależność pomiędzy prawdopodobieństwem wystąpienia badanych genów, a serotypami GBS (p<0,0001). Podsumowując, typowanie pacior- kowców grupy B pod względem występowania genów kodujących białka z rodziny Alp, umożliwia zróżnicowanie szczepów w obrębie serotypów, co ma znaczenie zarówno w badaniach epidemiologicznych, jak również jest szcze- gólnie przydatne w pracach nad szczepionką przeciwko zakażeniom GBS.
Streptococcus agalactiae, zaliczany do paciorkowców grupy serologicznej B (ang.
Group B Streptococcus - GBS), stanowi część fizjologicznej flory ludzi, może być jednak przyczyną wewnątrzowodniowych zakażeń płodu lub noworodków, związanych z wysoką śmiertelnością, zakażeń połogowych, a także zakażeń u osób w podeszłym wieku oraz osób w immunosupresji (5, 13, 16).
Paciorkowce grupy B charakteryzują się dużą zmiennością genetyczną, która zależy między innymi od szerokości geograficznej, grupy wiekowej pacjentów, ich rasy, oraz typu zakażenia (3, 6, 12). w obrębie gatunku S. agalactiae wyróżniamy dziesięć serotypów (Ia, Ib, II – IX) wydzielonych na podstawie różnic w budowie polisacharydów powierzchnio-
* Praca finansowana w ramach grantu własnego numer N N401 042337 z Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego
wych (ang. capsular polisacharide – CPS) (3, 14, 18). Poznanie częstości występowania określonych serotypów dla wybranych populacji ma szczególne znaczenie w badaniach epidemiologicznych, a także w rozwoju prac nad skonstruowaniem wieloważnej szczepionki przeciwko zakażeniom GBS, nad którą obecnie trwają intensywne badania i której głównym składnikiem są wybrane polisacharydy powierzchniowe GBS (4, 6, 17).
W ostatnich latach istotnego znaczenia nabierają także badania nad białkami z rodziny Alp występującymi u S. agalactiae. Wykazano, że niektóre z tych białek wykazują silne właściwości immunogenne i skoniugowane w eksperymentalnych szczepionkach z CPS istotnie podnoszą jego immunogenność (6, 11, 13, 20). Ponadto, typowanie szczepów GBS w zależności od występowania białek z rodziny Alp, lub genów je kodujących, jest bardzo przydatne w badaniach epidemiologicznych (2, 7, 10).
Białka z rodziny Alp (ang. alpha-like proteins) są najlepiej poznanymi i opisanymi białkami powierzchniowymi S. agalactiae. Do białek tych zaliczamy białko: Alfa-C, Epsilon (znane również pod nazwą Alp1 lub Epsilon/Alp1), Alp2, Alp3, Alp4 oraz Rib, kodowane odpowiednio przez alleliczne geny bca, epsilon, alp2, alp3, alp4 oraz rib (2, 3, 13). Białko Alfa-C wraz z białkiem Beta-C, które nie należy do rodziny białek Alp, są komponentami antygenu C, pierwszego opisanego antygenu białkowego S. agalactiae (21). Każdy z genów białek Alp posiada w swej strukturze tandemowy region powtórzeń (ang. tandem repeated region) oraz konserwatywne końce N i C (9). Ze względu na mozaikową budowę białek Alp obserwuje się występowanie reakcji krzyżowych pomiędzy tymi białkami, a surowi- cami diagnostycznymi stosowanymi do typowania serologicznego. Występowanie reakcji krzyżowych sugeruje, że szczepionka zawierająca wybrane, najczęściej występujące białka z rodziny Alp, może zapewnić szerokie spektrum ochrony przeciwko zakażeniom GBS (17).
Ponieważ brak jest polskich danych dotyczących badań nad występowaniem genów kodujących białka z rodziny Alp u S. agalactiae, dlatego też głównym celem pracy było oznaczenie genów bca, epsilon, alp2, alp3, alp4 oraz rib u szczepów GBS, a także ocena przydatności opisanej metody PCR multipleks do typowania paciorkowców grupy B.
