WYKRYWANIE DROBNOUSTROJÓW CHOROBOTWÓRCZYCH W YWNOŒCI ZA POMOC KLASYCZNYCH I SZYBKICH METOD MIKROBIOLOGICZNYCH

(1)

Daniela Gwiazdowska

Uniwersytet Ekonomiczny w Poznaniu

WYKRYWANIE DROBNOUSTROJÓW CHOROBOTWÓRCZYCH W ¯YWNOŒCI ZA POMOC¥ KLASYCZNYCH I SZYBKICH METOD MIKROBIOLOGICZNYCH

Streszczenie: Zagro¿enia mikrobiologiczne w ¿ywnoœci stanowi¹ ogromny problem zarówno w krajach uprzemys³owionych, jak i rozwijaj¹cych siê. Ka¿dego roku odnotowuje siê du¿¹ liczbê zatruæ pokarmowych na ca³ym œwiecie, w tym wiele przypadków œmiertelnych, a zarazem sporo przypadków o nieznanej etiologii. Klasyczne metody wykrywania mikroorganizmów, stanowi¹ce metody referencyjne, charakteryzuj¹ siê pracoch³onnoœci¹ i d³ugim czasem oczekiwania na wynik. Dostêpne s¹ obecnie ró¿ne wariantywne sposoby przeprowadzania analizy mikrobiologicznej. W niniejszym opra- cowaniu przedstawiono uproszczenia i modyfikacje metod tradycyjnych oraz testy biochemiczne i immunologiczne do identyfikacji mikroorganizmów. Scharakteryzowano tak¿e metody instrumentalne wykorzystuj¹ce zjawiska fluorescencji i luminescencji oraz zmiany impedancji z uwzglêdnieniem mo¿liwoœci ich zastosowania w praktyce.

S³owa kluczowe: zatrucia pokarmowe, metody, identyfikacja, mikroorganizmy chorobo- twórcze.

Wstêp

Zapewnienie odpowiedniej jakoœci produktów ¿ywnoœciowych to po³¹czenie wielu cech, m.in. funkcji od¿ywczych, okreœlonych w³aœciwoœci sensorycznych, a tak¿e ich bezpieczeñstwo zdrowotne, postrzegane przez wiêkszoœæ konsumen- tów jako najwa¿niejsza kwestia w ocenie jakoœci ¿ywnoœci. Jednym z najistot- niejszych wyró¿ników jakoœci i bezpieczeñstwa zdrowotnego ¿ywnoœci jest jej stan mikrobiologiczny. Analiza ¿ywnoœci pod wzglêdem obecnoœci w niej mikro- organizmów saprofitycznych i chorobotwórczych stanowi jedno z podstawo- wych narzêdzi kontroli jakoœci produktów.

Wed³ug danych Œwiatowej Organizacji Zdrowia, jak równie¿ krajowych jed- nostek kontrolnych, najwiêkszym zagro¿eniem dla konsumentów jest mo¿liwoœæ

(2)

ska¿enia produktów spo¿ywczych przez niepo¿¹dane mikroorganizmy, w tym mikroflorê chorobotwórcz¹. Zatrucia pokarmowe stanowi¹ dominuj¹cy problem zdrowia publicznego zarówno w krajach uprzemys³owionych, jak i rozwijaj¹cych siê. W Stanach Zjednoczonych organizacja CDC (Centers for Disease Control and Prevention) odnotowa³a w 2010 roku 48 milionów zatruæ pokarmowych, z czego 128 tysiêcy przypadków wymaga³o hospitalizacji, a 3 tysi¹ce osób zmar³o. Jako g³ówn¹ przyczynê zachorowañ, ponad 5 milionów przypadków, podano norowirusy, natomiast kolejne spoœród piêciu dominuj¹cych drobno- ustrojów stanowi³y bakterie: Salmonella sp., Clostridium perfringes, Campylo- bacter jejuni i Staphylococcus aureus. Znamienny jest fakt, i¿ w niespe³na 10 mi- lionach przypadków wykryta jest przyczyna, a prawie 40 milionów wywo³ane jest przez czynnik nieokreœlony, w tym mikrobiologiczny, chemiczny lub inny [www.cdc.gov].

W Polsce dane Narodowego Instytutu Zdrowia Publicznego – Pañstwowego Zak³adu Higieny wskazuj¹, ¿e ka¿dego roku odnotowuje siê kilkanaœcie tysiêcy przypadków zatruæ pokarmowych i bakteryjnych zaka¿eñ jelitowych o zró¿nico- wanej etiologii (rysunek 1). G³ówn¹ przyczyn¹ zaka¿eñ jelitowych s¹ norowi- rusy i rotawirusy, natomiast wœród bakterii chorobotwórczych dominuje Salmo- nella i biegunkotwórcze szczepy Escherichia coli. Na podobnym poziomie odnotowuje siê zachorowania spowodowane bakteriami z rodzaju Yersinia, Cam- pylobacter i Staphylococcus. W oko³o 2–3 tysi¹cach przypadków Ÿród³o zanie- czyszczenia mikrobiologicznego ¿ywnoœci b¹dŸ zatrucia pokarmowego pozo- staje nieznane, czego przyczyn¹ s¹ m.in. problemy z odpowiednio szybkim wykrywaniem i prawid³ow¹ identyfikacj¹ mikroorganizmów chorobotwórczych.

Jest to o tyle wa¿ne, ¿e coraz czêœciej zwraca siê uwagê na potencjalne zagro¿e- nie ze strony patogenów, które do tej pory rzadko stanowi³y zagro¿enie na wiê- ksz¹ skalê, natomiast obecnie coraz czêœciej s¹ rozpoznawane jako przyczyna zatruæ pokarmowych i zaka¿eñ [Daskalov 2006; Adams i Moss 2008]. Dotyczy to mikroorganizmów takich, jak Campylobacter jejuni, Yersinia enterocolitica, enteropatogenne szczepy Escherichia coli, Plesiomonas shigelloides czy Aero- monas hydrophila. Szczególn¹ uwagê obecnie zwraca siê na drobnoustroje wy- kazuj¹ce zdolnoœæ do namna¿ania siê w warunkach ch³odniczych, poniewa¿ stanowi¹ one zagro¿enie pomimo zachowania ci¹g³oœci ³añcucha ch³odniczego.

Zmiany dotycz¹ce czêstotliwoœci i rodzaju zagro¿eñ mikrobiologicznych w ¿ywnoœci s¹ zwi¹zane zarówno z przemianami mikroorganizmów, jak i z funkcjonowaniem konsumentów. W populacjach drobnoustrojów zachodz¹ procesy prowadz¹ce do powstawania nowych szczepów, czêsto wykazuj¹cych odpornoœæ na antybiotyki, b¹dŸ te¿ szczepów silnie wirulentnych, b¹dŸ zdol- nych do prze¿ycia w ekstremalnie niesprzyjaj¹cych warunkach. Jednoczeœnie wiêksza mobilnoœæ ludzi, globalizacja handlu sprzyjaj¹ rozprzestrzenianiu siê mikroorganizmów, niejednokrotnie wprowadzaj¹c patogeny do œrodowisk,

(3)

w których wczeœniej nie wystêpowa³y. Czynniki, które dodatkowo sprzyjaj¹ pojawianiu siê nowych zagro¿eñ mikrobiologicznych, to zmiany w naszej populacji i stylu ¿ycia. Coraz wiêcej osób zmaga siê z problemami niedoboru odpornoœci, np. bêd¹c nosicielami wirusa HIV lub cierpi¹c na choroby prze- wlek³e, przez co staj¹ siê bardziej nara¿eni na infekcje. Równie¿ tendencje do zmiany upodobañ ¿ywieniowych i powszechne korzystanie z barów czy restau- racji mog¹ sprzyjaæ rozprzestrzenianiu nowych zagro¿eñ mikrobiologicznych.

