A N N A STRZELEC
SELEK C JA SZCZEPÓW RH IZOB IUM LEGUM IN OSARUM A K TY W N Y C H W SY M BIO ZIE Z BO BIKIEM U PR A W IA N Y M N A
G LEBIE KW A ŚN EJ, N A W O ŻO N EJ AZOTEM
Zakład Mikrobiologii Instytutu Uprawy, Nawożenia i Gleboznawstwa w Puławach
Czynnikami warunkującymi wysoką aktywność wiązania N2 przez rośliny
m otylkowate, żyjące w symbiozie z aktywnymi szczepami Rhizobium, są odpowiednie dla rozwoju obu partnerów w arunki glebowe, a szczególnie odczyn gleby i zawartość w niej azotu związanego.
Stwierdzono, że zarów no zakwaszenie gleby, ja k i duża ilość w niej N związanego m ogą wpływać niekorzystnie na każdy z etapów symbiozy. Przy czym wpływ ten zależy w dużej mierze od oddziaływania tych czynników na rozwój i aktywność bakteryjnego partnera. Znalezienie więc szczepu Rhizobium intensywnie wiążącego azot atmosferyczny w symbiozie z rośliną upraw ianą na glebie kwaśnej, zasobnej w N lub też nawożonej nim, może mieć duże znaczenie dla praktyki rolniczej.
Celem pracy było wyselekcjonowanie spośród 10 szczepów Rhizobium leguminosarum szczepu dającego najwyższe plony bobiku w przypadku uprawy tej rośliny na glebie kwaśnej zasobnej w azot i dodatkow o nawożonej tym pierwiastkiem.
M ATERIAŁ I M ETODY BAD AŃ
Badania prow adzono w w arunkach laboratoryjnych i w wazonowym doświadczeniu wegetacyjnym. Badane szczepy Rh. leguminosarum dla bobiku pochodziły z Kolekcji Szczepów Z akładu M ikrobiologii IU N G w Puławach. Szczepy Og, P, G i 73 В są szczepami pochodzenia krajowego, szczep D 57 pochodzi z CSSR, a pozostałe szczepy otrzym ano z IC A R D A i pochodziły one: F a 55 z Egiptu, F a 59 z Sudanu, F a 63 z M aroka, F a 65 z Libii, F a 73 z Syrii.
56 A. Strzelec
Badania laboratoryjne miały na celu określenie wpływu zakwaszenia podłoża i ilości w nim azotu na nam nażanie szczepów Rhizobium i aktyw ność wytwarzanych przez nie dehydrogenaz.
Wpływ pH podłoża na nam nażanie tych szczepów badano wysiewając ich 72-godzinne hodowle na płynną pożywkę YEM B [34], któ rą następnie inkubowano 24 godziny w termostacie (28°C) ze stałym wytrząsaniem. Tak przygotowaną hodowlą ( 1 ml) szczepiono 14 ml płynnej pożywki
YEMB o odczynie ustaonym kwasem mlekowym na poziomie pH 7,0, 6,5, 5,0 i 4,5. Po 24 godzinach inkubacji w warunkach jak poprzednio z każdej kolbki pobierano 2 ml hodowli i oznaczano jej ekstynkcję na
spektrofotom etrze przy długości fali 480 m^.
Wpływ azotu na nam nażanie Rhizobium oznaczano podobnie jak wpływ pH. Pożywki YEM B wzbogacano 1, 2, 5 i 10 mg N w N H4N 03 na 1 ml
pożywki. K ontrole stanowiły hodowle na pożywce bez azotu. Wszystkie pożywki miały pH 7,0.
Wpływ pH podłoża i ilość w nim azotu na aktywność dehydrogenaz wytwarzanych przez badane szczepy oznaczano zm odyfikowaną m etodą Szmidta [28].
W odny zmyw z 72-godzinnej hodowli Rhizobium na skosach ze stałą pożywką Thorntona wytrząsano 2,5 godziny w tem peraturze 25°C. Gęstość zawiesiny oznaczano mierząc jej ekstynkcję. M ililitr tak przygotowanej zawie siny wprowadzano do próbek ze szlifem, zawierających 0,5 ml wodnego roztw o ru 2,3,5-trójfenylotetrazoliowego chlorku (TTC) oraz 3,5 ml pożywki YEMB o pH 7,0, 6,0, 5,5 i 5,0, a w przypadku badania wpływu azotu — pożywki o pH 7,0 wzbogaconej 1,0, 2,5 i 10 mg N na 1 ml. K ontrole stanowiły serie z pożywką bez dodatku azotu. Wszystkie serie miały po trzy powtórzenia. Po zakorkow aniu zawartość probówek wytrząsano i inkubow ano 24 godziny w tem peraturze 25°C, po czym w celu przerwania reakcji dodaw ano do nich kwas octowy i toluen. Po silnym wytrząśnięciu hodowle pozostawiano na 24 godziny w termostacie. Natężenie barwy powstałego z TTC 2,3,4-trój- fenylotetrazoliowego form azanu (TTF) w toluenie oznaczano na spektro fotom etrze przy długości fali 480 m/i. Wyniki odczytywano z krzywej wzorcowej i przeliczano na jednostkę ekstynkcji wyjściowej hodowli Rhizobium.
Doświadczenie wegetacyjne m iało na celu wyselekcjonowanie spośród badanych szczepów Rh. leguminosarum szczepu najaktywniejszego w symbiozie z bobikiem uprawianym na glebie kwaśnej, zasobnej w N i dodatkow o nawożonej tym pierwiastkiem.
