Instytut Podstaw Chemii Żywności, Politechnika Łódzka ul. Stefanowskiego 4/10, 90-924 Łódź
Abstract W stęp
M etody oznaczania L-kamityny Oznaczanie wolnej L-kamityny
Przygotowanie próbki M etoda radiom etryczna M etody spektrofotometryczne M etoda spektrofluoiymetryczna M etody enzymatyczne
Metody chromatograficzne
Inne metody oznaczania L-kamityny
Oznaczanie acylowych pochodnych L-kamityny Podsumowanie
342 A. ŁĄCKA, J. LESZCZYŃSKA
Mgr inż. Agata Łącka jest asystentem w Zespole Che mii Bionieorganicznej i Analitycznej Instytutu Podstaw Chemii Żywności Politechniki Łódzkiej, obecnie przy gotowuje rozprawę doktorską.
Głównym zakresem jej badań jest analityka che miczna, a w szczególności wykorzystanie metod chro matograficznych i elektrochemicznych do oznaczania biologicznie czynnych składników żywności.
A B ST R A C T
L-Camitine (3-hydroxy-4-A-trimethylammonium butyric acid) plays an im portant role in fats metabolism, acting as an essential carrier o f acyl group from cytoplasm into the mitochondria and P-oxidation products from peroxosomes. It is also responsible for detoxication o f specific short- and medium-chain fatty acids [1-5]. Although carnitine is not indispensable in food and can be synthe sized in the system, its deficiency accompanies many diseases. Deficiency in carnitine is characterised by muscle weakness, cardiomyopathy, deposition o f fat in m uscles, kidneys, liver as well as metabolic acidosis.
L-Cam itine occurs in a free form and esterificated by fatty acids. For dia gnostic purposes free and total carnitine are determined after previous ester hydro lysis. M odem m ethods o f carnitine determining are based on reversible reaction o f the stoichiom etric acetyl-transfer from acetyl-coenzyme A to L-camitine cata lyzed by carnitine acetyltransferase (CAT), and measurement o f the content o f acetyl-carnitine or free coenzyme A formed [1, 19]. Isomer D-camitine is inactive in that reaction, nor-cam itine (3-hydroxy-4-dimethylammonium butyric acid) may take part, but this compound does not appear in any biologic materials. These m ethods o f carnitine determining employ radiometric, spectrophotometric, spectrofluorimetric and enzymatic techniques.
Am ong the other methods o f carnitine determining chromatographic methods are most frequently used, especially HPLC, but also GC chromatography is often used. Using HPLC method, one can determine the carnitine level, either im mediately or in the form o f 4'-brom ophenacyl derivatives [46-49]. However, some authors have had difficulties in obtaining these derivatives [29] and sensi tivity o f determination has been not sufficient for biological samples. Various reagents were used to prepare fluorescent carnitine derivatives in the HPLC chrom atography w ith fluorimetric detection [tab. 1]. The reactor containing immobilized enzymes was also used [58], Carnitine can also be determined by m eans o f gas chromatography. This method is based on the disintegration o f carnitine at temp. 160 °C in the presence o f NaOH and NaBH4 [61, 62]. Under these conditions it is disintegrated into crotonylbetaine, trimethylamine and butyrolacton, which are detected with flame ionization. Among methods used less frequently m ass spectroscopy and capillary electrophoresis are worth mentioning. Individual content o f 0-acy l derivatives o f L-camitine can be determined using the “radio-exchange” method or gas chromatography.
344 .A ŁĄCKA. j. l e s z c z y ń s k a
W S T Ę P
L-kamityna (kw as 4-(trim etylo)am ino-3-hydroksym asłow y) (rys. 1) oraz jej 0 -acylowe pochodne (acylokam ityny) są rozpow szechnione w tkankach zwierzę cych, roślinnych i w drożdżach [1], K am ityna funkcjonuje jako główny nośnik grup acylowych z cytoplazm y do m itochondrium oraz produktów (3-oksydacji z peroksysom ów [2, 3]. W ykazano również, że kam ityna pełni w ażną funkcję przy tworzeniu m itochondrialnego koenzym u A (CoA) z acyloCoA, gdy ilość wolnego CoA lim ituje aktyw ację i akum ulację m etabolitów w m itochondriach [4]. Kam ityna bierze udział w detoksyfikacji specyficznych krótko- i średniołań- cuchowych kw asów tłuszczow ych, niem etabolizowanych lub metabolizowanych w niewielkim stopniu przez kom órkę [5].