W celu ograniczenia ryzyka zagro¿enia zdrowia konsumenta, niezbêdne jest ci¹g³e monitorowanie ¿ywnoœci, co wymaga stosowania odpowiednich metod ba- dawczych, umo¿liwiaj¹cych uzyskanie oceny potencjalnego zagro¿enia w sposób precyzyjny, a zarazem szybki. Tak¿e systemy zapewniania bezpieczeñstwa ¿ywno- œci, takie jak HACCP, wymagaj¹ szybkiej oceny jakoœci mikrobiologicznej, aby w mo¿liwie krótkim czasie podejmowaæ decyzje eliminuj¹ce zagro¿enie [Wawerla i in. 1999; K³ossowska i Malinowski 2001; £obacz, Kowalik i Ziajka 2008].

Metody stosowane do mikrobiologicznej oceny ¿ywnoœci mo¿na podzieliæ na dwie grupy w zale¿noœci od celu analizy. Pierwsza obejmuje metody iloœciowego

1 10 100 1000 10000

2008 2009 2010

Salmonella Shigella

Escherichia coli biegunkotwórcza Escherichia coli enterokrwotoczna

Campylobacter Yersinia

Staphylococcus Clostridium botulinum

Clostridium perfringens nieokreœlone zatrucia pokarmowe i zaka¿enia jelitowe

Rysunek 1. Liczba bakteryjnych zatruæ pokarmowych i zaka¿eñ jelitowych w latach 2008– 2010 w Polsce w odniesieniu do mikroorganizmów bêd¹cych najczêstsz¹ przyczyn¹

ród³o: Opracowanie w³asne na podstawie danych NIZP – PZH. W roku 2010 dane obejmuj¹ okres do 15.12.2010 roku

(4)

oznaczania mikroorganizmów, a druga – wykrywanie okreœlonych mikroorgani- zmów i ich toksycznych metabolitów. Iloœciowa analiza mikrobiologiczna od- zwierciedla ogólny stan badanej ¿ywnoœci, okreœlaj¹c, czy liczba obecnych w niej drobnoustrojów mieœci siê w dopuszczalnych granicach zawartych w nor- mach dla danego rodzaju produktu. Wykrywanie i identyfikacja okreœlonych mikroorganizmów ma na celu stwierdzenie b¹dŸ wykluczenie ich obecnoœci.

Kwalifikacja zagro¿eñ mikrobiologicznych wyró¿nia w tym wzglêdzie mikroorganizmy chorobotwórcze, których obecnoœæ zagra¿a bezpieczeñstwu zdrowotnemu konsumenta oraz mikroorganizmy wskaŸnikowe, odzwierciedlaj¹ce higienê pro- cesu technologicznego i wskazuj¹ce na trwa³oœæ i bezpieczeñstwo produktu.

W obu przypadkach zastosowanie znajduj¹ zarówno metody klasyczne, jak i nowoczesne szybkie testy.

1. Konwencjonalne metody mikrobiologiczne

Tradycyjne metody mikrobiologiczne polegaj¹ na posiewach badanych prób na odpowiednie po¿ywki oraz analizach mikro- i makroskopowych. Stosowane procedury s¹ wieloetapowe i d³ugotrwa³e. Posiew próbki ¿ywnoœci w celu oznaczenia liczby drobnoustrojów wymaga przygotowania serii rozcieñczeñ dziesiêt- nych, nastêpnie posiewów z poszczególnych rozcieñczeñ, inkubacji i liczenia wyros³ych kolonii. W zale¿noœci od kierunku badañ stosuje siê ró¿ne pod³o¿a mikrobiologiczne. W odczycie wyników powinien byæ uwzglêdniony limit ilo- œciowy wynosz¹cy 4 jtk/ml dla produktów p³ynnych lub 4 jtk/g produktu sta³ego.

Uzyskanie 1–3 kolonii na p³ytce pozwala jedynie szacunkowo stwierdziæ obec- noœæ okreœlonych drobnoustrojów w próbie [ISO 2007]. W sytuacji, kiedy spo- dziewana jest niewielka liczba drobnoustrojów, mo¿na j¹ wyznaczyæ na podstawie najbardziej prawdopodobnej liczby – NPL [Bell, Neaves i Williams 2005].

Z kolei detekcja i identyfikacja drobnoustrojów chorobotwórczych wymaga stosowania ró¿nych po¿ywek selektywnych, a dodatkowo – analizy cech morfolo- gicznych i fizjologicznych. Wi¹¿e siê to z wykonaniem testów biochemicznych, okreœleniem wymagañ pokarmowych, oceny makroskopowej i mikroskopowej.

Czêsto w celu wykrycia okreœlonego mikroorganizmu w ¿ywnoœci konieczne jest zastosowanie na wstêpie etapu przednamna¿ania, aby zwiêkszyæ liczbê komórek i u³atwiæ ich regeneracjê. Czas potrzebny na przeprowadzenie wiarygodnej detekcji i identyfikacji wynosi kilka dni (nawet do tygodnia), co w sytuacji potencjalnego zagro¿enia jest bardzo niekorzystne, poniewa¿ opóŸnia podjêcie odpowiedniej decyzji.

Metody klasyczne s¹ bardzo czu³e, pozwalaj¹ na wykrycie jednej komórki w 25 g próbki. Ich zalet¹ jest równie¿ stosunkowo niski koszt analizy. Do niew¹t- pliwych wad tych metod nale¿y zaliczyæ natomiast pracoch³onnoœæ i d³ugi czas

(5)

oczekiwania na wynik. Poza tym konieczne jest posiadanie w pe³ni wyposa¿o- nego laboratorium, podczas gdy dostêpne obecnie tzw. szybkie testy pozwalaj¹ ograniczyæ liczbê wymaganego sprzêtu. Nale¿y jednak pamiêtaæ, ¿e metody tradycyjne stanowi¹ wci¹¿ tzw. „z³oty standard” w diagnostyce mikrobiologicznej

¿ywnoœci i pomimo stosowania szybkich testów pozostaj¹ one zwykle alternatywne, a uzyskanie wyniku pozytywnego w badaniu wymaga potwierdzenia metod¹ klasyczn¹.

1.1. Uproszczenia i modyfikacje metod p³ytkowych

Ze wzglêdu na d³ugi czas trwania analizy, a tak¿e czasoch³onne i wieloetapowe przygotowania, laboratoria mikrobiologiczne chêtnie korzystaj¹ z ró¿nego rodzaju udogodnieñ i modyfikacji metod tradycyjnych. W ofercie wielu firm znajduj¹ siê miêdzy innymi p³ytki z wylanymi pod³o¿ami, gotowe po¿ywki w butelkach lub ma³ych fiolkach, które wystarczy tylko up³ynniæ przed posie- wem.

