Immobilizacja inwertazy

3.6.1 „Ssanie” na nośnikachTH8, TH8-NH2 i TG8-NH2

Przygotowano roztwór inwertazy o stężeniu 5 mg/ cm³ w 0,1M buforze fosforanowym o pH 7,0. Na 25 cm³ nośnika dawano po 25 cm³ roztworu enzymu.

Przed immobilizacją wszystkie nośniki zostały umieszczone w termostatowanych reaktorach i były inkubowane w temperaturze 50ºC (temperatura powyżej VPTT nośników). Roztwór inwertazy inkubowano w temperaturze 50ºC przez 15 minut, a następnie dodano do skurczonych nośników.

Proces immobilizacji prowadzono w temperaturze 50ºC przez 15 minut, a następnie wszystkie reaktory ochłodzono i dalej immobilizację prowadzono w temperaturze 4ºC przez 1 godzinę. Po skończonej reakcji wszystkie nośniki podzielono na cztery części i odessano roztwór enzymu. Eluaty zostały zebrane w celu oznaczenia stężenia białka i jego aktywności po reakcji.

Kolejnym etapem było sieciowanie aldehydem glutarowym. Przygotowano roztwory aldehydu 0,5; 1,0 i 2,5% w 0,1M buforze fosforanowym, pH 7,0. Następnie do trzech części każdego nośnika dodano odpowiednie roztwory aldehydu, a do czwartej części dodano 0,1M bufor fosforanowy o pH 7,0. Po 15 minutach reakcji wszystkie nośniki przemyto trzykrotnie 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0. Aby zapobiec dalszemu sieciowaniu wszystkie nośniki zawieszono w 0,5M buforze Tris-HCl o pH 8,0. Tak przygotowane nośniki przechowywano w temperaturze 4ºC.

Stężenie zaimmobilizowanego enzymu oraz jego teoretyczną aktywność obliczono na podstawie stężenia i aktywności białka użytego do immobilizacji oraz stężenia i aktywności białka pozostałego po immobilizacji. W ten sposób wyznaczono bilans masy i aktywności inwertazy.

Wydajność immobilizacji obliczono zarówno dla ilości związanego białka, jak i jego aktywności według następujących wzorów:

Wydajność [%] (białko)=(Cbiałko związane [mg/cm³] / Cbiałko wyjściowe [mg/cm³])*100

gdzie: Cbiałko związane – stężenie białka w preparacie po immobilizacji [mg/cm³], Cbiałko wyjściowe – stężenie białka danego do immobilizacji [mg/cm³].

Wydajność [%] (aktywność)=(Akt_{immobilizowany enzym} [U/cm3] / Akt_oczekiwana [U/cm3])*100

gdzie: Akt immobilizowany enzym – aktywność preparatu z immobilizowanym enzymem [U/cm³], Akt oczekiwana – teoretyczna aktywność preparatu z immobilizowaym enzymem [U/cm³].

3.6.2 „Ssanie” na nośniku T8

Przygotowano roztwór inwertazy o stężeniu 5 mg/ cm³ w 0,1M buforze fosforanowym o pH 7,0. Na 20 cm³ nośnika dawano po 20 cm³ roztworu enzymu.

Przed immobilizacją wszystkie nośniki zostały umieszczone w termostatowanych reaktorach i były inkubowane w temperaturze 50ºC (temperatura powyżej VPTT nośników). Roztwór inwertazy inkubowano w temperaturze 50ºC przez 15 minut, a następnie dodano do skurczonych nośników.

Proces immobilizacji prowadzono w temperaturze 50ºC przez 15 minut, a następnie wszystkie reaktory ochłodzono i dalej immobilizację prowadzono w temperaturze 4ºC przez 1 godzinę. Po skończonej reakcji wszystkie nośniki podzielono na cztery części i odessano roztwór enzymu.

Kolejnym etapem było sieciowanie aldehydem glutarowym. Przygotowano roztwory aldehydu 0,5; 1,0 i 2,5% w 0,1M buforze fosforanowym, pH 7,0. Następnie do trzech części każdego nośnika dodano odpowiednie roztwory aldehydu, a do czwartej części dodano 0,1M bufor fosforanowy o pH 7,0. Po 15 minutach reakcji wszystkie nośniki przemyto trzykrotnie 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0. Aby zapobiec dalszemu sieciowaniu wszystkie nośniki zawieszono w 0,5M buforze Tris-HCl o pH 8,0. Tak przygotowane nośniki przechowywano w temperaturze 4ºC.