MATERIAŁ I METODY
Badania nad nosicielstwem paciorkowców grupy B prowadzono na grupie 1176 kobiet w latach 2007 - 2009 zgodnie z protokołem klinicznym zaakceptowanym przez Komisję Bioetyczną UJ (opinia numer KBET/143/B/2007). Materiałem badanym były wymazy z pochwy i odbytu, diagnozowane w kierunku GBS metodą hodowli prowadzonej według rekomendacji CDC (Centers for Disease Control and Prevention) (16), oraz Polskiego To- warzystwa Ginekologicznego (8). Występowanie genów kodujących białka z rodziny Alp, oznaczono dla 169 szczepów Streptococcus agalactiae (GBS) reprezentujących różne sero- typy: Ia (n=36), Ib (n=14), II (n=24), III (n=55), IV (n=8), i V (n=32), określone wcześniej dzięki zastosowaniu metody PCR multipleks zgodnie z opisaną procedurą Brzychczy-Włoch i inni (2009) (1).
W celu detekcji genów bca, epsilon, alp2, alp3, alp4 oraz rib, zastosowano metodę PCR multipleks z użyciem 6 starterów odwrotnych i jednego wspólnego dla nich startera wiodącego zgodnie z procedurą Creti i inni (2004) (2) oraz Gherardi i inni (2007) (3).
w metodzie tej wykorzystano dwa zestawy starterów, i i II (Tabela I) (Genomed). Przy po-
mocy zestawu i starterów określano obecność genu: bca, epsilon, alp2/alp3, alp4 oraz rib, natomiast zestaw II posłużył do zróżnicowania pomiędzy genami alp2 oraz alp3 i pozwolił na wykazanie obecności genu alp3. w celu przeprowadzenia reakcji amplifikacji, genomo- we DNA izolowano przy użyciu kolumienkowego zestawu Genomic Mini (DNA Gdańsk).
Mieszanina reakcyjna zawierała: 10 pmoli/µl każdego startera; 50 ng bakteryjnego DNA;
250µM każdego dNTP (Roche); 2,0 mM MgCl2 (Eurx); 1U polimerazy Yellow Taq (Eurx).
Próbki poddawano amplifikacji w termocyklerze PTC-200 (BioRad), zgodnie z następującym programem: 96OC - 3 min., 30 x (95OC - 60 sek., 58OC - 45 sek., 72OC - 45 sek.), 72OC - 10 min. Otrzymane produkty analizowano w 1,5% żelu agarozowym w obecności bromku etydyny (BioRad) 0.25 µg/ml. Uzyskany obraz poddawano ocenie przy pomocy programu QuantityOne (BioRad) oraz aparatu GelDoc 2000 (BioRad).
Do analizy statystycznej stosowano test G2 (Likelihood ratio), wartość p<0,05 uznawano za istotną statystycznie.
WYNIKI I ICH OMÓWIENIE
Polisacharydy powierzchniowe oraz białka z rodziny Alp, będące istotnymi czynnikami wirulencji paciorkowców grupy B, są obecnie intensywnie badane jako składniki ekspery- mentalnych szczepionek przeciwko zakażeniom GBS (4, 6, 20). Ponieważ obserwuje się dużą zmienność genetyczną szczepów S. agalactiae w zależności od szerokości geograficznej oraz badanej populacji, istnieje potrzeba prowadzenia badań epidemiologicznych na szeroką skalę, obejmujących różne populacje i kraje (3, 6, 13). W badaniach tych szczególnie przydatne jest typowanie izolatów GBS polegające na detekcji genów kodujących poszczególne CPS (14) oraz białka z rodziny Alp (2). Wyniki uzyskane z tego typu badań są dostępne z wielu światowych ośrodków naukowych (3, 7, 13), brak jest natomiast takich danych z Polskich centrów badawczych.
Zastosowana w prezentowanych badaniach metoda PCR (2, 3) dzięki użyciu dwóch zestawów starterów specyficznych dla genów kodujących poszczególne białka z rodziny Alp w stosunkowo prosty sposób umożliwiła ich detekcję (Tabela I, Ryc. 1, Ryc. 2). Analizie poddano występowanie sześciu genów z rodziny Alp: bca, epsilon, alp2, alp3, alp4 oraz rib, kodujących odpowiednio białka: Alfa-C, Epsilon, Alp2, Alp3, Alp4 oraz Rib. Badanie wykonano dla 169 szczepów S. agalactiae pochodzących z nosicielstwa pochwowego lub Tabela I. Sekwencje specyficznych starterów komplementarnych dla genów kodujących białka powierzchniowe z rodziny Alp występujące u S. agalactiae według Creti i inni (2004) (2) oraz Gherardi i inni (2007) (3).