Szybsz¹ i ³atwiejsz¹ identyfikacjê drobnoustrojów umo¿liwiaj¹ po¿ywki zawieraj¹ce chromogenne lub fluorogenne komponenty. Mikroorganizmy wyposa-

¿one w odpowiedni system enzymatyczny metabolizuj¹ takie substraty, czego efektem jest widoczna go³ym okiem zmiana barwy lub fluorescencja, obserwo- wana w œwietle UV. Substraty takie pozwalaj¹ wyodrêbniæ poszukiwane grupy drobnoustrojów, które rosn¹ w postaci kolonii o okreœlonej barwie b¹dŸ powoduj¹ barwne lub fluorescencyjne zmiany pod³o¿a, co znacznie skraca czas analizy. Niektóre po¿ywki chromogenne s¹ uznawane przez normy, jak np. Agar Listeria wed³ug Ottaviani i Agosti (ALOA).

W zale¿noœci od kierunku analizy znaleŸæ mo¿na ró¿ne przydatne rozwi¹za- nia, np. do kontroli stanu higienicznego powierzchni oraz szybkiej analizy jako- œciowej produktów z powodzeniem wykorzystywane s¹ p³ytki kontaktowe. S¹ to plastikowe p³ytki, pokryte z obu stron po¿ywk¹, które wystarczy przy³o¿yæ do badanej powierzchni, a nastêpnie zamkn¹æ w opakowaniu i wstawiæ do inkubacji. Po inkubacji mo¿na zliczyæ wyros³e kolonie lub przyrównaæ do wzorca do-

³¹czonego przez producenta. Po¿ywki pokrywaj¹ce p³ytkê s¹ zró¿nicowane, umo¿liwiaj¹c tym samym poszerzenie zakresu analiz. Niektóre p³ytki s¹ pokryte z obu stron odmiennymi po¿ywkami, co pozwala na jednoczesne oznaczanie liczby np. bakterii i grzybów. Wa¿ne, aby po wykorzystaniu p³ytek kontakto- wych, pamiêtaæ o ich unieszkodliwieniu ze wzglêdu na namno¿one na ich powierzchni drobnoustroje. P³ytki tego typu mo¿na znaleŸæ w ofercie ró¿nych firm np. Hygicult lub Easicult firmy NOACK czy Rodac firmy Biocorp.

Do modyfikacji metody p³ytkowej nale¿y zaliczyæ p³ytki 3M™ Petrifilm™, które umo¿liwiaj¹ analizê iloœciow¹ i jakoœciow¹ ¿ywnoœci [Nero i in. 2008].

P³ytki 3M™ Petrifilm™ sk³adaj¹ siê z dwóch p³ytek, dolnej papierowej, powle-

(6)

czonej warstw¹ polietylenu i pokrytej po¿ywk¹ w postaci ¿elu tworz¹cego cienk¹ b³onkê, oraz górnej p³ytki, któr¹ stanowi przezroczysta folia. Posiew z u¿yciem testów 3M™ Petrifilm™ jest bardzo prosty. Przygotowan¹ próbkê lub odpowiednie jej rozcieñczenie nanosi siê w iloœci 1 ml na œrodek pod³o¿a, zamyka foli¹ i dociska specjalnym przyciskiem, co sprawia, ¿e próbka jest równomiernie roz- prowadzona na ca³ej powierzchni po¿ywki. Po¿ywki stosowane na p³ytkach 3M™ Petrifilm™ zawieraj¹ substancje wskaŸnikowe, które powoduj¹ wybar- wienie wyrastaj¹cych kolonii, co u³atwia ich liczenie. Dodatkowo niektóre rodzaje p³ytek pozwalaj¹ na rozró¿nienie poszczególnych grup drobnoustrojów, np. 3M™ Petrifilm™ E. coli s³u¿y do oznaczania bakterii z grupy coli i Escheri- chia coli w przetworach rolno-spo¿ywczych. Bakterie E. coli rosn¹ jako niebie- skie kolonie z pêcherzykiem powietrza dooko³a, podczas gdy pozosta³e bakterie rosn¹ w postaci kolonii czerwonych. Poszerzona obecnie oferta p³ytek 3M™

Petrifilm™ daje mo¿liwoœæ selektywnego wykrywania mikroorganizmów wskaŸ- nikowych, g³ównie z rodziny Enterobacteriaceae oraz niektórych drobnoustro- jów chorobotwórczych, takich jak Listeria czy Staphylococcus [Silva i in. 2005;

Nyachuba i Donnely 2007]. Nale¿y jednak wzi¹æ pod uwagê, ¿e okreœlone p³ytki pozwalaj¹ na wykrycie grupy drobnoustrojów nale¿¹cej do danego rodzaju, a nie poszczególne gatunki. Jedynie w przypadku Staphylococcus aureus mo¿liwe jest odró¿nienie go od gatunków towarzysz¹cych. Odczyt wyników mo¿na przepro- wadziæ manualnie lub korzystaj¹c z automatycznego czytnika, co przyspiesza i u³atwia ich opracowanie. Co wa¿ne, testy Petrifilm maj¹ walidacjê AFNOR, AOAC, NMKL, w zale¿noœci od rodzaju testu.

2. Testy biochemiczne

Ogromny postêp w zakresie identyfikacji gatunkowej drobnoustrojów dokona³ siê dziêki zast¹pieniu tradycyjnych systemów diagnostyki przez zminiaturyzo- wane testy biochemiczne, metody immunoenzymatyczne i serologiczne. W praktyce najwiêksze zastosowanie do szybkiej identyfikacji znalaz³y testy biochemiczne, które nie tylko skracaj¹ czas analizy, ale te¿ s¹ nieporównywalnie mniej pracoch³onne, a co równie wa¿ne, ograniczaj¹ zu¿ycie materia³ów. Nowoczesne testy biochemiczne maj¹ postaæ szeregu mikroprobówek zawieraj¹cych chromogenne substraty, do których nale¿y nanieœæ niewielk¹ iloœæ badanej hodowli. Po okreœlonym okresie inkubacji dokonuje siê oceny wyniku testu na podstawie barwnych reakcji zachodz¹cych pod wp³ywem rozwoju mikroorganizmu. Nie- które reakcje wymagaj¹ dodatkowo zastosowania okreœlonych odczynników bezpoœrednio przed odczytem rezultatu.

Metody te charakteryzuj¹ siê wysok¹, 95-procentow¹ czu³oœci¹. W testach wykorzystywana jest specyficznoœæ przemian ró¿nych Ÿróde³ wêgla oraz innych

(7)

szlaków metabolicznych mikroorganizmów. Reakcje s¹ dobrane tak, aby nie by³y zale¿ne od fazy wzrostu drobnoustrojów i wra¿liwe na wp³yw otoczenia. Jednak trzeba siê liczyæ z mo¿liwymi ograniczeniami, takimi jak zró¿nicowana aktyw- noœæ enzymów u poszczególnych szczepów z tego samego gatunku czy rodzaj pod³o¿a hodowlanego. Czu³oœæ reakcji mo¿e byæ ni¿sza, jeœli s¹ one katalizo- wane przez enzymy wewn¹trzkomórkowe [Zaremba i Borowski 1994].

W zale¿noœci od producenta i rodzaju testu liczba reakcji umo¿liwiaj¹cych prawid³ow¹ identyfikacjê wynosi od kilku, w przypadku tzw. testów przesiewo- wych, do kilkunastu lub kilkudziesiêciu (zwykle oko³o 24). Niektóre testy pozwalaj¹ na odczyt wyników ju¿ po 4 godzinach, choæ najczêœciej pe³en okres inkubacji wynosi 18–24 lub nawet 48 godzin. Najbardziej znanymi testami bio- chemicznymi s¹ testy API oferowane przez firmê bioMérieux, ale obecnie zna- leŸæ mo¿na szerok¹ ofertê tak¿e innych producentów, np. ERBA Lachema.

