Immobilizacja glukoamylazy

3.7.1 „Ssanie” na nośnikach TH8, TH8-NH2 i TG8-NH2

Przygotowano roztwór enzymu:16 cm³ glukoamylazy (Novo 2) dopełnione do 80 cm³ 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0. Do immobilizacji dawano po 25 cm³ roztworu enzymu na 25 cm³ nośnika.

Przed immobilizacją wszystkie nośniki zostały umieszczone w termostatowanych reaktorach i były inkubowane w temperaturze 50ºC (temperatura powyżej VPTT nośników). Roztwór glukoamylazy inkubowano w temperaturze 50ºC przez 15 minut, a następnie dodano do skurczonych nośników.

Proces immobilizacji prowadzono w temperaturze 50ºC przez 15 minut, a następnie wszystkie reaktory ochłodzono i dalej immobilizację prowadzono w temperaturze 4ºC przez 1 godzinę. Po skończonej reakcji wszystkie nośniki podzielono na cztery części i odessano roztwór enzymu. Eluaty zostały zebrane w celu oznaczenia stężenia białka i jego aktywności po reakcji.

Kolejnym etapem było sieciowanie aldehydem glutarowym. Przygotowano roztwory aldehydu 0,5; 1,0 i 2,5% w 0,1M buforze fosforanowym, pH 7,0. Następnie do trzech części każdego nośnika dodano odpowiednie roztwory aldehydu, a do czwartej części dodano 0,1M bufor fosforanowy o pH 7,0. Po 15 minutach reakcji wszystkie nośniki przemyto trzykrotnie 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0. Aby zapobiec dalszemu sieciowaniu wszystkie nośniki zawieszono w 0,5M buforze Tris-HCl o pH 8,0. Tak przygotowane nośniki przechowywano w temperaturze 4ºC.

Stężenie zaimmobilizowanego enzymu oraz jego teoretyczną aktywność obliczono analogicznie jak to opisano w paragrafie 3.6.1.

3.7.2 „Ssanie” na nośniku THN

Przygotowano roztwór enzymu: 22 cm³ glukoamylazy (Novo 2) dopełnione do 100 cm³ 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0. Do immobilizacji dawano po 25 cm³ roztworu enzymu na 25 cm³ nośnika.

Przed immobilizacją wszystkie nośniki zostały umieszczone w termostatowanych reaktorach i były inkubowane w temperaturze 50ºC

(temperatura powyżej VPTT nośników). Roztwór glukoamylazy inkubowano w temperaturze 50ºC przez 15 minut, a następnie dodano do skurczonych nośników.

Proces immobilizacji prowadzono w temperaturze 50ºC przez 15 minut, a następnie wszystkie reaktory ochłodzono i dalej immobilizację prowadzono w temperaturze 4ºC przez 1 godzinę. Po skończonej reakcji wszystkie nośniki podzielono na cztery części i odessano roztwór enzymu. Eluaty zostały zebrane w celu oznaczenia stężenia białka i jego aktywności po reakcji.

Kolejnym etapem było sieciowanie aldehydem glutarowym. Przygotowano roztwory aldehydu 0,5; 1,0 i 2,5% w 0,1M buforze fosforanowym, pH 7,0. Następnie do trzech części każdego nośnika dodano odpowiednie roztwory aldehydu, a do czwartej części dodano 0,1M bufor fosforanowy o pH 7,0. Po 15 minutach reakcji wszystkie nośniki przemyto trzykrotnie 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0. Aby zapobiec dalszemu sieciowaniu wszystkie nośniki zawieszono w 0,5M buforze Tris-HCl o pH 8,0. Tak przygotowane nośniki przechowywano w temperaturze 4ºC.

3.7.3 „Ssanie” na nośniku T8

Przygotowano roztwór glukoamylazy: 11 cm³ enzymu (Novo 2) w 39 cm³ 0,1M buforu fosforanowego o pH 7,0. Na 20 cm³ nośnika dawano po 20 cm³ roztworu enzymu.

Przed immobilizacją wszystkie nośniki zostały umieszczone w termostatowanych reaktorach i były inkubowane w temperaturze 50ºC (temperatura powyżej VPTT nośników). Roztwór glukoamylazy inkubowano w temperaturze 50ºC przez 15 minut, a następnie dodano do skurczonych nośników.

Proces immobilizacji prowadzono w temperaturze 50ºC przez 15 minut, a następnie wszystkie reaktory ochłodzono i dalej immobilizację prowadzono w temperaturze 4ºC przez 1 godzinę. Po skończonej reakcji wszystkie nośniki podzielono na cztery części i odessano roztwór enzymu.

Kolejnym etapem było sieciowanie aldehydem glutarowym. Przygotowano roztwory aldehydu 0,5; 1,0 i 2,5% w 0,1M buforze fosforanowym, pH 7,0. Następnie do trzech części każdego nośnika dodano odpowiednie

roztwory aldehydu, a do czwartej części dodano 0,1M bufor fosforanowy o pH 7,0. Po 15 minutach reakcji wszystkie nośniki przemyto trzykrotnie 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0. Aby zapobiec dalszemu sieciowaniu wszystkie nośniki zawieszono w 0,5M buforze Tris-HCl o pH 8,0. Tak przygotowane nośniki przechowywano w temperaturze 4ºC.