3.6.3 Immobilizacja kowalencyjna na nośnikach z grupami aminowymi:

TAEMA, TG8-NH2 i TH8-NH2

5 cm³ spęcznionych nośników przemyto wodą destylowaną i 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0. W celu aktywacji grup aminowych nośniki zawieszono w 10 cm³ 2,5% roztworu aldehydu glutarowego w 0,1M buforze fosforanowym o pH 7,0 i mieszano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie odmyto nadmiar aldehydu wodą i 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0.

Kolejnym etapem była immobilizacja białka. Przygotowano roztwór inwertazy o stężeniu 5 mg/ cm³ w 0,1M buforze fosforanowym o pH 7,0. Nośniki zawieszono w 10 cm³ roztworu enzymu i proces immobilizacji prowadzono przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przeniesiono próbki do lodówki i zostawiono na 24 godziny.

Nadmiar białka, które nie uległo immobilizacji odmyto kolejno: 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0; 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0 z 0,5M NaCl; 0,05M buforem octanowym o pH 5,2. W celu zablokowania nieprzereagowanych aktywnych grup funkcyjnych nośniki zawieszono w 0,5M buforze Tris-HCl o pH 8,0 i wstawiono do lodówki na 24 godziny.

Stężenie zaimmobilizowanego enzymu oraz jego teoretyczną aktywność obliczono analogicznie jak to opisano w paragrafie 3.6.1.

3.6.4 Immobilizacja kowalencyjna na nośniku z grupami hydroksylowymi: TH8

5 cm³ spęcznionych nośników przemyto wodą destylowaną i 1M roztworem węglanu sodu o pH 11. Do aktywacji grup hydroksylowych wykorzystano metodę opisaną w [109]. 1 cm³ diwinylosulfonu dodano kroplami do nośnika zawieszonego w 10 cm³ 1M roztworu węglanu sodu o pH 11 i mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie odmyto nadmiar aktywatora wodą i 0,1M roztworem Na2HPO4 z H3PO4 o pH 8,4.

Kolejnym etapem była immobilizacja białka. Przygotowano roztwór inwertazy o stężeniu 5 mg/ cm³ w 0,1M roztworze Na2HPO4 z H3PO4 o pH 8,4. Nośniki zawieszono w 10 cm³ roztworu enzymu i proces immobilizacji prowadzono przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przeniesiono próbki do lodówki i zostawiono na 24 godziny.

Nadmiar białka, które nie uległo immobilizacji odmyto według schematu opisanego w paragrafie 3.6.3.

Stężenie zaimmobilizowanego enzymu oraz jego teoretyczną aktywność obliczono analogicznie jak to opisano w paragrafie 3.6.1.

3.6.5 Immobilizacja kowalencyjna na nośniku z grupami karboksylowymi: TMA

5 cm³ spęcznionych nośników przemyto wodą destylowaną i 0,05M buforem octanowym o pH 5,2. W celu aktywacji grup karboksylowych nośniki zawieszono w 10 cm³ 0,3% roztworu karbodiimidu w 0,05M buforze octanowym o pH 5,2 i mieszano przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Następnie odmyto nadmiar karbodiimidu wodą i 0,05M buforem octanowym o pH 5,2.

Kolejnym etapem była immobilizacja białka. Przygotowano roztwór inwertazy o stężeniu 5 mg/ cm³ w 0,05M buforze octanowym o pH 5,2. Nośniki zawieszono w 10 cm³ roztworu enzymu i proces immobilizacji prowadzono przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przeniesiono próbki do lodówki i zostawiono na 24 godziny.

Nadmiar białka, które nie uległo immobilizacji odmyto według schematu opisanego w paragrafie 3.6.3.

Stężenie zaimmobilizowanego enzymu oraz jego teoretyczną aktywność obliczono analogicznie jak to opisano w paragrafie 3.6.1.

3.6.6 Immobilizacja kowalencyjna na nośniku z grupami epoksydowymi: TG8

5 cm3 spęcznionych nośników przemyto wodą destylowaną i 0,1M roztworem Na2HPO4 z H3PO4 o pH 8,4.

Kolejnym etapem była immobilizacja białka. Przygotowano roztwór inwertazy o stężeniu 5 mg/ cm³ w 0,1M roztworze Na2HPO4 z H3PO4 o pH 8,4. Nośniki zawieszono w 10 cm³ roztworu enzymu i proces immobilizacji prowadzono przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie przeniesiono próbki do lodówki i zostawiono na 24 godziny.

Nadmiar białka, które nie uległo immobilizacji odmyto według schematu opisanego w paragrafie 3.6.3.

Stężenie zaimmobilizowanego enzymu oraz jego teoretyczną aktywność obliczono analogicznie jak to opisano w paragrafie 3.6.1.