3. Techniki fluorescencyjne i luminescencyjne

Techniki wykorzystuj¹ce zjawisko fluorescencji i luminescencji stosowane s¹ w badaniach mikroflory œrodowiskowej i ocenie stanu higienicznego powierzchni lub urz¹dzeñ. Metody te znajduj¹ równie¿ zastosowanie w analizie ¿ywno- œci. ¯ywnoœæ stanowi jednak bardzo z³o¿on¹ matrycê do badañ, dlatego wci¹¿

opracowuje siê procedury przygotowania próbek do analizy tak, by odzwiercie- dla³y one faktyczny stan mikrobiologiczny produktu [Mikš i Warmiñska-Radyko 2008].

Techniki fluorescencyjne pozwalaj¹ na oznaczenie ró¿nych parametrów fizycznych i biochemicznych, obrazuj¹c fizjologiczne zró¿nicowanie komórek drobnoustrojów [Ben Amor, Vaughon i de Vos 2007]. Jest to o tyle istotne, ¿e, jak wykaza³y badania, wyró¿nia siê co najmniej cztery grupy komórek (rysunek 2) w zale¿noœci od ich stanu fizjologicznego [Decker 2001].

Komórki ¿ywe mog¹ byæ aktywne metabolicznie i zdolne do wzrostu na pod³o¿ach syntetycznych, ale mog¹ te¿ przechodziæ w tzw. stan odwracalnej ana- biozy i pomimo zachowanej aktywnoœci metabolicznej, nie wzrastaæ na pod³o¿ach bez uprzedniej resuscytacji. Komórki takie okreœla siê jako ¿ywe, ale niezdolne do wzrostu – VBNC (ang. viable but not culturable). Dotyczy to w szczególnoœci mikroorganizmów w produktach poddanych ró¿nym procesom technologicznym, jak na przyk³ad pasteryzacja. Przeprowadzone badania wskazuj¹, ¿e formy takie tworz¹ mikroorganizmy patogenne, na przyk³ad Campylobacter [Gunase- kera i in. 2002]. Z kolei komórki martwe dziel¹ siê na takie, w których zacho- wana jest ci¹g³oœæ b³ony cytoplazmatycznej i komórki z b³on¹ uszkodzon¹, po lizie. Obecnoœæ tak zró¿nicowanych form mo¿e utrudniaæ prawid³ow¹ i wiary- godn¹ ocenê badanego produktu metodami p³ytkowymi, dlatego poszukuje siê

(8)

metod, które w sposób bardziej precyzyjny okreœli³yby ryzyko obecnoœci mikroor- ganizmów niepo¿¹danych i liczebnoœæ mikroflory w ¿ywnoœci. Techniki fluorescencyjne umo¿liwiaj¹ m.in. badanie ci¹g³oœci b³ony komórkowej, aktywnoœci enzymów wewn¹trzkomórkowych oraz ustalenie liczebnoœci komórek poprzez zwi¹zanie barwnika z DNA komórki [McFeters i in. 1995; Baatout, De Boever i Margeay 2006]. W metodach tych stosuje siê specyficzne barwniki fluorescencyjne zwane fluoroforami, które selektywnie absorbuj¹ i emituj¹ œwiat³o o okre- œlonej d³ugoœci fali. Po wnikniêciu do komórki nastêpuje emisja œwiat³a, którego barwa zale¿y od w³aœciwoœci fluoroforu. Na przyk³ad, fluoresceina emituje œwiat³o zielone, a DAPI (diamidino-2-fenyloindol) – niebieskie. Ró¿nice w prze- nikalnoœci barwników przez b³onê cytoplazmatyczn¹ w zale¿noœci od jej stanu da³y podstawê opracowania szybkiej metody oznaczania komórek ¿ywych i mar- twych z zastosowaniem zestawów barwników fluorescencyjnych o zró¿nicowa- nej przenikalnoœci przez b³ony. Przyk³adem jest zestaw LIVE/DEAD® BacLi- ghtTM Bacterial Viability Kit (Molecular Probes Inc) zawieraj¹cy barwniki SYTO®9 i IP. Barwnik SYTO®9 charakteryzuje siê nisk¹ mas¹ cz¹steczkow¹, poni¿ej 10 Da, i zdolnoœci¹ do penetrowania nieuszkodzonej b³ony, podczas gdy IP ma masê 688 Da i mo¿e wnikaæ do komórki tylko przez uszkodzenia w b³onie.

W rezultacie mo¿liwa jest obserwacja ró¿nic w zabarwieniu komórek w zale¿no- œci od stanu b³ony cytoplazmatycznej [Haugland 2005, Moreno i in. 2006].

Metoda ta okaza³a siê przydatna m.in. do oznaczania liczby bakterii VBNC w mleku po pasteryzacji [Gunasekera i in. 2002], do badania jakoœci prepara- tów probiotycznych i oznaczania liczby ró¿nych gatunków bakterii z rodzaju Lactobacillus [Maukonen i in. 2006] czy do badania prze¿ywalnoœci bakterii

Komórki martwe przed liz¹ b³ony cytoplazmatyczn¹ Spójnoœæ b³ony

cytoplazmatycznej

Brak ci¹g³oœci b³ony cytoplazmatycznej

Komórki martwe z b³on¹ cytoplazmatyczn¹ po lizie

Niewykazuj¹ce aktywnoœci metabolicznej

Wykazuj¹ce aktywnoœæ metaboliczn¹ Komórki ¿ywe niezdolne

do wzrostu na po¿ywkach syntetycznych (VBNC) Komórki ¿ywe zdolne do wzrostu

na po¿ywkach syntetycznych

Rysunek 2. Podzia³ komórek w zale¿noœci od ich stanu fizjologicznego

ród³o: Opracowanie w³asne na podstawie: [Decker 2001; Mikš i Warmiñska-Radyko 2008]

(9)

Lactobacillus, Streptococcus i Bifidobacterium podczas przechowywania fer- mentowanych napojów mlecznych [Moreno i in. 2006]. Badania wykaza³y, ¿e w porównaniu do tradycyjnej metody p³ytkowej uzyskuje siê o 0,7 log wiêksz¹ liczbê komórek ¿ywych, co dowodzi obecnoœci w badanej populacji komórek

¿ywych lecz niezdolnych do wzrostu na pod³o¿u [Moreno i in. 2006].