B a d a n i a n a d L - k a m i t y n ą d o w i o d ł y , ż e u c z e s t n i c z y o n a t a k ż e w p r z e m i a n i e w ę g l o w o d a n ó w i b i a ł e k , w p r o c e s a c h t r a n s m e t y l a c j i o r a z s t y m u l u j e f u n k c j e t r a w i e n i a w p r z e w o d z i e p o k a r m o w y m , a p r z e z w p ł y w n a p r z e m i a n ę c u k r o w c ó w i b i a ł e k o b n i ż a i l o ś ć c i a ł k e t o n o w y c h w e k r w i i p r z y w r a c a r ó w n o w a g ę k w a s o w o - - z a s a d o w ą w t k a n k a c h i w e k r w i [6 ] .
Kam ityna je s t syntetyzowana z L-lizyny w każdym żyw ym organizmie, przy czym pełny zestaw enzym ów potrzebnych do tych reakcji u człowieka znajduje się tylko w wątrobie, nerkach i m ózgu [7]. Zasoby kam ityny człowieka o m asie 70 kg w ynoszą ok. 100 m moli, z czego 98% tej ilości zlokalizowane jest w m ię śniach, 1,5% w w ątrobie i nerkach oraz zaledwie 0,5% w pozostałych tkankach, w tym we krwi [8]. Organizm ludzki potrafi sam syntetyzować kam itynę w ilo ści ocenianej na 1,2 ¡im oli/kg m asy ciała w ciągu doby [9], jednakże ilość ta nie jest wystarczająca, zwłaszcza przy intensywnym w ysiłku fizycznym, w sytua cjach stresowych itp. Utrzym anie stałej ilości kam ityny w organizmie w ym aga jej m inimalnego dostarczenia w pożywieniu na poziom ie 8-11 m g/dobę [ 10], a w szczególnych przypadkach (sportowcy wyczynowi) naw et 300 m g/dobę [11].
W ostatnich latach wiele chorób powiązano z niską podażą kam ityny w po żywieniu. N iedobór kam ityny w ystępuje najczęściej u wcześniaków, u których w wątrobie jest fizjologicznie niska aktywność enzym ów syntetyzujących kam i tynę oraz u dzieci z lizynuryczną nietolerancją białek lub karm ionych dietą w e getariańską [12, 13], Choroba charakteryzuje się postępującym osłabieniem m ię
OH
śniowym, kardiom iopatią, odkładaniem się substancji lipidowych w mięśniach, nerkach i w ątrobie oraz kwasicą metaboliczną.
Bardzo często objawy niedoboru L-kamityny towarzyszą innym podstawowym chorobom, takim jak: zespół Reya, mukowiscydoza, cukrzyca. Niedobór jej poja wia się także przy długotrwałej dializoterapii, diecie eliminacyjnej, żyw ieniu poza jelitowym oraz długotrwałych biegunkach, w tych przypadkach spada bowiem do stępność metaboliczna kamityny. Następuje osłabienie mięśniowe, kardiomiopatia, hipoglikemia z hipoketonem ią częste infekcje i zaburzenia łaknienia [14],
M E T O D Y O Z N A C Z A N IA l-KARNITY NY
L-kamityna w ystępuje w dwóch postaciach: wolnej i zestryfikowanej kwasa mi tłuszczowymi. Spośród estrów pod względem ilościowego oznaczania rozróż nia się estry krótkołańcuchowe (C3- C 10) oraz długołańcuchowe ( C > 12), przy czym te ostatnie są nierozpuszczalne w roztworach kwaśnych, wymagają więc in nej procedury w ydzielania z m ateriałów biologicznych. Całkowitą ilość kamity ny w próbce oznacza się zatem w dwojaki sposób: tak samo ja k wolny związek, po uprzednim procesie hydrolizy estrów w warunkach wysokiego pH środowiska lub sumując zawartości wolnego związku oraz jego estrów krótko- i długołańcu- chowych [1, 15]. W niektórych publikacjach [16] oznaczana ilość całkowita kar- nityny w próbce dotyczy jednak tylko frakcji estrów rozpuszczalnych w kwasie, a co za tym idzie, ilość estrów długołańcuchowych nie jest wliczana do całkowi tej ilości kamityny.
OZNACZANIE WOLNEJ l-KARNITYNY
Pierw szą opisaną m etodą ilościowego oznaczania L-kamityny było wykorzy stanie kam itynozależnej larwy Tenebrio molitor [17]. M iarą ilości kamityny
w próbce był w zrost masy tego organizmu w porównaniu z przyrostem jego ma sy na pożywkach o znanej ilości L-kamityny.
D rugą historycznie metodą, obecnie nie wykorzystywaną ze względu na brak specyficzności, jest m etoda kolorymetryczna tworzenia barwnego kompleksu grupy aminiowej L-kamityny z błękitem bromofenolowym [18]. Metoda ta nie wykazywała odpowiedniej selektywności oraz była mało czuła.