3.7.4 Immobilizacja kowalencyjna na nośniku z grupami epoksydowymi – dobór warunków reakcji

12 próbek nośnika TG8 przemyto wodą i następującymi roztworami buforów: 0,1M buforem fosforanowym o pH 7,0; 1,0M buforem fosforanowym o pH 7,0; 0,1M buforem fosforanowym o pH 8,0; 1,0M buforem fosforanowym o pH 8,0; 0,1M buforem węglanowym o pH 9,0 i 1,0M buforem węglanowym o pH 9,0. W celu zbadania wpływu temperatury na immobilizację, połowę próbek aktywowano w temperaturze 5ºC, a pozostałe 6 próbek w temperaturze 45ºC.

Przygotowano roztwory glukoamylazy: 9 cm³ białka rozpuszczono w 27 cm³ odpowiedniego buforu i inkubowano w temperaturze 5 lub 45ºC. Na 7 cm³ nośnika dawano po 15 cm³ roztworu enzymu. Proces immobilizacji prowadzono w temperaturze 5 lub 45ºC przez 2 godziny, a następnie nośniki przeniesiono z termostatowanych reaktorów na kolumny i odmywano nadmiar białka. Jako pierwszego buforu użyto 0,1M buforu o odpowiednim pH, następnie nośniki przemywano 0,1M buforem o odpowiednim pH z 0,5M NaCl. Eluaty zostały zebrane w celu oznaczenia stężenia białka i jego aktywności po reakcji. Na koniec nośniki przemyto 0,05M buforem octanowym o pH 4,5 i zawieszono w 0,5M buforze Tris-HCl o pH 8,0 w celu zablokowania nieprzereagowanych grup epoksydowych. Tak przygotowane nośniki przechowywano w temperaturze 4ºC.

3.7.5 Immobilizacja kowalencyjna na nośnikach z grupami aminowymi:

TAEMA, TG8-NH2 i TH8-NH2

Aktywację nośnika i immobilizację glukoamylazy przeprowadzono identycznie jak to opisano w paragrafie 3.6.3.

Białko użyte do immobilizacji przygotowano następująco: 1 cm³ roztworu glukoamylazy rozpuszczono w 13 cm³ 0,1M buforu fosforanowego o pH 7,0.

Nadmiar białka, które nie uległo immobilizacji odmyto według schematu opisanego w paragrafie 3.6.3.

Stężenie zaimmobilizowanego enzymu oraz jego teoretyczną aktywność obliczono analogicznie jak to opisano w paragrafie 3.6.1.

3.7.6 Immobilizacja kowalencyjna na nośniku z grupami hydroksylowymi: TH8

Aktywację nośnika i immobilizację glukoamylazy przeprowadzono identycznie jak to opisano w paragrafie 3.6.4.

Białko użyte do immobilizacji przygotowano następująco: 1 cm3 roztworu glukoamylazy rozpuszczono w 13 cm3 0,1M roztworu Na2HPO4 z H3PO4 o pH 8,4.

Nadmiar białka, które nie uległo immobilizacji odmyto według schematu opisanego w paragrafie 3.6.3.

Stężenie zaimmobilizowanego enzymu oraz jego teoretyczną aktywność obliczono analogicznie jak to opisano w paragrafie 3.6.1.

3.7.7 Immobilizacja kowalencyjna na nośniku z grupami karboksylowymi: TMA

Aktywację nośnika i immobilizację glukoamylazy przeprowadzono identycznie jak to opisano w paragrafie 3.6.5.

Białko użyte do immobilizacji przygotowano następująco: 1 cm³ roztworu glukoamylazy rozpuszczono w 13 cm³ 0,05M buforu octanowego o pH 5,2.

Nadmiar białka, które nie uległo immobilizacji odmyto według schematu opisanego w paragrafie 3.6.3.

Stężenie zaimmobilizowanego enzymu oraz jego teoretyczną aktywność obliczono analogicznie jak to opisano w paragrafie 3.6.1.

3.7.8 Immobilizacja kowalencyjna na nośniku z grupami epoksydowymi: TG8

Aktywację nośnika i immobilizację glukoamylazy przeprowadzono identycznie jak to opisano w paragrafie 3.6.6.

Białko użyte do immobilizacji przygotowano następująco: 1 cm³ roztworu glukoamylazy rozpuszczono w 13 cm³ 0,1M roztworu Na2HPO4 z H3PO4 o pH 8,4.

Nadmiar białka, które nie uległo immobilizacji odmyto według schematu opisanego w paragrafie 3.6.3.

Stężenie zaimmobilizowanego enzymu oraz jego teoretyczną aktywność obliczono analogicznie jak to opisano w paragrafie 3.6.1.