Zestaw
starterów Nazwa startera Sekwencja (5’ i 3’) Wielkość
produktu (pz)
I i II Universal TGATACTTCACAGACGAAACAACG -
I
Alpha-C TACATGTGGTAGTCCATCTTCACC 398
Rib CATACTGAGCTTTTAAATCAGGTGA 295
Epsilon CCAGATACATTTTTTACTAAAGCGG 200
Alp2/3 CACTCGGATTACTATAATATTTAGCAC 334
Alp4 TTAATTTGCACCGGATTAACACCAC 110
II Alp3 GCTTAAGGATAGCAACGAACCAAAA 1243
Ryc. 1. Przykładowe produkty amplifikacji charakterystyczne dla badanych genów kodujących białka z rodziny Alp uzyskane za pomocą metody PCR multipleks.
Ścieżki: 1–17 – próby badane: 1, 4, 8, 10, 13, 15 – epsilon (200pz); 3, 5, 6, 12, 16 – rib (295pz); 2, 7, 9, 11, 14 – alp2/3 (334pz); 17 – bca (398pz); N – próba negatywna; P – próba pozytywna;
M – marker wielkości PerfectTM 100 bp DNA Ladder (Eurx).
Ryc. 2. Przykładowe produkty amplifikacji charakterystyczne dla genu alp3 uzyskane za pomocą metody PCR.
Ścieżki: 1–7 – próby badane, alp3 (1243pz); N – próba negatywna; P – próba pozytywna; M – marker wielkości PerfectTM 100 bp DNA Ladder (Eurx).
odbytniczego od kobiet ciężarnych. Wybrane szczepy reprezentowały różne, najczęściej występujące serotypy GBS w badanej populacji: Ia (n=36), Ib (n=14), II (n=24), III (n=55), IV (n=8), i V (n=32), określone wcześniej dzięki zastosowaniu odpowiedniej metody PCR multipleks (1, 14). Poszukiwane geny występowały pojedynczo we wszystkich badanych izolatach, przy czym dominowały szczepy z genem epsilon (n=44, 27%), a następnie rib (n=36, 21%) oraz alp2 (n=36, 21%), bca (n=29, 17%) i alp3 (n=24, 14%). W badanej po- pulacji nie stwierdzono szczepów z genem alp4 (Ryc. 3).
Ryc. 3. Rozkład genów kodujących białka z rodziny Alp wśród szczepów S. agalactiae izolowanych z przypadków nosicielstwa pochwowego lub odbytniczego u ciężarnych.
Uzyskany wynik występowania genów kodujących białka z rodziny Alp u pacior- kowców grupy B izolowanych z przypadków nosicielstwa różni się w niewielkim stopniu od wyników opisywanych przez innych autorów (3, 12). Obserwowane różnice dotyczą, częstości występowania poszczególnych genów, wśród których, w cytowanych pracach, dominował gen rib (33-42%) (3, 12). Prawdopodobnie związane jest to nie tylko z różnym obszarem geograficznym, ale także z grupą badanych izolatów, która w naszych badaniach obejmowała wyłącznie izolaty pochodzące z nosicielstwa, zaś w omawianych pracach, były to głównie szczepy izolowane z krwi.