Gleba użyta do doświadczenia wytworzona była z piasku słabo gliniastego (78% piasku, 15% pyłu, 7% części spławialnych) i zawierała w 100 g: 50,8 mg N ogółem, 1,5 mg N - N H 4, 4,7 mg N - N 0 3, 5,2 mg P, 2,7 mg K, 0,5 mg Mg przyswajalnego, 22,5 mg Ca wymiennego i 0,9 mg Mg wymiennego. pH gleby w KC1 wynosiło 5,0, jej kwasowość hydrolityczna 2,48, a pojemność wodna 20,5%.
Selekcja szczepów Rhizobium współżyjących z bobikiem 57
W azony napełniano 7 kg gleby wymieszanej z 2,5 g CaO , 1,8 g К , 0,7 g Р na wazon oraz, N H4N 03 w ilości 0,560 g N lub 1,120 g N na wazon
i nawilżano w odą destylowaną do 50% całkowitej pojemności wodnej. pH tak przygotowanej gleby wynosiło 5,6.
Rośliną doświadczalną był bobik odm iany Nadwiślański. N asiona bobiku zaprawione zapraw ą nasienną T szczepiono Rhizobium, wprowadzając po 0,5 ml zawiesiny badanego szczepu na każde nasionko umieszczone w glebie na głębokości 5 cm.
Doświadczenie założono według następującego schem atu:
seria 1: gleba nie nawożona N, nasiona zakażone szczepem bytującym w glebie,
seria 2: g leba+0,560 g N, nasiona zakażone szczepem bytującym w glebie, seria 3: g leb a+ 1,120 g N , nasiona zakażone szczepem bytującym w glebie, seria 4-14: g leb a+0,560 g N , nasiona szczepione szczepem Og. P, G , D 57,
73 B. Fa 59, Fa 65, Fa 73 lub nitraginą,
seria 15— 17: gleba + l,1 2 0 g N , nasiona szczepione szczepem Og, F a 63 lub nitraginą.
K ażda kom binacja doświadczalna założona była w 6 powtórzeniach.
Przebieg doświadczenia: po 10 nasion bobiku do każdego w azonu wysiewano 4.IV.1985 roku, utrzym ując wiglotność gleby w czasie wegetacji roślin na poziom ie 60% całkowitej pojemności wodnej. Po wyrównaniu wschodów (25.IV) siewki przerwano pozostawiając w wazonie po 6 roślin. W początkach
kwitnienia roślin (27.V.) z każdej kombinacji zlikwidowano po jednym wazonie i oznaczono plon świeżej masy części nadziemnych roślin, ilość pięter liści, plon brodaw ek, ich wielkość, rozmieszczenie i zabarwienie. Przeprowadzono ponadto obserwację m ikroskopow ą preparatów z brodaw ek barwionych fuksyną zasadową. W związku z pojawieniem się mszyc 9.VII rośliny podlano preparatem Bi. Doświadczenie zlikwidowano 14.VIII w fazie zczernienia ponad 95% strąków. Oznaczono wówczas zabarwienie łodyg, liczbę strąków, suchą masę słomy i ciężar nasion (przy 13% zawartości wody).
W YNIKI BAD AŃ I DYSKUSJA
WPŁYW ODCZYNU PODŁOŻA I KONCENTRACJI W NIM AZOTU NA WZROST SZCZEPÓW R H IZ O B IU M I AKTYWNOŚĆ WYTWARZANYCH PRZEZ NIE DEHYDROGENAZ
N a ogół uważa się, że dla większości szczepów Rhizobium optymalnym odczynem podłoża jest pH 7,0-6,5, a jego zakwaszenie wpływa niekorzystnie na nam nażanie i przeżywalność tych bakterii [2, 5, 14, 15, 29-33].
W kontrolnych hodowlach o pH 7,0 badane przez nas szczepy Rhizobium leguminosarum wykazały różną intensywność w zrostu i aktywność dehydroge naz. Nie stwierdzono jednak zależności między tymi ich właściwościami a rodzajem i wielkością reakcji szczepów na zakwaszenie podłoża lub wzbo gacenie go w azot (tab. 1-4).