W celu identyfikacji drobnoustrojów i oznaczania ich liczby przydatna jest metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH – ang. fluorescence in situ hybridisation). Jest ona stosowana g³ównie do badania ró¿norodnoœci œrodowisk naturalnych, jak równie¿ wykorzystywana w histopatologii, histoimmunologii i cytogenetyce [Skowroñska i Zmys³owska 2006; Zwirglmaier 2005]. Zastoso- wanie tej metody w badaniach ¿ywnoœci jest jeszcze ograniczone [Blasco, Ferrer i Pardo 2003; Ootsubo i in. 2003; Mikš i Warmiñska-Radyko 2008]. Metoda FISH ma na celu wykrycie okreœlonej sekwencji DNA w badanym materiale za pomoc¹ znakowanej fluorescencyjnie sondy oligonukleotydowej. Sondy molekularne s¹ komplementarne do rRNA w rybosomach komórek docelowych, poniewa¿ rRNA jest integraln¹ czêœci¹ rybosomów i wystêpuje w komórce w du¿ej liczbie kopii (1000 – 10 000), co zwiêksza czu³oœæ oznaczenia [Skowroñ- ska i Zmys³owska 2006, Trojanowska i in. 2003]. Wyró¿nia siê kilka rodzajów sond: uniwersalne, specyficzne dla domeny Bacteria z wyj¹tkiem rzêdu Plancto- mycetales, nonsensowne, niewi¹¿¹ce prokariotycznego RNA i specyficzne dla danej grupy mikroorganizmów [Skowroñska i Zmys³owska 2006]. Stosuj¹c sondy oligonukleotydowe 16S rRNA, oznacza siê tylko komórki aktywne fizjo- logicznie, poniewa¿ okres pó³trwania RNA jest krótszy ni¿ DNA. Komórki szybko rosn¹ce zawieraj¹ du¿¹ liczbê kopii rRNA wystarczaj¹c¹ do indukcji sygna³u œwietlnego po zwi¹zaniu sondy, podczas gdy liczba rybosomów w ko- mórkach nieaktywnych metabolicznie jest zbyt ma³a, by wyemitowaæ wyraŸny sygna³ [Amann, Glocker i Neef 1997; Zwirglmaier 2005]. Obecnie istniej¹ ró¿ne modyfikacje metody FISH w zale¿noœci od celu badañ. Gdy liczba rybosomów w próbce jest zbyt ma³a, przydatna jest odmiana CARD-FISH (ang. catalysed reported deposition – FISH), w której sygna³ zostaje wzmocniony poprzez zasto- sowanie peroksydazy chrzanowej i tyramidu [Wagner, Horn i Daims 2003].

Metodê FISH mo¿na zatem wykorzystaæ do oznaczania liczby bakterii, ich identyfikacji, a tak¿e do oznaczania ich stanu fizjologicznego [Mikš i Warmiñ- ska-Radyko 2008]. Technikê tê zastosowano m.in. do wykrywania bakterii Sal- monella i Listeria monocytogenes w mleku [Oliveira i in. 2004].

Alternatyw¹ do fluorescencyjnego wykrywania hybrydy powsta³ej w wyniku po³¹czenia sondy molekularnej z sekwencj¹ komplementarn¹ jest zastosowanie luminescencji. W metodzie tej sonda oligonukleotydowa jest znakowana chemi- luminescencyjnie, dziêki czemu po hybrydyzacji emitowane s¹ kwanty œwiat³a mierzone za pomoc¹ luminometru i wynik jest wyra¿ony w jednostkach RLU (ang. relative light unit – wzglêdne jednostki œwietlne). Aparaty przeznaczone do

(10)

takiej analizy maj¹ zwykle ustawione wartoœci odciêcia (cut-off) bêd¹ce warto- œci¹ graniczn¹, powy¿ej której wynik uznaje siê za pozytywny. Przyk³adem za- stosowania tej metody jest wykrywanie bakterii Listeria monocytogenes testem identyfikacyjnym AccuProbe [Duvall i in. 2006].

4. Pomiar impedancji

Impedancjê mo¿na okreœliæ jako opornoœæ w stosunku do przep³ywaj¹cego pr¹du zmiennego, jak¹ stawia przewodz¹ce pod³o¿e. Pocz¹tki wykorzystania impedy- metrii w mikrobiologii siêgaj¹ koñca XIX wieku, kiedy to w Edynburgu Stewart przedstawi³ pracê wykazuj¹c¹ zachodzenie zmian w sk³adzie molekularnym i przewodnoœci elektrycznej po¿ywki w wyniku rozwoju mikroorganizmów. Jed- nak dopiero w latach 70. ubieg³ego wieku nast¹pi³ intensywny rozwój badañ nad t¹ metod¹. W Stanach Zjednoczonych równolegle opracowano dwa systemy wykorzystuj¹ce pomiar impedancji – Malthus (Malthus Instruments Ltd.) i Bac- tometer (bioMérieux) [Vasavada 1992]. Dziœ takich urz¹dzeñ jest wiêcej, m.in.

RABIT (Rapid Automated Bacterial Impedance Technique, Don Whitley Scienti- fic Ltd.) czy BacTrac (Sy-Lab) [Wawerla i in. 1999].

Idea metody opiera siê na monitorowaniu zmian opornoœci lub konduktancji (przewodnoœci) zachodz¹cych w œrodowisku hodowlanym wskutek rozwoju mikro- organizmów. Wielkocz¹steczkowe zwi¹zki, takie jak bia³ka, wêglowodany czy lipidy, charakteryzuj¹ce siê brakiem ³adunku lub s³abo zjonizowane, s¹ rozk³adane przez drobnoustroje do na³adowanych metabolitów o ma³ej masie cz¹steczkowej jak aminokwasy czy kwasy organiczne. Rezultatem tych zmian jest spadek ca³kowitej impedancji przy jednoczesnym wzroœcie konduktancji. Pomiar zmian impedancji lub konduktancji mo¿e zatem s³u¿yæ jako narzêdzie do wykrywania obecnoœci mikroorganizmów b¹dŸ ich aktywnoœci metabolicznej w badanym œrodowisku.

Liczba drobnoustrojów okreœlana jest na podstawie pomiaru czasu detekcji, który jest odwrotnie skorelowany z liczb¹ mikroorganizmów. Mo¿liwe jest tak¿e wykrywanie drobnoustrojów chorobotwórczych, jeœli zastosuje siê odpowiednie, selek- tywne pod³o¿a opracowane dla mikrobiologii impedymetrycznej [Trojanowska i in.

2003; £obacz, Kowalik i Ziajka 2008]. Dla przyk³adu Glassmoyer i Russel [2001]

opracowali po¿ywkê z dodatkiem akryflawiny i kwasu nalidyksynowego do wykry- wania bakterii Staphylococcus aureus, a Cappel, Kirby i Moss [1995] opisali pod³o-

¿e do iloœciowego oznaczania bakterii Listeria monocytogenes.

Metoda impedymetryczna ma zastosowanie do oszacowania ogólnego stanu mikrobiologicznego produktu, iloœciowej analizy okreœlonych grup drobnoustro- jów jak np. bakterii z rodziny Enterobacteriaceae czy te¿ wyznaczania czasu przydatnoœci produktów spo¿ywczych [Vasavada 1992; Wawerla i in. 1999;

Kowalik i Ziajka 2005]. Dane literaturowe wskazuj¹ na mo¿liwoœæ wykorzysta-

(11)

nia tej metody do detekcji Escherichia coli, Listeria monocytogenes czy Clostri- dium perfringens [Wawerla i in. 1999; Moldenhauer 2003; Kowalik i Ziajka 2005]. Warto podkreœliæ, ¿e organizacja AOAC International (Association of Official Analytical Chemists International) uzna³a metodê impedymetryczn¹ za jedn¹ z metod wykrywania bakterii Salmonella w ¿ywnoœci [Wawerla i in. 1999].

