Achiralna wysokosprawna chromatografia cieczowa

Kolejnym ważnym krokiem badawczym było przeanalizowanie dynamiki procesu polikondensacji kwasu Z-mlekowego, ze względu na jego szczególne znaczenie biologiczne.

Do badań zastosowano wysokosprawną chromatografię cieczową z trzema różnymi rodzajami detekcji z: matrycą fotodiodową (HPLC-DAD), z detektorem rozproszenia światła (ELSD) oraz ze spektrometrią mas (MS). Wyniki otrzymane przy użyciu detektora ELSD (rysunek 45 c i 46c) są w pewnym sensie lepszymi wskaźnikami dynamiki układu aniżeli wyniki otrzymane przy użyciu detektora DAD. ELSD jest bowiem detektorem uniwersalnym, dla którego intensywność sygnału jest proporcjonalna do masy cząsteczkowej analitu. Detektor DAD funkcjonuje na zasadzie absorpcji promieniowania UV. Kwas mlekowy i jego możliwe produkty polikondensacji przeważnie nie posiadają grup chromoforowych absorbujących promieniowanie UV, jednakże detektor DAD może również reagować na różnice współczynnika załamania światła związków obecnych w wycieku z kolumny chromatograficznej. Obiektem badań były świeżo sporządzone roztwory kwasu L - mlekowego w czystym acetonitrylu i w dwuskładnikowym rozpuszczalniku etanolowo- wodnym (7:3, v/v), które następnie przechowywano przez okres 900 minut (ACN) oraz 400 minut (70% EtOH) w temperaturze 22°C, w szczelnie zamkniętych szklanych fiolkach.

Na rysunku 45 przedstawiono chromatogramy kwasu L-mlekowego rozpuszczonego w czystym acetonitrylu, które zostały zarejestrowane dla świeżo sporządzonej próbki oraz dla próbki przechowywanej odpowiednio przez okres 0, 170 i 750 minut. Rysunek 46 przedstawia chromatogramy dla próbki kwasu Z,-mlekowego rozpuszczonego w 70%

wodnym roztworze etanolu i przechowywanego przez okres 0, 70 i 80 minut. Zaprezentowane chromatogramy zostały zarejestrowane przy użyciu detektorów DAD oraz ELSD.

Chromatogramy kwasu Z-mlekowego rozpuszczonego w mieszaninie dwuskładnikowej etanol-woda (7:3, v/v) zarejestrowane przy długościach fali 220 i 250 nm przy użyciu detektora DAD oraz ELSD przedstawiają zadowalający, lecz niepełny rozdział (nie zawsze do lini podstawowej). Wysokości pików chromatograficznych uznano za proporcjonalne do stężeń poszczególnych rozdzielonych indywiduów chemicznych.

W przypadku próbki, w której rozpuszczalnikiem był acetonitryl można zauważyć brak pełnego rozdziału pasm pomimo zastosowania tego samego układu chromatograficznego, co w przypadku próbki rozpuszczonej w 70% etanolu. Chromatogramy dla kwasu Z,-mlekowego

rozpuszczonego w acetonitrylu oraz w rozpuszczalniku etanolowo-wodnym, stanowiące swoiste „odciski palca”, znacząco różnią się między sobą. Obserwowane rozbieżności prawdopodobnie wynikają z różnych zdolności do tworzenia wiązania wodorowego pomiędzy acetonitrylem a kwasem mlekowym z jednej strony oraz 70% etanolem a kwasem mlekowym z drugiej. Ze względu na większą tendencję do tworzenia się wiązań wodorowych między wodą i etanolem a kwasem mlekowym niż między acetonitrylem a kwasem mlekowym na chromatogramach tych pierwszych roztworów można zaobserwować profile stężeniowe bogatsze w piki rozdzielonych produktów kondensacji. Jednakże zastosowane w chromatograficznym eksperymencie warunki nie pozwalają na pełny rozdział różnorodnych rodzajów oligomerów.

(a)

(b)

(c)

R eten tion tim e [min]

Rys.45. Chromatograficzne profile stężeniowe kwasu L-mlekowego rozpuszczonego w ACN w temperaturze 22±1°C dla czasu przechowywania 0, 170, i 750 min, zarejestrowane przy użyciu detektora DAD o długości fali (a) 220 nm, (b) 250 nm, i (c) detektora ELSD.

(a)

(b)

(c)

R etention tim e [mln]

Rys.46. Chromatograficzne profile stężeniowe kwasu L-mlekowego rozpuszczonego w 70% EtOH w temperaturze 22±1°C dla czasu przechowywania 0, 70, i 80 min, zarejestrowane przy użyciu detektora DAD o długości fali (a) 220 nm, (b) 250 nm, i (c) detektora ELSD.

W celu wizualizacji zmian, zachodzących w roztworze kwasu L-mlekowego rozpuszczonego w acetonitrylu i 70% etanolu, sporządzono wykresy przedstawiające zależność wysokości pików w funkcji czasu (rysunki 47 i 48).

Pik kwasu mlekowego rozpuszczonego w acetonitrylu oraz produkt jego starzenia zarejestrowane przy użyciu detektora DAD przy długościach fali 220 i 250 nm (rysunkiu 47a i 47b) miały czasy retencji odpowiednio 4.61 min. oraz 5.26 min. Te same piki zarejestrowane przy użyciu detektora ELSD na rysunku 47c plasują się przy czasach retencji odpowiednio 5.07 i 5.57min. Różnice w czasach retencji są spowodowane szeregowym połączeniem detektorów DAD i ELSD.

