Adsorpcja

Immobilizacja następuje w wyniku kontaktu wodnego roztworu enzymu z nośnikiem. Po odmyciu nie zaadsorbowanego enzymu, preparat immobilizowanego biokatalizatora jest gotowy do użycia. Enzym można immobilizować w sposób statyczny. Nośnik wprowadza się do wodnego roztworu enzymu i pozostawia na pewien czas bez mieszania. Immobilizacja następuje dzięki samorzutnej dyfuzji enzymu do powierzchni nośnika, a potem adsorpcji. Bardziej wydajny proces zapewniający równomierne zapełnienie powierzchni nośnika zaadsorbowanym enzymem to adsorpcja z mieszaniem. Nośnik zawiesza się w roztworze enzymu i poddaje ciągłemu mieszaniu za pomocą mieszadła albo na wytrząsarce. Innym sposobem jest elektroosadzanie enzymu

na nośniku – w roztworze enzymu zanurza się dwie elektrody, a na powierzchni jednej z nich umieszcza się warstwę nośnika. Po włączeniu prądu cząsteczki enzymu o odpowiednim ładunku przemieszczają się w roztworze, w kierunku elektrody z nośnikiem i osadzają się na jego powierzchni. W przypadku preparatów wykorzystywanych przemysłowo enzym adsorbuje się metodą nanoszenia na kolumnie. Przez kolumnę wypełnioną nośnikiem tworzącym upakowane złoże, przy użyciu pompy w kierunku z góry w dół przepuszcza się roztwór enzymu w warunkach ciągłej cyrkulacji. Sposób ten ma tę zaletę, że umożliwia nanoszenie enzymu, przemywanie preparatu, a następnie prowadzenie procesu enzymatycznego w tej samej kolumnie bez dodatkowych manipulacji [116-119].

Metodą adsorpcji immobilizowano między innymi trypsynę na kopolimerze styrenu i metakrylanu 2-hydroksyetylu [129]. Inwertazę i glukoamylazę immobilizowano wewnątrz alginianu sodu, przy czym inwertaza była zamykana w kapsułkach [130], a glukoamylaza we włóknach [131].

Utrzymywanie zaadsorbowanej cząsteczki enzymu na powierzchni nośnika zapewniają niespecyficzne oddziaływania van der Waalsa, oddziaływania elektrostatyczne, wiązania wodorowe i oddziaływania hydrofobowe między nośnikiem a grupami na powierzchni białka. Oddziaływania mogą być na tyle silne, że adsorpcji towarzyszyć będzie zniszczenie struktury biokatalizatora.

Przebieg procesu adsorpcji i trwałość połączenia enzymu z nośnikiem w znacznym stopniu są zależne od warunków przeprowadzenia immobilizacji. Adsorpcję enzymu warunkują głównie:

• powierzchnia właściwa i porowatość nośnika, • wartość pH,

• siła jonowa roztworu,

• stężenie enzymu w roztworze, • temperatura prowadzenia procesu.

Pojemność adsorpcyjna nośnika jest proporcjonalna do jego powierzchni właściwej. W odniesieniu do enzymów o prawidłowości tej można mówić tylko w tym przypadku, gdy nośnik jest nieporowaty lub średnica porów jest o wiele większa niż wymiary cząsteczek białka. Jeżeli jednak pory nośnika są małe, tak że

cząsteczki enzymu nie mogą się w nich zmieścić, wówczas dla białka dostępna jest tylko część powierzchni, a więc pojemność adsorpcyjna nośnika względem enzymu jest niewielka.

Duży wpływ na wydajność adsorpcji enzymu na powierzchni nośnika wywiera odczyn środowiska, zwłaszcza jeżeli adsorpcja zachodzi głównie dzięki oddziaływaniom elektrostatycznym. Na nośnikach nie będących wymieniaczami jonowymi, maksymalną adsorpcję osiąga się zwykle w punkcie izoelektrycznym białka.

Wartość siły jonowej wpływa na trwałość połączenia enzymu z nośnikiem. Przy dużym stężeniu soli, obecne w roztworze jony wypierają z powierzchni nośnika cząsteczki białka przyłączone dzięki oddziaływaniom elektrostatycznym. Zwiększenie siły jonowej powoduje desorpcję enzymu.