Zastosowanie metody impedymetrycznej w rutynowej kontroli ¿ywnoœci wymaga optymalizacji i koniecznoœæ kalibracji, a zatem na etapie pocz¹tkowym wi¹¿e siê z du¿ym nak³adem pracy. Jednak odpowiednio skalibrowana metoda stanowi przydatne, wariantywne narzêdzie do oceny jakoœci mikrobiologicznej

¿ywnoœci pozwalaj¹ce na oszczêdnoœæ czasu i ograniczenie kosztów w stosunku do metod tradycyjnych.

5. Metody immunologiczne

Zastosowanie metod immunologicznych w celu detekcji i identyfikacji drobno- ustrojów opiera siê na wysoce specyficznym wi¹zaniu przeciwcia³ z antygenami.

Reakcja zachodzi pomiêdzy przeciwcia³ami a ca³ymi komórkami, antygenami powierzchniowymi lub zewn¹trzkomórkowymi toksynami. Specyficznoœæ ozna- czeñ immunologicznych zale¿y od specyficznoœci zastosowanego przeciwcia³a.

Mog¹ to byæ przeciwcia³a monoklonalne, poliklonalne lub rekombinowane.

W celu uwidocznienia reakcji stosowane s¹ znaczniki przeciwcia³, m.in. fluorescencyjne lub enzymatyczne. Wœród opracowanych dot¹d ró¿nych technik immunologicznych do wykrywania drobnoustrojów b¹dŸ ich toksyn najczêœciej stosowany jest test immunoenzymatyczny ELISA (ang. enzyme linked immuno- sorbent assay) opisany szczegó³owo w artykule Jasnowskiej-Ma³eckiej pt: Biolo- giczne metody wykrywania alergenów w ¿ywnoœci.

W testach ELISA produkt reakcji enzymatycznej jest barwny, a natê¿enie barwy zale¿y do stê¿enia poszukiwanego antygenu i mo¿e byæ mierzone za pomoc¹ spektrofotometru. Limit detekcji w przypadku metod immunologicznych wynosi 10⁴–10⁵jtk/ml w zale¿noœci od typu przeciwcia³a i jego powino- wactwa do odpowiedniego epitopu na powierzchni antygenu [Jasson i in. 2010].

Przeciwcia³a poliklonalne ³atwiej otrzymaæ i ich stosowanie jest tañsze, jednak ograniczeniem jest specyficznoœæ wzglêdem oznaczanego antygenu. Mog¹ one bowiem wi¹zaæ ró¿ne antygeny, zmniejszaj¹c tym samym pewnoœæ identyfikacji okreœlonego drobnoustroju. Przeciwcia³a monoklonalne wykazuj¹ powinowac- two wzglêdem pojedynczego antygenu, co zwiêksza specyficznoœæ metody.

Wad¹ tego typu przeciwcia³ jest natomiast wysoki koszt ich pozyskiwania, co automatycznie podnosi koszt analizy z ich u¿yciem. Alternatyw¹ jest stosowanie przeciwcia³ rekombinowanych, produkowanych z wykorzystaniem m.in. bakteryjnych systemów ekspresji.

(12)

Dane literaturowe wskazuj¹ na mo¿liwoœæ zastosowania zarówno poli- jak i monoklonalnych przeciwcia³ w celu detekcji mikroorganizmów patogennych.

Przeciwcia³a poliklonalne zastosowano m.in. do wykrywania bakterii Listeria monocytogenes [Feldsine i in. 1997; Jung, Frank i Brackett 2003] czy Campylo- bacter [Hochel i in. 2007]. Natomiast przeciwcia³a monoklonalne by³y podstaw¹ wykrycia bakterii, takich jak Listeria monocytogenes i Listeria innocua [Solve, Boel i Norrung 2000], Salmonella enterica [Schneid i in. 2005], Salmonella typhi [Kumar i in. 2003], Escherichia coli O157 [Zhao i Liu 2005] czy Shigella [War- ren, Parish i Schneider 2006]. Stosowano je równie¿ do wykrywania toksyn bakteryjnych lub grzybowych jak np. enterotoksyna gronkowcowa [Deckenback, Young i White 2002] czy zearalenon – mikotoksyna wytwarzana przez grzyby z rodzaju Fusarium [Kawamura i Emoto 2006].

Zalet¹ testów immunoenzymatycznych jest nie tylko specyficznoœæ oznaczenia, ale i krótki czas potrzebny na przeprowadzenie badania, który wynosi 2–3 godzin. Obecnie wiele testów ELISA jest dostêpnych w postaci zautomatyzowa- nych systemów, co pozwala na ograniczenie prac manualnych i zwiêkszenie powtarzalnoœci metody oraz standaryzacjê poszczególnych etapów oznaczenia.

Przyk³adem takiego urz¹dzenia jest system VIDAS oferowany przez firmê bio- Mérieux. W przypadku tego typu badania uzyskanie wyniku pozytywnego zwykle nie wymaga potwierdzenia metodami hodowlanymi.

Zakoñczenie

W ostatnich latach obserwuje siê ogromny postêp w rozwoju nowoczesnych metod detekcji i identyfikacji mikroorganizmów chorobotwórczych. Wiêkszoœæ tzw. szybkich testów wci¹¿ stanowi narzêdzie alternatywne. Stosowane s¹ one w celu szybkiego uzyskania odpowiedzi co do potencjalnego zagro¿enia, jednak wynik pozytywny wymaga potwierdzenia metodami referencyjnymi. Jak dot¹d w wiêkszoœci norm dotycz¹cych mikrobiologicznej jakoœci ró¿nego rodzaju pro- duktów spo¿ywczych wymagane jest stosowanie klasycznych metod hodowla- nych.

Oprócz omówionych w niniejszej pracy szybkich testów do wykrywania drobnoustrojów ogromne zastosowanie maj¹ metody molekularne oparte na analizie materia³u genetycznego mikroorganizmów, w tym ró¿ne odmiany reakcji PCR i sondy molekularne. Pomimo dok³adnoœci oznaczenia i krótkiego czasu analizy g³ównym powodem, który ogranicza powszechne wykorzystanie tych metod, s¹ wysokie koszty analizy i koniecznoœæ ich wykonywania przez osoby posiadaj¹ce du¿¹ wiedzê z zakresu biologii molekularnej. Wielkie nadzieje wi¹¿e siê z biosensorami i mikromacierzami, uznawanymi za techno- logiê przysz³oœci. Biosensory wykorzystuj¹ biologiczne cz¹steczki – fragmenty

(13)

kwasów nukleinowych, enzymy czy te¿ przeciwcia³a, które wychwytuj¹ reagu- j¹ce z nimi cz¹steczki na zasadzie biospecyficznej interakcji, np. przeciwcia³o/

antygen, kwas nukleinowy/komplementarna sekwencja, enzym/substrat. Re- zultatem jest sygna³, trafiaj¹cy do przetwornika, którym mo¿e byæ elektroda, w³ókna optyczne, kryszta³y piezoelektryczne. W zale¿noœci od metody trans- dukcji sygna³u, wyró¿nia siê biosensory: elektrochemiczne, optyczne, termo- metryczne, piezoelektryczne i magnetyczne [Velasco-Garcia i Mottram 2003].

Z kolei mikromacierze DNA maj¹ postaæ p³ytki z osadzonymi na niej sondami molekularnymi, odpowiednio wyznakowanymi, które wi¹¿¹ siê z komplemen- tarnymi fragmentami DNA. Ze wzglêdu na du¿¹ liczbê reakcji zachodz¹cych na p³ytce do analizy danych niezbêdne s¹ specjalne programy informatyczne [Karczmarczyk i Bartoszcze 2006].