T a b e la 1 Wpływ pH na wzrost badanych szczepów Rhizobium leguminosarum w % ekstynkcji
hodowli kontrolnej (pH 7,0)
Effect of medium pH on the growth of the Rhizobium leguminosarum strains in % of extinction of the control culture
Szczep Strain Ekstynkcja hodowli kontrolnej Extinction of the control culture
Ekstynkcja hodowli kontrolnej, % Extinction of the control culture, %
wartość pH pożywki — pH value of nutrient medium
6,5 6,0 5,5 5,0 4,5 Og 0,390 — 105 110 96 64 P 0,240 125 146 123 92 42 G 0,160 97 88 69 9 0 D 57 0,210 112 129 143 62 32 73 В 0,200 100 95 78 28 3 Fa 55 0,330 - 118 100 29 3 Fa 59 0,350 - 100 100 13 0 Fa 63 0,450 - 109 84 43 34 Fa 65 0,530 - 100 81 36 12 Fa 73 0,500 - 90 64 20 1 T a b e la 2 Wpływ pH na aktywność dehydrogenaz badanych szczepów Rhizobium w %
aktywności hodowli kontrolnej (pH 7,0)
Effect of pH on the activity of dehydrogenases of the Rhizobium strains in % of activity of the control culture
Szczep Strain
/Л H 2 na jednostkę ekstynkcji hodowli
kontrolnej /il H 2 per extinction
unit of the control culture
Aktywność hodowli kontrolnej, % Activity of the control culture, % pH podłoża — nutrient medium pH
6,5 6,0 5,5 5,0 Og 18,7 56 19 10 3 P 15,5 54 18 9 0 G 14,4 37 6 0 0 D 57 14,7 66 12 0 0 73 В 4,6 74 8 0 0 Fa 55 5,0 45 7 0 0 Fa 59 3,8 41 3 0 0 Fa 63 6,8 49 16 4 0 Fa 65 6,7 48 18 7 0 Fa 73 5,7 41 19 10 0
[
58]
T a b e la 3 Wpływ azotu na wzrost badanych szczepów Rhizobium leguminosarum
w % ekstynkcji hodowli kontrolnej bez N
Effect of nitrogen on the growth of the Rhizobium leguminosarum strains in % of extinction of the control culture without N
Szczep Strain Ekstynkcja hodowli kontrolnej Extinction of the control culture
Ekstynkcja hodowli kontrolnej Extinction o f the control culture
mg N na ml pożywki — mg N per ml of the nutrient medium
1 2 5 10 Og 0,460 135 128 135 32 P 0,350 117 51 10 7 G 0,180 78 50 8 8 D 57 0,260 77 50 16 6 73 В 0,250 58 24 16 8 Fa 55 0,500 66 30 10 4 Fa 59 0,440 71 40 8 6 Fa 63 0,620 24 7 7 5 Fa 65 0,650 29 7 5 4 Fa 73 0,520 32 7 5 4 T a b e la 4 Wpływ azotu na aktywność dehydrogenaz badanych szczepów Rhizobium
w % aktywności hodowli kontrolnej — bez N
Nitrogen effect on the activity of dehydrogenases of the Rhizobium strains in % of activity of the control culture — without N
Szczep Strain
/л\ H 2 na jednostkę ekstynkcji hodowli
kontrolnej /il H 2 per extinction
unit of the control culture
Aktywność hodowli kontrolnej, % Activity of the control culture, % mg N na ml pożywki — mg N per
ml of the nutrient medium
1 2 5 10 Og 17,8 65 53 13 3 P 7,7 40 33 2 0 G 6,6 54 42 15 0 D 57 13,5 72 50 14 0 73 В 9,7 33 24 6 0 Fa 55 5,9 18 2 0 0 Fa 59 5,5 25 10 0 0 Fa 63 7,5 37 33 2 0 Fa 65 5,5 41 29 11 0 Fa 73 5,0 13 0 0 0
[
59]
60 A. Strzelec
Reakcja na zakwaszenie podłoża była właściwością szczepową (tab. 1 ,2 ). Najodporniejsze na obniżanie odczynu podłoża były szczepy P, Og i D 57. Zakwaszenie podłoża do pH 5,5 stymulowało wzrost, a dalsze obniżanie jego odczynu ham ow ało ich nam nażanie w znacznie mniejszym stopniu niż pozostałych szczepów. Najwrażliwszym na zakwaszenie podłoża był szczep G , najsłabiej namnażający się również w hodowli kontrolnej (tab. 1). Zakwaszenie podłoża wywierało znacznie większy wpływ na aktywność enzy m atyczną badanych szczepów niż na ich namnażanie. Już nieznaczne obniżenie odczynu podłoża (do pH 6,5) zmniejszało aktywność wytworzonych przez te szczepy dehydrogenaz średnio o 49% natom iast spadek pH do 6,0 obniżał ją o 87% (tab. 2).
Różnice reakcji szczepów na zakwaszenie podłoża stwierdzono również w innych grupach Rhizobium na przykład selekcja szczepów Rhizobium trifolii przeprowadzona na podstawie intensywności ich wzrostu na podłożu o różnym stopniu kwasowości wykazała, że samo zakwaszenie podłoża było czynnikiem hamującym wzrost 84% testowanych szczepów [29]. Szczepy określone w wyniku tej selekcji jako tolerujące zakwaszenie podłoża tworzyły aktyw ną symbiozę z koniczyną upraw ianą na glebie o pH od 5,9 do 4,4, a ilość N akumulowanego w tych roślinach była na tym samym poziomie, co w roślinach zaszczepionych szczepem wrażliwym na zakwaszenie podłoża, uprawianych na glebie wapnowanej [30]. Wyniki te, podobnie jak wyniki naszych badań, wskazują na możliwość selekcji szczepów Rhizobium aktywnych w symbiozie z roślinami uprawianym i na glebach kwaśnych, na podstawie intensywności nam nażania się ich kom órek w hodowlach syntetycznych o obniżonym odczynie. Należy jednak zaznaczyć, że m ogą być duże różnice we wrażliwości na zakwaszenie podłoża pomiędzy procesami decydującymi o nam nażaniu się kom órek Rhizobium a procesami zachodzącymi podczas symbiozy tych bakterii z roślinami. W ykazano na przykład, że procesy symbiozy Rh. leguminosarum z grochem były 10-krotnie wrażliwsze na zak waszenie podłoża niż procesy decydujące o nam nażaniu się kom órek tych bakterii [6]. Przyczyną tego mogła być zwiększona koncentracja Al w glebie
kwaśnej i nakładanie się niekorzystnego oddziaływania tego pierwiastka na rozwój zarów no Rhizobium, jak i rośliny [2, 17]. Symptomami bowiem toksyczności glinu dla roślin jest oprócz redukcji przez ten pierwiastek pobierania i transportu w roślinie fosforu i wapnia, również zaham owanie wzrostu korzeni i brak włośników korzeniowych [17], co może zwiększać niekorzystny wpływ Al na proces symbiozy.