Krzywa opisująca zmianę wysokości piku o czasie retencji ^/r= 5 . 2 6 min (DAD) oraz

?r= 5 . 5 7 min (ELSD) na rysunku 47a-c pomiędzy 360 a 460 minutą przechowywania próbki

ulega gwałtownemu obniżeniu, a amplituda oscylacji zmniejsza się. Obserwowane zjawisko można przypisać tymczasowemu „zaniknięciu” produktu oligomeryzacji ze środowiska reakcji albo poprzez dysocjację oligomeru do niższych indywiduów, lub poprzez utworzenie wyższych oligomerów.

(a)

(b)

Time [mln]

40

35 -

30

25

20

15

-200 ^{400 600}

Time [mln)

800 1000

(C)

Rys.47. Oscylacyjne zmiany wysokości pików dla próbki kwasu L-mlekowego rozpuszczonego w ACN i przechowywanej temperaturze 22°C. (a) Detektor DAD, długość fali X = 220 nm; (b) detektor DAD, długość fali X = 250 nm; (c) detektor ELSD. Krzywe na wykresach (a) i (b) dotyczą pików o czasach retencji = 4.61 i 5.26 min. Krzywe na wykresie (c) dotyczą pików o czasach retencji tR = 5.07 i 5.57 min.

Time [mln]

(a)

(c)

T im e [min]

Rys.48 zmiany wysokości pików dla próbki kwasu L-mlekowego rozpuszczonego w 70% EtOH i przechowywanej temperaturze 22°C. (a) detektor DAD, długość fali X = 220 nm; (b) detektor DAD, długość fali A = 250 nm; (c) detektor ELSD. Krzywe na wykresach (a) i (b) ) dotyczą pików o czasach retencji /R, = 4.85, 5.01, 5.36 i 5.53 min; krzywe na wykresie (c) dotyczą pików o czasach retencji fR= 5.07, 5.20, 5.38, i 5.42 min.

Aby ocenić, czy krzywe przedstawione na rysunku 47 zawierają istotny i periodycznie pojawiający się składnik, użyto szybkiej transformacji Fouriera do skonstruowania widm mocy. Każde z wygenerowanych widm mocy wykazuje bardzo wysoki pik przy zerowej częstotliwości, ale piki te zostały usunięte z odpowiednich wykresów. Przykładowe widmo mocy wygenerowane dla danych z rysunku 47b zostało przedstawione na rysunku 49. Dwa najwyższe piki pojawiają się tu w okolicach częstotliwości równej 0,01 min'1, co oznacza okresowość reakcji równą około 100 minut.

Frequency (min'1)

Rys.49. Widmo mocy obliczone dla serii zmiennych wysokości piku chromatograficznego o czasie retencji tK = 4.61 min dla kwasu Z,-mlekowego rozpuszczonego w acetonitrylu. Pik został zarejestrowany przy pomocy detektora DAD przy długości fali X = 250 nm.

Przykładowe widma mocy analogiczne wygenerowane dla danych graficznie przedstawionych na rysunku 48 zostały przedstawione na rysunku 50. Udało się na ich podstawie ustalić, że okresowość reakcji w przypadku rozpuszczalnika etanolowo-wodnego wynosi około 30 minut.

F r e q u e n c y (m in '1)

(a)

(b)

F re q u e n c y (m ln'1)

(c)

F re q u e n c y (m ln'1)

F re q u e n c y (m in'1)

Fig.50. Widma mocy obliczone dla serii zmiennych wysokości pików chromatograficznych kwasu /--mlekowego rozpuszczonego w 70% etanolu przy rejestracji (a) i (b) detektorem DAD o długości fali X = 250 nm, (c) i (d), detektorem ELSD. Czasy retencji odpowiednich pików: /R = (a) 5.36 min, (b) 5.53 min, (c) 5.38 i (d) 5.42 min.

Najwyższy pik na rysunku 50a znajduje się przy częstotliwości 0.035 min'1.

Częstotliwość ta odpowiada w przybliżeniu powtarzalności okresowej około 30 minut, którą można zaobserwować dla piku o czasie retencji ^/r= 5 . 3 6 min na rysunku 48b. Widmo mocy dla piku o czasie retencji fo=5.53 min (rys.50b) również znajduje się przy częstotliwości 0.035 min'1, chociaż najwyższy pik na wykresie mocy znajduje się przy częstotliwości 0.005 min'1. Rysunki 50c i 50d mają swoje maksima także przy częstotliwości około 0.035 min'1.

Rysunek 51 przedstawia spektrochromatogramy świeżo przygotowanych próbek kwasu mlekowego, rozpuszczonych odpowiednio w acetonitrylu (rys.51a) i 70% etanolu (rys.51c) oraz spektrochromatogramy próbek, które przechowywano przez okres 980 minut w acetonitrylu (rys.51b) i 400 minut w 70% etanolu (rys.51d).

E

1....

QJ

♦ 5E

e

[UIU] t

46

9 T m n i tnRiinifirnitnft

s

retention time No] retention time Imin]

Wyniki przedstawione na rysunku 51 świadczą o istotnych zmianach w składzie roztworów, zachodzących po kilku godzinach ich przechowywania. W próbce kwasu mlekowego rozpuszczonego w dwuskładnikowym rozpuszczalniku etanol-woda (7:3, v/v) widoczne jest pojawienie się większej liczby struktur o podwyższonych czasach retencji względem wyjściowego kwasu L-mlekowego, co świadczy o ich wyższych masach cząsteczkowych (Rys.51(d)).