Wa¿n¹ grupê metod detekcji drobnoustrojów stanowi¹ równie¿ metody instrumentalne opieraj¹ce siê na identyfikacji drobnoustrojów na podstawie analizy sk³adu okreœlonych biomarkerów, m.in. bia³ek komórkowych lub kwasów t³uszczowych. Zwykle w tym celu stosowane s¹ techniki chromatograficzne i spektrometria mas. Metody te daj¹ mo¿liwoœæ otrzymania pewnego profilu badanych zwi¹zków charakterystycznego dla danego gatunku lub szczepu na zasadzie „odcisku palca”. Niezbêdne jest jednak tworzenie odpowiednich baz danych, w których mo¿liwe bêdzie porównanie badanego profilu z wzorcem oraz dysponowanie w³aœciw¹ aparatur¹. Pomimo du¿ego zainteresowania, metody te nie znalaz³y jeszcze szerszego zastosowania w badaniach ¿ywnoœci, najczêœciej s¹ wykorzystywane w mikrobiologii œrodowiskowej [Pendergrass i Jansen 1997;

Jungblut 2001; Jones i in. 2004].

Bibliografia

Adams, M.R., Moss, M.O., 2008, Food Microbiology, RCS Publishing, Cambridge, UK, s. 182–184.

Amann, R., Glocker, F.-O., Neef, A., 1997, Modern Methods in Subsurface Microbiol- ogy: in situ Identification of Microorganisms with Nucleic Acid Probes, FEMS Microbiology Reviews, vol. 20, s. 191–200.

Baatout, S., De Boever, P., Mergeay, M., 2006, Physiological Changes Induced in Four Bacterial Strains Following Oxidative Stress, Applied Biochemistry and Microbiol- ogy, vol. 42, s. 369–377.

Bell, C., Neaves, P., Williams, A.P., 2005, Food Microbiology and Laboratory Practice, Blackwell Publishing, Iowa, USA.

Ben Amor, K., Vaughan, E.E., de Vos, W.M., 2007, Advanced Molecular Tools for the Identification of Lactic Acid Bacteria, The Journal of Nutrition, vol. 137, s. 741–750.

(14)

Blasco, L., Ferrer, S., Pardo, I., 2003, Development of Specific Fluorescent Oligon- ucleotide Probes for in situ Identification of Wine Lactic Acid Bacteria, FEMS Microbiology Letters, vol. 225, s. 115–123.

Capell, C.J., Kirby, R.M., Moss, M.O., 1995, A Method and Medium for the Electrical Detection of LISTERIA spp. From Food, International Journal of Food Microbiology, vol. 25, s. 169–177.

Daskalov, H., 2006, The Importance of Aeromonas Hydrophila in Food Safety, Food Control, vol. 17, s. 474–483.

Deckenback, J., Young, C.C., White, J.A., 2002, A Sensitive Method for the Detection and Differentiation of Staphylococcus Aureus Enterotoxins in an Automated, Electro- chemiluminescent – Based Format, Abstracts of the General Meeting of the Ameri- can Society for Microbiology, vol. 102, s. 368.

Decker, E.M., 2001, The Ability of Direct Fluorescence-based, Two-colour Assays to Detect Different Physiological States of Oral Streptococci, Letters in Applied Micro- biology, vol. 33, s. 188–192.

Duvall, R.E., Eklund, M., Tran, T.T., Hitchins, A.D., 2006, Improved DNA Probe Detec- tion of Listeria Monocytogenes in Enrichment Culture After Physical-Chemical Fractionation, Journal of AOAC International, vol. 89, s. 172–179.

Feldsine, P.T., Lienau, A.H., Forgey, R.L., Calhoon, R.D., 1997, Assurance Polyclonal Enzyme Immunoassay for Detection of Listeria Monocytogenes and Related Listeria Species in Selected Foods: Collaborative Study, Journal of AOAC International, vol.

80, s. 775–790.

Glassmoyer, K.E., Russell, S.M., 2001, Evaluation of a Selective Broth for Detection of Staphylococcus Aureus Using Impedance Microbiology, Journal of Food Protection, vol. 64, s. 44–50.

Gunasekera, T.S., Sørensen, A., Attfield, P.V., Sørensen, S.J., Veal, D.A., 2002, Inducible Gene Expression by Nonculturable Bacteria in Milk after Pasteurization, Applied and Environmental Microbiology, vol. 68, s. 1988–1993.

Haugland, R.P., 2005, The Handbook: a Guide to Fluorescent Probes and Labeling Tech- nologies, Invitrogen Corp, Karlsbad, CA, USA, s. 704–732.

Hochel, I., Slavickova, D., Viochna, D., Skvor, J., Steinhauserova, I., 2007, Detection of Campylobacter Species in Foods by Indirect Competitive ELISA Using Hen and Rab- bit Antibodies, Food and Agricultural Immunology, vol. 18, s. 151–167.

International Standards Organization, ISO 7218:2007, Microbiology of Food and Ani- mal Feeding Stuff – General Requirements of Guidance for Microbiological Exami- nation.

Jasson, V., Jacxsens, L., Luning P., Rajkovic A., Uyttendaele, M., 2010, Alternative Microbial Methods: an Overview and Selection Criteria, Food Microbiology, vol. 27, s. 710–730.

Jones, J.J., Stump, M.J., Fleming, R.C., Lay, J.O., Wilkins, C.L., 2004, Strategies and Data Analysis Techniques for Lipid and Phospholipid Chemistry Elucidation by Intact cell MALDI-FTMS, Journal of The American Society for Mass Spectrometry, vol. 15, s. 1665–1674.

(15)

Jung, Y.S., Frank, J.F., Brackett, R.E., 2003, Evaluation of Antibodies for Immunomag- netic Separation Combined with flow Cytometry Detection of Listeria Monocytoge- nes, Journal of Food Protection, vol. 66, s. 1283–1287.

Jungblut, P.R., 2001, Proteome Analysis of Bacterial Pathogens, Microbes Infections, vol. 3, s. 831–840.

Karczmarczyk, M., Bartoszcze, M., 2006, Mikromacierze DNA – nowe narzedzie w wy- krywaniu czynników biologicznych, Przeglad Epidemiologiczny, nr 60, s. 803– 811.

Kawamura, O., Emoto, A., 2006, Production of Monoclonal Antibodies Against Zearale- none, Technical Bulletin of Faculty of Agriculture, Kagawa University, vol. 58, s. 7–

11.

K³ossowska, A., Malinowski, E., 2001, Drobnoustroje patogenne dla cz³owieka w mleku zbiorczym, Medycyna Weterynaryjna, nr 57, s. 28–31.

Kowalik, J., Ziajka, S., 2005, Ocena wzrostu Listeria monocytogenes w mleku na podsta- wie programu PMP70 oraz badañ w³asnych, Medycyna Weterynaryjna, nr 61, s. 940–942.

Kumar, R., Surendran, P.K., Thampuran, N., 2008, Evaluation of Culture, ELISA and PCR Assays for the Detection of Salmonella in Seafood, Letters in Applied Microbi- ology, vol. 46, s. 221–226.

Kumar, S., Balakrishna, K., Tuteja, U., Batra, H.V., 2003, Application of Monoclonal Antibodies to Flagellin of Salmonella Typhi for its Rapid Detection in Foods, Indian Journal of Microbiology, vol. 43, s. 193–197.