Silnym inhibitorem wzrostu i aktywności enzymatycznej większości bada nych szczepów była obecność w ich podłożu azotu związanego. W pożywce zawierającej 1 mg N na 1 ml wzrost ośmiu spośród badanych szczepów hamowany był od 22 do 76%, średnio o 49%, natom iast N w koncentracji 2,0, 5,0 i 10 mg na ml zmniejszał wzrost średnio o 73%, 91% i 94%. W yjątek
Selekcja szczepów Rhizobium współżyjących z bobikiem 61
stanowił szczep Og, którego wzrost na pożywce zawierającej od 1 do 5 mg N na 1 ml był wyraźnie stymulowany i dopiero azot w koncentracji
1 0 mg na ml hamował go w 6 8%, gdy tymczasem wzrost pozostałych
szczepów w pożywce z tą ilością azotu był ham ow any niemal całkowicie (94%) (tab. 3). Obecność azotu m ineralnego w podłożu ham ow ała w znacznie większym stopniu aktywność dehydrogenaz wytwarzanych przez badane szcze py niż ich procesy wzrostowe (tab. 3, 4).
Wpływ azotu na rozwój Rhizobium zależy w dużej mierze od formy, w jakiej jest on stosowany [1, 8]. Powszechnie uważa się, że najdostępniejszym
jego źródłem dla tych bakterii są aminokwasy. Badania własne, jak też innych autorów [11] świadczą o możliwości korzystania przez Rhizobium również z azotu mineralnego, przy czym ich reakcja na ilość i form ę azotu znajdującego się w podłożu jest właściwością szczepową. Znalezienie więc szczepu intensywnie namnażającego się w obecności dużej ilości N m ineral nego w podłożu i zastosowanie go jak o szczepionki roślin nawożonych azotem, może być czynnikiem zapewniającym ich efektywną symbiozę [26].
T a b e la 5 Brodawkowanie bobiku szczepionego różnymi szczepami Rhizobium leguminosarum
(początki kwitnienia roślin)
Nodulation of faba beans inoculated with Rhizobium leguminosarum strains (flowering start) Szczep Strain g N na wazon g N per pot Plon brodawek g z wazonu Yield of nodules in g from pot Plon św. m. roślin g z wazonu Yield of fresh matter
plants in g from pot
Liczba pięter liści ■ Number of leaf storeys Rodzimy 0 5,84 96 8 Native 0,560 2,32 187 11 1,120 0,23 188 11 Og 0,560 4,56 178 10 1,120 0,30 184 11 Fa 63 0,568 6,43 192 11 1,120 1,00 198 11 Nitragina 0,560 2,99 167 10 1,120 0,28 190 11 P 0,560 5,83 201 11 G 0,560 7,43 187 11 D 57 0,560 1,51 174 10 73 В 0,560 3,25 184 10 Fa 55 0,560 4,19 187 10 Fa 59 0,560 4.16 185 10 Fa 65 0,560 5,12 197 11 Fa 73 0.560 6,67 200 11
62 A. Strzelec
WPŁYW NAWOŻENIA AZOTEM MINERALNYM NA ROZWÓJ I BRODAWKOWANIE BOBIKU UPRAWIANEGO NA GLEBIE KWAŚNEJ
Nawożenie gleby azotem opóźniało nieznacznie wschody bobiku, rozwój pierwszej pary liści i początek zakwitania dolnego piętra kwiatów, skracając jednocześnie okres wegetacji roślirt, czego dowodem było szybsze b ru nat nienie łodyg (tab. 5, 6).
Gleba użyta w doświadczeniu z bobikiem była zasiedlona przez szczep Rh leguminosarum, wytwarzający na korzeniach tej rośliny stosunkow o duże, różowo zabarwione brodaw ki. Nawożenie tej gleby azotem wpływało bardzo niekorzystnie na charakter brodaw ek korzeniowych, zmieniając ich liczbę oraz zabarwienie i plon. W glebie nawożonej 0,560 g N na wazon plon brodaw ek z roślin zakażonych szczepem rodzimym zmniejszył się w stosunku do plonu z gleby nie nawożonej o 60%, natom iast podwojenie dawki azotu ham owało brodaw kowanie niemal w 100% (tab. 5). Potwierdziło to wyniki wcześniejszych, doniesień stwierdzających, że duża ilość azotu w podłożu
T a b e la 6 Rozwój bobiku szczepionego badanymi szczepami Rhizobium leguminosarum
Development of faba beans incoulated with Rhozobium leguminosarum strains
Szczep Strain
g N na wazon g N per pot
Liczba roślin z zielony mi łodygami w wazonie
Number of plants with green stems in a pot
Liczba strąków w wazonie Number of pods in a pot Plon s.m. słomy w g w wazonie Straw dry matter yield in g from pot Rodzimy 0 5,50 32 50,75 Native 0,560 4,00 29 50,25 1,120 2,00 25 48,88 Og 0,560 4,75 29 50,38 1,120 3,75 25 50,12 Г0 га Of.'Xj 0,560 4,00 28 53,50 1,120 3,75 26 49,63 0,560 5,00 29 50,25 Nitragina 1,120 3,25 25 40,63 P 0,560 5,00 28 57,38 G 0,560 5,00 24 54,68 D 57 0,560 5,50 28 52,95 73 В 0,560 5,00 24 52,38 Fa 55 0,560 5,00 26 49.88 Fa 59 0,560 3,75 23 51,88 Fa 65 0,560 4,00 33,5 53,38 Fa 73 0,560 5,25 27 !! 48,25
Selekcja szczepów Rhizobium współżyjących z bobikiem 63 T a b e la 7 Plon nasion bobiku szczepionego badanymi szczepami Rhizobium leguminosarum
Yield of faba beans inoculated with the Rhizobium leguminosarum strains Szczep
Strain
Nawożenie N — g na wazon — N fertilization in g per pot X
0 0,560 . 1,120
Rodzimy
Native 41.3 36,5 29,3
N U R dla poziomów nawożenia szczepu rodzimego — 4,5 LSD for the fertilization level of native strain — 4.5
P « 42,9 _ _ Nitragina - 42,4 - -Fa 65 - 42,1 - -Fa 63 - 41,3 - -Og - 41,1 - -Fa 73 - 40,1 - -D 57 - 40,0 - -Rodzimy — Native - 36,5 - -Fa 55 - 36,3 - -73 В - 35,5 - -Fa 59 - 32,8 - -G — 32,3 — —
N U R dla szczepów przy poz. 0,560 g N ina wazon — 4,3 LSD for strains at the fertilization level of 0,560 g N per pot — 4.3
Nitragina — 42,4 29,9 36,1
Fa 63 - 41,3 38,3 39,8
Og - 41,1 32,4 36,8
Rodzimy — Native - 36,5 29,3 32,9
X — 40,3 32,4 —
N U R dla szczepów — LSD for strains 2,6
N U R dla poziomów nawożenia — LSD for fertilization levels 1,8 N U R dla współdziałania szczepu z nawożeniem
3,7 LSD for interaction of strain with fertilization
m oże ograniczyć w nikanie Rhizobium do włośników korzeniowych, zmniej szając tym samym liczbę i plon brodaw ek [18], oraz aktywność wiązania w nich azotu [10, 13, 20, 21]. Jedną z przyczyn ograniczonego wnikania kom órek Rhizobium do włośników korzeniowych może być, wykazany w tych badaniach labratoryjnych, ham ujący wpływ azotu na nam nażanie tych bakterii.