Procentowy udział poszczególnych serotypów (Ia, Ib, II, III, IV, V), w grupie izolatów GBS posiadających określony gen (bca, alp2, alp3, rib, epsilon) przedstawiono w sposób obrazowy na wykresie (Ryc. 4). Gen bca oznaczono u 29 izolatów GBS, przy czym najczęś- ciej występował u izolatów należących do serotypu II (n=13, 44%), następnie Ia (n=6, 21%) i Ib (n=6, 21%), stosunkowo rzadko w przypadku serotypu III (n=2, 7%) i V (n=2, 7%), zaś u szczepów z serotypem IV nie został stwierdzony. Obecność genu alp2 potwierdzono w grupie 36 izolatów GBS, gdzie istotnie dominował wśród szczepów reprezentujących serotyp III (n=32, 89%), poza tym, był także stwierdzony w serotypie V (n=2, 5%), Ia (n=1, 3%) i II (n=1, 3%), nie występował natomiast w serotypach Ib i IV. Występowanie genu alp3 wykazano dla 24 szczepów GBS, przy czym było ono silnie skorelowane z serotypem V (n=22, 92%). Gen ten w nielicznych przypadkach występował u szczepów z serotypem III
(n=2, 8%), nie stwierdzono go natomiast wśród szczepów z serotypem Ia, Ib, III i IV. Gen rib występował u 36 izolatów GBS, z czego dominował wśród szczepów GBS z serotypem III (n=19, 53%), ponadto, występował także w serotypie II (n=10, 28%), V (n=4, 11%) oraz Ia (n=3, 8%), natomiast nie wykazano jego obecność w serotypach Ib i IV. Detekcję genu epsilon wykazano u 44 izolatów S. agalactiae. Gen ten dominował u szczepów z serotypem Ia (n=26, 59%), a także w serotypie Ib (n=8, 18%), IV (n=8, 18%) oraz V (n=2, 5%), brak go natomiast było wśród szczepów z serotypem II i III. Warto zwrócić uwagę, że gen epsilon był silnie skorelowany z serotypem IV, gdyż został oznaczony u wszystkich przebadanych szczepów reprezentujących ten serotyp. Podsumowując, stwierdzono, że istnieje związek pomiędzy prawdopodobieństwem wystąpienia określonych genów kodujących białka z rodziny Alp, a serotypami GBS i zależność ta jest statystycznie istotna (p<0,0001). Przy czym, należy zaznaczyć, że obserwowane zjawisko nie dotyczy ścisłej korelacji pomiędzy danym serotypem, a konkretnym genem kodującym białko z rodziny Alp, ale jest znacznie bardziej złożone i trudne w interpretacji.
Uzyskane wyniki potwierdzają już wcześniej opisywane przez innych autorów zależno- ści, pomiędzy występowaniem poszczególnych CPS, a genami kodującymi białka z rodziny Alp (2, 7). Na przykład Creti i inni (2004) (2) zauważyli powiązanie pomiędzy serotypem Ia, Ib i II a genem bca, serotypem III i genem rib oraz serotypem V i VIII, a genem alp3.
Podobnie Persson i inni (2007) wykazali występowanie genu epsilon w serotypie Ia, bca w Ib i II, rib w III oraz alp3 z V (13).
Ponadto, przeprowadzono szczegółową analizę przeciętnej częstości występowania genów kodujących białka z rodziny Alp: bca, epsilon, alp2, alp3 oraz rib w poszczególnych serotypach S. agalactiae, zgodnie z metodą kalkulacji wartości oczekiwanych w testach częstotliwości według Sokal i Rolf (1992) (19). Na podstawie wyników uzyskanych dla wszystkich badanych szczepów, obliczono przeciętną częstość występowania genów kodu- jących białka Alp, a następnie użyto jej jako podstawy normalizującej dla poszczególnych serotypów. Wyniki analizy przedstawiono dla każdego oznaczonego genu na osobnym wykresie (Ryc. 5), gdzie oś „X” stanowi podstawę normalizującą dla badanych serotypów.
Ryc. 4. Procentowy udział poszczególnych serotypów Ia, Ib, II, III, IV, V, w grupie izolatów GBS posiadających określony gen: bca, alp2, alp3, rib, epsilon.
Wartości dodatnie przedstawione jako słupki powyżej osi „X” wskazują w próbie na więk- szą od przeciętnej częstość występowania danego genu w grupie izolatów z określonym serotypem, zaś wartości ujemne przedstawione jako słupki poniżej osi „X”, wskazują na mniejszą od przeciętnej częstość występowania danego genu.
Na podstawie uzyskanych wyników wykazano, że szczepy GBS pochodzące z przy- padków nosicielstwa charakteryzuje bardzo duża zmienność genetyczna. Dlatego też, ty- powanie szczepów S. agalactiae tylko w odniesieniu do ich serotypu jest niewystarczające.