£obacz, A., Kowalik, J., Ziajka, S., 2008, Wykorzystanie zjawiska impedancji w mikro- biologii i higienie ¿ywnoœci, Medycyna Weterynaryjna, nr 64, s. 966–968.

Maukonen, J., Alakomi, H.L., Nohynek, L., Hallamaa, K., Leppämäki, S., Mättö, J., Saarela, M., 2006, Suitability of the Fluorescent Techniques for the Enumeration of Probiotic Bacteria in Commercial Non-dairy Drinks and in Pharmaceutical Prod- ucts, Food Research International, vol. 39, s. 22–32.

McFeters, G.A., Yu, F.P., Pyle, B.H., Stewart, P.S., 1995, Physiological Assessment of Bacteria Using Fluorochromes, Journal of Microbiological Methods, vol. 21, s. 1–

13.

Mikš M.H., Warmiñska-Radyko I., 2008, Wybrane techniki fluorescencyjne w badaniach stanu fizjologicznego i prze¿ywania komórek bakteryjnych w ¿ywnoœci, Medycyna Weterynaryjna, nr 64, s. 623–627.

Moldenhauer, J., 2003, Use of Impedance Methods in Pharmaceutical Methods, A News Letter for the Rapid Micro Users Group, vol. 3, s. 33–35.

Moreno, Y., Collado, M.C., Ferrus, M. A., Cobo, J. M., Hernandez, E., Hernandez, M., 2006, Viability Assessment of Lactic Acid Bacteria in Commercial Dairy Products Stored at 4°C Using LIVE/DEAD® BacLightTM Staining and Conventional Plate Counts, International Journal of Food Science and Technology, vol. 41, s. 275–280.

Nero, L.A., Rodrigues, L.D., Vicosa, G.N., Ortolani, M.B.T., 2008, Performance of Petrifilm Aerobic Count Plates on Enumeration of Lactic Acid Bacteria in Fermented Milks, Journal of Rapid Methods and Automation in Microbiology, vol. 16, s. 132–

139.

(16)

Nyachuba, D.G., Donnely, C.W., 2007, Comparison of 3M (TM) Petrifilm (TM) Environ- mental Listeria Plates Against Standard Enrichment Methods for the Detection of Listeria Monocytogenes of Epidemiological Significance from Environmental sur- face, Journal of Food Science, vol. 72, s. M346–M354.

Oliveira, M., Blasco, L., Ferrer, S., Bernardo, F., 2004, Rapid and Simultaneous Dete- ctionof Salmonella spp. and Listeria monocytogenes in milk by Fluorescent in situ Hybridisation, Revista Portuguesa de Ciências Veterinárias, vol. 99, s. 215–218.

Ootsubo, M., Shimizu, T., Tanaka, R., Sawabe, T., Tajima, K., Ezura, Y., 2003, Seven- -hour Fluorescence in situ Hybridization Technique for Enumeration of Entero- bacteriaceae in Food and Environmental Water Sample, Journal of Applied Microbi- ology, vol. 95, s. 1182–1190.

Pendergrass, S.M., Jensen, P.A., 1997, Application of the Gas Chromatography-fatty Acid Methyl Ester System for the Identyfication of Environmental and Clinical Iso- lates of the family Micrococcaceae, Applied Occupational and Environmental Hygie- ne, vol. 12, s. 543–546.

Schneid, A.D., Ludtke, C.B., Diel, C., Aleixo, J.A.G., 2005, Production and Caracte- rization of Monoclonal Antibodies for the Detection of Salmonella Enterica in Chicken Meat, Brazilian Journal of Microbiology, vol. 36, s. 163–169.

Silva, B.O., Caraviello, D.Z., Rodriguez, A.C., Ruegg, P.I., 2005, Evaluation of Petrifilm for the Isolation of Staphylococcus aureus from Milk Samples, Journal of Dairy Scie- nce, vol. 88, s. 3000–3008.

Skowroñska, A., Zmys³owska, I., 2006, Wspó³czesne metody identyfikacji bakterii stosowane w ekologii mikroorganizmów wodnych – fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (FISH), Postêpy Mikrobiologii, nr 45, s. 183–193.

Solve, M., Boel, J., Norrung, B., 2000, Evaluation of a Monoclonal Antibody Able to Detect Live Listeria monocytogenes and Listeria innocua, International Journal of Food Microbiology, vol. 57, s. 219–224.

Trojanowska, K., Baumgart, J., Libudzisz, Z., Czaczyk K., O³tuszak E., Polak, J., Szczêsna M., Tomczak, E., Wiewiórowska, M., Sip, A., Walkowiak-Tomczak, D., 2003, Zastosowanie szybkich metod mikrobiologicznych i sond genetycznych w ana- lizie ¿ywnoœci, w: Jankiewicz, M., Kêdzior, J. (red.), Metody pomiarów i kontroli ja- koœci w przemyœle spo¿ywczym i biotechnologii, Wydawnictwo Akademii Rolniczej im. Augusta Cieszkowskiego w Poznaniu, Poznañ, s. 325–407.

Vasavada, P.C., 1992, Rapid Methods and Automation in Dairy Microbiology, Journal of Dairy Science, vol. 76, s. 3101–3113.

Velasco-Garcia, M.N., Mottram, T., 2003, Biosensor technology addressing agricultural problems, Biosystems Engineering, vol. 84, s. 1–12.

Wagner, M., Horn, M., Daims, H., 2003, Fluorescence in situ Hybridization for the Iden- tification and Characterization of Prokaryotes, Current Opinion in Microbiology, vol. 6, s. 302–309.

Warren, B.R., Parish, M.E., Schneider, K.R., 2006, Shigella as a Foodborne Pathogen and Current Methods for Detection in food, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, vol. 46, s. 551–567.

(17)

Wawerla, M., Stolle, A., Schalch, B., Eisgruber H., 1999, Impedance Microbiology:

Application in Food Hygiene, Journal of Food Protection, vol. 12, s. 1488–1496.

Zaremba, M.L., Borowski, J., 1994, Podstawy mikrobiologii lekarskiej, Wydawnictwo Lekarskie PZWL, s. 47–49.

Zhao, Z.J., Liu, X.M., 2005, Preparation of Monoclonal Antibody and Development of Enzymelinked Immunosorbent Assay Specific for Escherichia coli O157 in foods, Biomedical and Environmental Sciences, vol. 18, s. 254–259.

Zwirglmaier, K., 2005, Fluorescence in situ Hybridization (FISH) – the Next Generateon, FEMS Microbiology Letters, vol. 246, s. 151–158.

www.cdc.gov/foodborneburden/2011-foodborne-estimates.html [dostêp: 11.01.2011].

THE DETECTION OF FOODBORNE PATHOGENS USING CONVENTIONAL AND RAPID MICROBIOLOGICAL METHODS

Summary: The presence of pathogenic microorganisms in food is a serious problem in industrialized as well as developing countries. Every year many foodborne diseases are reported worldwide, including many deaths and cases with unknown etiology. Tradi- tional methods are harmonized, well accepted and used in official control, but they are laborious and lengthy. Nowadays numerous and diverse alternative methods for microbiological analysis are offered. In the presented paper modifications of conventional methods as well as rapid biochemical tests and immunological methods for identification of microorganisms are described. Some instrumental methods, such as fluorescence and luminescence techniques, as well as impedance methods are also characterized. Applica- bility of the mentioned methods has also been taken into account.