N a glebie nawożonej 0,560 g N na wazon szczepienie bobiku szczepami Rhizobium pochodzącym i z kolekcji na ogół zwiększało plon brodaw ek (średnio o 217%) w stosunku do plonu z roślin zakażonych szczepem występującym w glebie. Jednak jedynie trzy spośród tych szczepów dawały plon wyższy od plonu roślin nie szczepionych i nie nawożonych azotem (tab. 5, 7).
64 A. Strzelec
W brodaw kach bobiku nawożonego 1,120 g N na wazon stwierdzono zaham owanie przekształcania kom órek Rhizobium w bakteroidy, co może świadczyć o nieaktywności symbiotycznej tych brodawek. Stwierdzono bowiem, że w brodaw kach aktywnie wiążących azot aż 92% bakterii znajdowało się w formie bakteroidalnej, gdy tymczasem w nieaktyw nych— jedynie 1,5% [13]. Ham owanie przekształcania się w brodaw kach Rhizobium w bak teroidy pod wpływem nawożenia roślin azotem obserwowali także inni badacze [3, 7, 9, 27].
Obserwacje brodaw kow ania przeprowadzone w początkach kwitnienia roś lin nie wykazały wówczas korelacji pomiędzy plonem brodaw ek i plonem zielo nej masy roślin. Nawożenie azotem, mimo ham ow ania brodaw kow ania, zwięk szało plon roślin, co świadczyło o korzystaniu przez nie w tej fazie ich wzrostu głównie z azotu znajdującego się w glebie (tab. 5). N a podstawie wyników podobnych badań M i e c z y ń s k a i A r a ź n a [18] wnioskowały, że bobik jest rośliną przystosowaną raczej do korzystania ze znajdującego się w glebie azotu związanego, niż azotu wiązanego symbiotycznie.
WPŁYW AZOTU NA PLON NASION BOBIKU ZAKAŻONEGO BADANYMI SZCZEPAM I R H I Z O B I U M
Bobik nie szczepiony, korzystający z rodzimego azotu glebowego oraz z azotu wiązanego w symbiozie ze szczepem Rhizobium występującym w glebie, dawał plon nasion o 1 1,6% wyższy od plonu z gleby nawo
żonej 0,560 g N na wazon i o 29% wyższy od plonu z gleby nawożonej dwukrotnie wyższą daw ką azotu (tab. 7). Było to zapewne wynikiem nie korzystnego oddziaływania na przebieg i efektywność procesu symbiozy dużej ilości azotu znajdującego się w podłożu, o czym świadczyły również zmiany w brodaw kowaniu.
Jako przyczynę hamującego działania azotu m ineralnego na wiązanie azotu cząsteczkowego przyjmuje się niedostateczne zaopatrzenie brodaw ek w węglowodany [18], co z kolei może powodować opadanie pąków, kwiatów i młodych strąków, zmniejszając tym samym plon nasion [9]. W ykazano ponadto, że jony N H 4, a pośrednio i N 0 3, są inhibitoram i nitrogenazy [12].
Poszukiwania wśród badanych szczepów Rhizobium szczepu zapewniającego uzyskanie najwyższego plonu nasion bobiku upraw ianego na glebie nawożonej 0,560 g N wykazały, że aktywność szczepu zależała od jego przystoso wania do rozwoju w danych w arunkach glebowych oraz od efektywności w tych w arunkach procesu jego symbiozy z bobikiem. Spośród jedenastu badanych szczepów siedem dawało plony wyraźnie wyższe od plonu roślin zakażonych szczepem rodzimym, a jedynie dwa dawały plon o około 4 g z wazonu niższy. Szczepienie nasion szczepem P, nitraginą i Fa 65 zwięk szało plony nasion średnio o około 6 g z wazonu, a szczepy Fa 63 i Og
symbio-Selekcja szczepów Rhizobium współżyjących z bobikiem 65
tycznie szczepy były na ogół znacznie odporniejsze na silne zakwaszenie podłoża, niż pozostałe szczepy (G, F a 59, 73 B, F a 55), dające plony niższe niż szczep rodzimy (tab. 1, 7).