Dopiero wyniki pochodzące z połączenia metod typowania, uwzględniające obecność genów kodujących poszczególne CPS oraz genów kodujących białka z rodziny Alp, umożliwiają dokładne zróżnicowanie szczepów S. agalactiae w obrębie danego serotypu i są bardzo przydatne w badaniach epidemiologicznych oraz w pracach nad uzyskaniem szczepionki przeciwko zakażeniom paciorkowcami grupy B.
Ryc. 5. Przeciętna częstość wystąpienia genów kodujących białka z rodziny Alp: bca, epsilon, alp2, alp3 oraz rib w poszczególnych serotypach S. agalactiae. Oś „X” stanowi podstawę normalizującą dla badanych serotypów. Słupki powyżej osi „X” przedstawiają większą od przeciętnej częstość występowania danego genu w określonym serotypie GBS, zaś słupki poniżej osi „X”, wskazują na mniejszą od przeciętnej częstość występowania danego genu.
WNIOSKI
1. Potwierdzono przydatność metody PCR multipleks do oznaczania genów kodujących wybrane białka powierzchniowe z rodziny Alp u paciorkowców grupy B.
2. Wśród izolatów GBS pochodzących z nosicielstwa pochwowego lub odbytniczego w grupie kobiet ciężarnych, dominowały szczepy GBS z genem epsilon (27%), następnie rib (21%) oraz alp2 (21%), kolejno bca (17%) i alp3 (14%). Poszukiwane geny wy- stępowały pojedynczo we wszystkich badanych izolatach GBS, przy czym, w badanej populacji nie stwierdzono szczepów posiadających gen alp4.
3. Wykazano statystycznie istotną zależność pomiędzy prawdopodobieństwem wystąpienia określonych genów kodujących białka z rodziny Alp, a serotypami GBS (p<0,0001).
4. Typowanie paciorkowców grupy B pod względem występowania genów kodujących białka z rodziny Alp, daje możliwość bardzo dokładnego zróżnicowania szczepów w obrębie serotypów, co ma znaczenie zarówno w badaniach epidemiologicznych, jak również jest szczególnie przydatne w pracach nad uzyskaniem szczepionki przeciwko zakażeniom GBS.
M. Brzychczy-Włoch,T. Gosiewski, M. Bodaszewska, K. Talaga, J. Natkaniec, P. Adamski, P.B. Heczko
Occurrence of surface protein genes from alpha-like protein (Alp) family in Streptococcus agalactiae isolates
SUMMARY
Distribution of serotypes and alpha-like surface protein (Alp) of Streptococcus agalactiae (Group B Streptococci – GBS) vary with geographical region, ethnic origin and the virulence of clinical isolates. Demonstration of different genotypes based on surface protein genes improves the potential of GBS subtyping, is essential in research on new vaccines against invasive neonatal infections and may be useful in epidemiological studies. The molecular characterization of protein gene profile of GBS isolates was the main aim of this study. We evaluated the applicability of multiplex PCR for the identification of GBS protein genes from Alp family, such as: epsilon, bca, rib, alp2, alp3, alp4 and evaluated presence of these genes in the group of GBS isolates originating from vaginal or rectal carriage in pregnant women. For statistical analysis the G2 (Likelihood ratio) test was used. P values of <0.05 were considered significant. The surface protein genes were found in all investigated strains.
The epsilon gene dominated (27%) in GBS isolates originating from healthy pregnant women. The other genes were detected with the following frequency: rib (21%), alp2 (21%), bca (17%) and alp3 (14%). In the analyzed population, GBS strains with alp4 gene were not found. A statistically significant relationship between surface protein genes and capsular polysaccharides was demonstrated (p<0.0001).
The results of our study show immense diagnostic usefulness of multiplex PCR for identification of genes encoding GBS surface proteins from Alp family.
PIŚMIENNICTWO
1. Brzychczy-Włoch M, Gosiewski T, Bogdaszewska M i inni. Rozkład serotypów paciorkowców grupy B, izolowanych z przypadków nosicielstwa, oznaczonych metodą multipleks PCR . Med Dośw Mikrobiol 2009; 61: 293-9.