Zwiększanie stężenia enzymu w roztworze, z którego następuje adsorpcja, powoduje, że zwiększa się ilość enzymu zaadsorbowanego na nośniku i wzrasta katalityczna aktywność właściwa immobilizowanego preparatu. Liczba miejsc przyłączania enzymu na powierzchni nośnika jest jednak ograniczona, a ponadto miejsca te wykazują niejednakowe powinowactwo względem białka. Następstwem dalszego zwiększania stężenia enzymu w roztworze może być to, że na pierwszej warstwie zaadsorbowanego enzymu mogą się tworzyć druga i dalsze warstwy. Największą aktywność katalityczną będą wykazywać zewnętrzne warstwy zaadsorbowanego enzymu, w których dyfuzja substratu w najmniejszym stopniu będzie ograniczać szybkość reakcji. „Przeładowanie” nośnika enzymem powoduje, że głębiej umieszczone warstwy zaadsorbowanego biokatalizatora są wyeliminowane ze strefy reakcji i w rezultacie ogólna efektywność działania preparatu zmniejsza się.

Podwyższenie temperatury wywiera dwojaki wpływ na proces adsorpcji enzymów na nośniku. Silne ogrzewanie prowadzi do utraty aktywności enzymu w wyniku termicznej denaturacji cząsteczki białka, ale z drugiej strony proces adsorpcji ulega przyspieszeniu, ponieważ zwiększa się szybkość dyfuzji cząsteczek enzymu do porów nośnika. Wartość optymalnej temperatury zależy od charakteru adsorbowanego enzymu i powierzchni nośnika [119].

Istnieje kilka sposobów zwiększenia efektywności łączenia się enzymu z nośnikiem. Jednym z nich jest immobilizacja na nośnikach wstępnie

modyfikowanych. Wstępna modyfikacja nośnika powoduje w wielu przypadkach znaczne zwiększenie trwałości przyłączenia enzymu, a także niekiedy poprawę właściwości katalitycznych białka dzięki utworzeniu bardziej korzystnego mikrośrodowiska. Nośnik można zmodyfikować poprzez traktowanie jonami metali (np. Ti, Sn, Zr, V, Fe), traktowanie substancjami, których cząsteczki zawierają dużą liczbę grup funkcyjnych, zdolnych do oddziaływania z grupami na powierzchni cząsteczki enzymu dzięki wiązaniom elektrostatycznym i wodorowym, traktowanie substancjami hydrofobowymi, zaadsorbowanie pojedynczej warstwy lipidu lub kowalencyjne przyłączenie do powierzchni nośnika cząsteczek będących specyficznymi ligandami immobilizowanego enzymu (adsorpcja afinitywna). Innym sposobem zwiększenia efektywności łączenia się enzymu z nośnikiem jest immobilizacja wstępnie modyfikowanych enzymów [122].

Enzymy immobilizowane metodą adsorpcji są podatne na wymywanie z nośnika podczas wielokrotnego użycia. Jednym ze sposobów zapobiegających wymywaniu jest sieciowanie warstwy zaadsorbowanego enzymu odczynnikiem dwufunkcyjnym. W rezultacie na powierzchni nośnika powstaje jednolita błonka złożona z usieciowanych wzajemnie cząsteczek enzymu. Jako czynnik sieciujący stosuje się najczęściej aldehyd glutarowy [132-134]. Aldehyd glutarowy reaguje gwałtownie z grupami aminowymi w środowisku obojętnym, przy czym w reakcji uczestniczą grupy ε-aminowe reszt lizylowych białka. Większość białek zawiera w swoim składzie wiele reszt lizylowych, są one umieszczone na powierzchni i nie uczestniczą w procesach katalizy. Z tego względu sieciowanie białek aldehydem glutarowym nie niszczy konformacji biokatalizatora i w rezultacie nie powinno obniżać jego aktywności katalitycznej [135]. W środowisku kwasowym i obojętnym aldehyd glutarowy jest mieszaniną liniowego związku, cyklicznego hemiacetalu i cyklicznego oligomeru (rysunek 14). Każda z tych form może reagować z grupami ε-aminowymi reszt lizylowych białka.

Rysunek 14 Reakcje aldehydu glutarowego z białkami w środowisku kwasowym i zasadowym

[135]

Sieciowanie aldehydem glutarowym w łagodnych warunkach, w temperaturze pokojowej i w pH 7 pozwala na aktywację pierwszorzędowych grup aminowych zarówno nośnika, jak i białka za pomocą tylko jednej cząsteczki aldehydu glutarowego [136].

Adsorpcja enzymów na nośnikach jest powszechnie stosowaną metodą ze względu na dostępność i stosunkowo niską cenę adsorbentów oraz na prostotę używanych procedur unieruchamiania. Adsorpcja często wiąże się z jednoczesnym oczyszczaniem enzymu, ponieważ łączenie się białka z nośnikiem jest w wielu przypadkach dość specyficzne. Otrzymywane preparaty charakteryzują się jednak małą trwałością, ze względu wymywanie biokatalizatora z preparatu [116-119].