D w ukrotne zwiększenie dawki azotu istotnie obniżało plon bobiku szcze pionego wszystkimi badanym i w tej kom binacji nawozowej szczepami (Og, F a 63, nitragina, szczep rodzimy), w stosunku do plonu z gleby nawożonej 0,560 g N na wazon (tab. 7).
Potwierdza to wyniki uzyskane przez R i c h a r d s a i S o p e r a [21], którzy stwierdzili, że wprowadzenie 200 mg N na kg gleby nie wpływało na wzrost plonu suchej masy bobiku, podczas gdy 300 mg N na kg, zastosowane w okresie siewu dawało wprawdzie istotną (13,2%) zwyżkę plonu, nie wpływało jednak na pobieranie przez rośliny azotu i na ilość białka w ich pędach. Zdaniem tych badaczy, w serii nie nawożonej azotem ilość N związanego symbiotycznie wynosiła 708 mg na każdą roślinę, co stanowiło 87% ogólnej zawartości w niej tego pierwiastka, z czego aż 28% azotu wiązane było w fazie wypełniania strąków.
W yniki własne, podobnie jak wyniki innych autorów [16, 20, 21, 22, 25] świadczą o tym, że w w arunkach sprzyjających efektywnej symbiozie ilości azotu wiązanego w tym procesie oraz zapasy azotu zawarte w nasionach i w glebie wystarczają na pokrycie zapotrzebow ania bobiku na ten pierwiastek. Jedynie w glebach ubogich w azot niewielkie dawki tego pierwiastka, stosowane w okresie, gdy symbioza nie jest jeszcze dostatecznie wykształcona, m ogą stymulować wzrost roślin, a w efekcie zwiększać również ich plon. Niemniej istnieją doniesienia o korzystnym wpływie na plony bobiku nawet wysokich dawek nawozów azotowych [23, 24]. Sytuacja taka może, zdaniem autorki, zaistnieć wówczas, gdy warunki środowiska nie sprzyjają symbiozie lub zakażający roślinę szczep Rhizobium jest słabo aktywny w procesie wiązania N 2.
Z uwagi jednak na nasilający się na świecie kryzys energetyczny i zwią zany .z nim spadek produkcji nawozów azotowych, nawożenie nimi roślin m otylkowatych jest ekonomicznie nieuzasadnione. Należy natom iast dążyć do stworzenia w arunków sprzyjających jak największej efektywności procesu symbiozy tych roślin z Rhizobium.
LITERATURA
[1] B e r g e r s e n F. J.: The growth of Rhizobium in synthetic media. Austr. J. Biol. Sei. 14, 1961, 349.
[2] C o o p e r J. E., W o o d M., H o ld in g A. J.: The influence of soil acidity factors on Rhizobia. In Temperate legumes: Physiology, Genetics and Nodulation. Eds. Tones D. G., Davies D. R. s. 319-335, Pitman, London 1983.
[3] D a r t P. J., M e r c e r F. V.: The effect o f growth temperature, level o f ammonium nitrate and light intensity on the growth and nodulation of cowpea ( Vigna sinensis).
6 6 A. Strzelec
[4] D a z z o F. В., B r ill W. J.: Regulation by fixed nitrogen of host-symbiont recognition in the Rhizobium -clover symbiosis. Plant Physiol. 62, 1978, 18-21.
[5] D u g h r i M. H., B o t t o m le y P. J.: Soil acidity and the composition of an indigenous population of Rhizobium trifolii in nodules of different cultivars of Trifolium subterraneum
L. Soil Biol. Bioch. 164, 1984, 405-411.
[6] E v a n s L. S., L ew in K. F., V e lla F. A.: Effect of nutrient medium on symbiotic fixation by Rhizobium leguminosarum and Pisum sativum. Plant a. Soil 56, 1980,
I, 71-80.
[7] F ie d o r o w M. W., K o z ło w I. W.: Wlijanije swiazannych sojedinienii azota na azoto- fiksirujuszczuju aktiwnost kłubienkowych bakterii soi i fasoli i wzaimootnoszenija mieżdu nimi i bobowymi rastieniami. Mikrobiol. 23, 1954, 534-543.
[8] F red E. B., B a ld w in I. L., M c C o y E.: Root nodule bacteria and leguminous plants. University of Wisconsin, Madison 1932.
[91 F r e v e E.. S c h i l l i n g G . : U n t e r s u c h u n g e n ü b e r d ie A b h ä n g i g k e i t d e r F r u c h t b i l d u n g bei A c k e r b o h n e n ( I icia jaha L. var. m inor.) \ o n A s s i m i l ä t b i l d u n g u n d t r a n s p o r t . A r c h . f. A c k e r P f l a b a u 27, 1932, 3, 1 8 5 -19 0.
[10] G ib s o n A. H.: Recovery and compensation by nodulated of legumes to environmental stress. W: Symbiotic nitrogen fixation in plants. Nutman P. S. Intern. Biol. Programme 7, Cambridge Univ. Press 1976, 385-405.
[11] G ra h a m P. H., P a rk er C. A.: Diagnostic features in the characterisation of the root- nodule bacteria of legumes. Plant a. Soil 20, 1964, 383-396.
[12] H o u w a a r d F.: Effect of combined nitrogen on symbiotic nitrogen fixation in pea plants. Thesis Agricul. Univ. Wageningen 1979.
[13] J o r d a n D. C., C o u lte r W. H.: On the cytology and syntetic capacities of natural and artifically produced bacteroids of Rhizobium leguminosarum. Can. J. Microbiol. II, 1965, 709-720.
[14] M a h le r R. L.: Influence of pH on yield and N and P nutrition of alfalfa grown on an andic mission silt loam. Agron. J. 75, 1983, 5, 731-735.