2. Creti R, Fabretti F, Orefici G i inni. Multiplex PCR assay for direct identification of group B streptococcal alpha-protein-like protein genes. J Clin Microbiol 2004; 42: 1326–9.
3. Gherardi G, Imperi M, Baldassarri L i inni. Molecular epidemiology and distribution of serotypes, surface proteins, and antibiotic resistance among group B streptococci in Italy J Clin Microbiol 2007; 45: 2909–16.
4. Heath PT, Feldman RG. Vaccination against group B streptococcus. Expert Rev Vaccines 2005;
4: 207–18.
5. Heath PT, Schuchat A. Perinatal group B streptococcal disease. Clin Obstet Gynecol 2007; 21:
411–24.
6. Johri AK, Paoletti LC, Glaser P i inni. Group B Streptococcus: global incidence and vaccine development. Nat Rev Microbiol 2006; 4: 932–42.
7. Kong F, Gowan S, Martin D i inni. Molecular profiles of group B streptococcal surface protein antigen genes: relationship to molecular serotypes. J Clin Microbiol 2002; 40: 620–6.
8. Kotarski J, Heczko PB, Lauterbach R i inni. Rekomendacje Polskiego Towarzystwa Ginekolo- gicznego dotyczące wykrywania nosicielstwa paciorkowców grupy B (GBS) u kobiet w ciąży i zapobiegania zakażeniom u noworodków. Ginekol Pol 2008; 79: 221–3.
9. Lachenauer CS, Creti R, Michel JL i inni. Mosaicism in the alpha-like protein genes of group B streptococci. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97: 9630–5.
10. Lindahl G, Stalhammar-Carlemalm M, Areschoug T. Surface proteins of Streptococcus agalactiae and related proteins in other bacterial pathogens. Clin Microbiol Rev 2005; 18: 102–27.
11. Manning S, Ki M, Marrs C i inni. The frequency of genes encoding three putative group B strep- tococcal virulence factors among invasive and colonizing isolates. BMC Infect Dis 2006; 6: 116.
12. Persson E, Berg S, Trollfors B i inni. Serotypes and clinical manifestations of invasive group B streptococcal infections in western Sweden 1998-2001. Clin Microbiol Infect 2007; 10: 791–6.
13. Persson E, Berg S, Bevanger L i inni. Characterization of invasive group B streptococci based on investigation of surface proteins and genes encoding surface proteins. Clin Microbiol Infect 2008; 14: 66–73.
14. Poyart C, Tazi A, Réglier-Poupet H i inni. Multiplex PCR assay for rapid and accurate capsular typing of group B streptococci. J Clin Microbiol 2007; 45: 1985–8.
15. Savoia D, Gottimer C, Crocilla C i inni. Streptococcus agalactiae in pregnant women: phenotypic and genotypic characters. J Infect 2008; 56: 120–5.
16. Schrag S, Gorwitz R, Fultz-Butts K i inni. Prevention of perinatal group B streptococcal disease.
Revised guidelines from CDC. MMWR 2002; 15: 1–22.
17. Seifert KN, Adderson EE, Whiting AA i inni. A unique serine-rich repeat protein (Srr-2) and novel surface antigen (epsilon) associated with a virulent lineage of serotype III Streptococcus agalactiae. Microbiology 2006; 152: 1029–40.
18. Slotved HC, Kong F, Lambertsen L i inni. Serotype IX, a proposed new Streptococcus agalactiae serotype. J Clin Microbiol 2007; 45: 2929–36.
19. Sokal RR, Rohlf FJ. Introduction to Biostatistics. 2nd ed. Freeman: San Francisco, 1987.
20. Stalhammar-Carlemalm M, Stenberg L, Lindhal G. Protein Rib: a novel group B streptococcal cell surface protein that confers protective immunity and is expressed by most strains causing invasive infections. J Exp Med 1993; 177: 1593–603.
21. Wilkinson HW, Eagon RG. Type-specific antigens of group B type Ic streptococci. Infect Immune 1971; 4: 596–604.
Otrzymano: 29 XI 2011 r.
Adres Autora: 31-121 Kraków, ul. Czysta 18, Katedra Mikrobiologii CM UJ e-mail: mbrzych@cm-uj.krakow.pl