[15] M a h le r R. L.: Greenhouse evaluation of growth parameters related to birdsfoot trifoil and red and white clover production on an andic mission silt loam. Soil Sei. Plant Anal. 15, 1984, 8, 969-983.
[16] M c -E w e n J.: Fertilizer nitrogen and growth regulators for field bean (Vicia fa b a L.). II. The effects of large dressings of fertilizer nitrogen, single and split applications, and growth regulators. J. of Agric. Sc., Cambridge 74, 1970, 67-72.
[17] M u n n s D. N .: Soil acidity and growth o f a legume. I. Interaction of lime with nitrogen and phosphate on the growth of M edicago sativa L. and Trifolium subterraneum
L. Austr. J. Agric. Res. 16, 1965, 733-741.
II. Reaction of aluminium and phosphate in solution and effects of aluminium, phosphate, calcium and pH on M edicago sativa L. and Trifolium subterraneum L. in solution culture. J. Agric. Res. 16, 1965, 742-756.
[18] N o w o t n y - M ie c z y ń s k a A., A r a ź n a J.: Wpływ molibdenu na symbiozę bobiku i seradeli w obecności różnych dawek azotu amonowego. Pam. puł. 1970. 39. 55-68.
[19] N u tm a n P .S .: The influence of legume in root nodule symbiosis. Biol. Rev. 31, 1956, 109-151.
[20] R ic h a r d s J. E.: The effect of fertilizer nitrogen on yield, crude protein content and symbiotic fixation in Vicia fa b a L. var. minor. M. S. Thesis, Univ. of Manitoba 1977. [21] R ic h a r d s J. E., S o p e r R. J.: Effect of N fertilizer on yield, protein content, and symbiotic
N fixation in faba beans. Agron. J. 72, 1979, 5, 807-811.
[22] R in n o G:, E b ert K., W ild n e r M.: The effect of nitrogen fertilization on the amino acid content of legumes grown for grain. Tag. Ver. Akad. Landwirtsch. Wiss. D D R ,
1973, 122, 67-75.
Selekcja szczepów Rhizobium współżyjących z bobikiem 67 [23] R o g a ls k y J. R.: Summary of faba bean fertility trials. 16th Ann. Manitoba Soil Sei.
Meeting, p. 169-170. University of Manitoba, Winnipeg 1972.
[24] S a d le r J. M.: Soil, fertilizer, and symbiotically-fixed nitrogen as sources of nitrogen for faba beans under prairie conditions. 19th Ann. Manitoba Soil Sei. Meeting, 121-128, University of Manitoba, Winnipeg, 1975.
[25] S c h e v e r H. W., D a n z e is e n L.: Der Einfluss gesteigerter Stickstoffgaben auf die Entiwcklung der Wurzelknöllchen. Z. Pflanzenernähr. Bodenkd. 143. 1980, 4, 464—470. [26] S p a r r o w S. D ., H am G. E.: Nodulation, N 2 fixation, and seed yield of heavy beans
as influenced by inoculate rate and inoculant carrier. Agr. Jour. 75, 1983, 1, 20-24. [27] S tr z e le c A.: Wpływ mocznika na zdolność szczepów Rhizobium do asymilowania wol nego azotu. II. Oddziaływanie na symbiozę Rhizobium m elilołi z lucerną. Pam. puł.
1972, 52, 103-144.
[28] S z m id t E. F.: Differencjacja sztammow kłubienkowych bakterii na osnowanii dannych po opriedieleniju aktiwnosti bessubstratnych diegidraz. Mikrobiol. 33, 1964, 284-191. [29] T h o r n to n F. C., D a v e y C .B .: Acid tolerance of Rhizobium trifolii in culture media.
Soil Sei. Soc. Am. J. 47, 1983, 3, 496-501.
[30] T h o r n to n F. C., D a v e y C .B .: Response of the clover-Rhizobium symbiosis to soil acidity and Rhizobium strain. Agr. J. 75, 1983, 3, 557-560.
[31] W o o d M., C o o p e r J. E .: Aluminium toxicity and multiplication of Rhizobium trifolii
in a defined growth medium. Soil Biol. Bioch. 16, 1984, 6, 571-576.
[32] W o o d M., C o o p e r J. E.: Screening clover and lotus R hizobia for tolerance of acidity and aluminium. Soil Biol. Bioch. 17, 1985, 4, 493-497.
[33] W o o d M., C o o p e r J. E., H o ld in g A. J.: Soil acidity factors and nodolation of
Trifolium repens. Plant and Soil 78, 1984, 367-379.
[34] V in c e n t J. M.: A manual for the practical study of root-nodule bacteria. Blackwell, Oxford 1970. V А. СТШ ЕЛЕЦ СЕЛЕКЦИЯ ШТАММОВ R H IZ O B IU M L E G U M IN O S A R U M АКТИВНЫ Х В СИМБИОЗЕ С КОНСКИМ И БОБАМИ ВОЗДЕЛЫВАЕМЫМИ НА КИСЛОЙ УДОБРЯЕМОЙ АЗОТОМ ПОЧВЕ Отдел микробиологии Института агротехники, удобрения и почвоведения в Пулавах Р е з ю м е Исследовали влияние степени кислотности питательных сред и почвы и повышения в них концентрации азота на интенсивность дегидрогеназ десяти штаммов Rhizobium leguminosarum, а также на эффективность их симбиоза с конскими бобами. В культурах на питательной среде YEMB интенсивность роста и активность дегидрогеназ испытуемых штаммов в общем снижались, как по мере снижения кислой реакции питательной среды, так и по мере повышения содержания в ней азота. Интенсивность и качество реакции испытуемых штаммов являлись штаммным свойством. Интенсивность роста 24-часовой культуры штаммов на питательной среде с pH 5,0 задерживалась на 4— 91%, в среднем на 57%, по отношению к росту контрольной культуры (pH 7,0), тогда как на питательной среде с pH 4,5 это задержание роста составляло 3 6 — 100%, в среднем на 87%. Кислотность питательной среды задерживала гораздо сильнее рост штаммов, чем активность их дегидрогеназ. В питательной среде с pH 6,5 активность этих энзимов снижалась на 49%, а с pH 6,0 — даже на 87%.
6 8 A. Strzelec На питательной среде с pH 5,5 в культурах большинства штаммов не установлено определяемых количеств дегидрогеназ. Введенный в питательную. среду в количестве 0,1 мг/мл азот задерживал рост восьми штаммов на 22— 76%, в среднем на 49%, а активность дегидрогеназ на 62%. Введение 2, 5 и 10 мг азота на мл питательной среды ослабляло интенсивность роста исследуемых штаммов соответственно на 73, 91 и 94%. Симбиотическую активность исследуемых штаммов проверяли в вегетационном опыте в сосудах, проведенном на почве с рН_ 5,6 образованной из слабой супеси содержащей в 100 г 50,8 мг общего азота и заселенной активным для конских бобов штаммом Rhizobium leguminosarum. Азот введенный в количестве 0,560 и 1,120 г на 7 кг этой почвы заметно задержи вал клубенькообразование у конских бобов. Урожай клубеньков неокулированных расте ний зараженных штаммом Rhizobium обитающим в почве снижался в почве удобрен ной азотом в сравнении с урожаем клубеньков с неудобренной почвы, в зависимости от дозы азота, на 60 и 96%. Инокуляция семян конских бобов возделываемых на почве удобренной дозой 0,560 г N на сосуд, повышала урожай клубеньков в среднем на 217%. Азотное удобрение почвы снижало, в зависимости от величины дозы азота, число стручков и урожай семян соответственно на 11,5 и 29,0%. В растениях инокулирован- ных семью среди исследуемых штаммов урожай семян конских бобов был в среднем на 13,5% выше, чем урожай семян растений находящихся в симбиозе с обитающим в почве штаммом. Два же среди исследуемых штаммов снижали урожай семян на около 11%. Реакция растений инокулированных Rhizobium зависела от активности штам мов и их устойчивости к почвенным условиям. A. STRZELEC SELECTION OF ACTIVE R H IZ O B IU M L E G U M IN O S A R U M
STRAINS IN THE SYMBIOSIS WITH FABA BEANS CULTIVATED ON ACID SOIL FERTILIZED WITH NITRO GEN
Department of Microbiology, Institute of Soil Science and Plant Cultivation in Puławy
S u m m a ry
The effect of acidification of mediurq and of increasing the nitrogen concentration in it on the intensity of growth and activity of dehydrogenases and the efficiency of the symbiosis of ten Rhizobium leguminosarum strains for faba beans was investigated.
In cultures on the YEMB nutrient medium the intensity o f growth and activity of dehydrogenases o f the strains under study, as a rule, decreased with decreasing nutrient medium acidity and the increasing nitrogen content in it. The kind and value of the reaction constituted the strain property.
The growth intensity of the 24-hour culture of strains on the nutrient medium of pH 5.0 was inhibited by 4-91% i.e. 57% on the average, in relation to the growth in the control culture (pH 7.0), whereas on the nutrient medium of pH 4.5 this inhibition amounted to 36-100%, i.e. 87%, on the average. The nutrient medium acidification inhibited to a much higher degree the activity of dehydrogenases of the lattern than the growth of strains. In the nutrient medium of pH 6.5 the activity of these enzymes decreased by 49%, whereas in that of pH 6.0 it decreased as much as by 87%. In the nutrient
Selekcja szczepów Rhizobium współżyjących z bobikiem 69 medium of pH 5.5 in the cultures of most strains no determinable amounts o f dehydro genases were to be found.
Nitrogen introduced in the amount of 0.1 mg per ml into the nutrient medium of pH 7.0 inhibited the growth o f eight strains by 22-76%, i.e. 49% on the average, whereas it inhibited the activity of dehydrogenases by 62% on the average. Introduction o f 2, 5 and 10 mg o f N per ml o f the nutrient medium led to a decrease in the growth intensity of the strains under study by 73,91 and 94% respectively.
The symbiotic activity of the strains under study was checked in a vegetative pot experiment carried out on soil with a pH 5.6 developed from slightly o f loamy sand
containing in 100 g 50.8 mg of total N and settled by the Rhizobium leguminosarum
strain active for faba beans.
Nitrogen introduced in the amount of 0.560 and 1.120 g per 7 kg of this soil distinctly inhibited the settling of rot nodules on faba beans. The yield of nodules of non-inoculated plants infected with the strain occurring in soil decreased in relation to the yield from non-fertilized soil, depending on the N dose, by 60 and 96%, respectively. Inoculation of faba bean seeds cultivated on ihe soil fertilized with 0.560 g N per pot increased the yield of nodules by 217%, on the average.
Soil fertilization with nitrogen led to a decrease o f the number of pods and of the seed yield of'faba beans by 11.5 and 29.0%, respectively. Plants inoculated with the seven strains under the study gave a mean yield o f faba bean seeds 13.5% higher in relation to the yield of plants inoculated with the strain living in the soil. On the other hand, two among the strains decreased it by about 11%. The reaction of plants inoculated with Rhizobium depended on the activity of strains and their resistance to soil conditions.
Doc. dr hab. Anna Strzelec Osada Pałacow a-IU N G 24-100 Puławy