D uża część współczesnych metod oznaczania L-kamityny oparte jest, w swej początkowej części, na odwracalnej enzymatycznej reakcji acylacji wolnej L-kar- nityny za pom ocą acetylotransferazy kamitynowej (CAT) (EC 2.3.1.7) [1, 19]. Grupa acetylow a zostaje w niej przeniesiona z acetylokoenzymu A na kamitynę, w wyniku czego zostaje uwolniona wolna cząsteczka koenzymu A (CoA), które go ilość następnie podlega oznaczaniu.
346 A. ŁĄCKA, J. LESZCZYŃSKA
W tej reakcji uczestniczy tylko izom er L, natom iast izom er D kam ityny jest nieaktywny. Przy wysokich jeg o stężeniach następuje inhibicja enzymu. Oprócz L-kamityny w tej reakcji m oże brać udział norkam ityna (kwas 3-hydroksy-4-di- metyloam inom asłowy), jednakże związek ten nie w ystępuje w m ateriałach bio logicznych [20].
Przygotowanie próbki
Niektóre próbki biologiczne, np. mocz lub osocze krwi, nie w ym agają w stęp nej obróbki. Jednakże część m etod oznaczania, np. spektrofotom etryczna, w ym a ga usunięcia z próbki zw iązków zawierających grupy sulfhydrylowe, głównie białka. Opisanych zostało wiele dróg postępow ania: deproteinizacja kwasowa [15, 21, 22], filtracja [23], denaturacja etanolem [24] lub przez ogrzew anie [25], jednakże każda z nich m a wady, wpływające na w ynik oznaczania. Kw asow a de proteinizacja w ym aga neutralizacji, dając w w yniku duże stężenia soli w próbce, spowalniające reakcje. Filtracja jest kosztowna, czasochłonna i nie usuwa z prób ki peptydów, tak samo ja k denaturacja tem peraturow a. Najlepszym sposobem wydaje się dializa próbki wyjściowej [26].
W przypadku oznaczania zawartości kam ityny w tkankach, najodpowiedniej szą m etodą otrzym ania ekstraktu jest deproteinizacja przy użyciu roztw oru kwa su chlorowego(VII) [27], Przy oznaczaniu m etodam i chrom atograficznym i sto suje się także ekstrakty m etanolowe lub m etanolow o-acetonitrylow e [2 8 ,2 9 ,3 0 ], W celu oddzielania kam ityny od innych składników, m ających w pływ na w ynik oznaczania, stosuje się oczyszczanie próbki na złożach jonow ym iennych. W ykorzystuje się zazw yczaj kom binację dw óch złóż: kationitu w form ie N H 4+ oraz anionitu. A nionit w form ie OH“ jest bardzo efektywny przy usuwaniu np. kwasów karboksylowych, jednakże taki jo n it hydrolizuje estry kamityny, dlate go jest zastępowany anionitem w form ie chlorkowej, charakteryzującym się słab szą efektywnością usuw ania kwasów [31]. Sandor i wsp. zaproponowali w yko rzystanie złoża anionow ym iennego w form ie F”, który w połączeniu z kationitem tworzy sól, łatwo sublim ującą podczas liofilizacji próbki [32].
Stosowanych je s t wiele buforów do przygotow ania i stabilizacji roztw orów kamityny, z których najczęściej stosowany je s t bufor HEPES (kwas 4-(2- -hydroksyetylo)-l-piperazynoetanosulfonow y) [1, 33]. W przypadku używania buforu tris (tris(hydroksym etylo)am inom etanu) do przygotow ania próbki badanej może wystąpić reakcja katalizow ana przez CAT przeniesienia grupy acetylowej z acetylo-CoA na tris [34].
Metoda radiometryczna
M etoda radiom etryczna uchodzi za podstaw ow ą m etodę oznaczania L-kami tyny i stanowi podstaw ę porów nań innych m etod oznaczania tego zw iązku [ 1, 31]. Opiera się na dwóch reakcjach: w pierwszej, odwracalnej reakcji, katalizo
wanej przez acetylotransferazę kam itynianow ą (CAT), znakowana izotopem 14C grupa acetylow a zostaje przeniesiona na L-kamitynę. Druga reakcja polega na chemicznym wiązaniu wolnego CoA, a co za tym idzie, przesunięciu równo wagi pierwszej reakcji w kierunku produktów. Jako reagent tiolowy stosuje się najczęściej A-etylom aleim id (NEM) [35], w rzadkich przypadkach czterotionian sodu [36], który m oże inhibować CAT.
[14C]acetylo-CoA + L-kamityna [14C]acetyIo-L-kamityna + CoA, CoA + reagent tiolowy —» reagent tiolowy-S-CoA.
N adm iar nieprzereagowanego [14C]acetylo-CoA jest usuwany przy użyciu żywicy jonow ym iennej (anionitu). Z powodu dodatniego ładunku na azocie gru py aminiowej w cząsteczce kamityny, [14C]acetylo-L-kamityna nie zostaje zatrzy mana na żyw icy i przechodzi do roztworu, w którym jej ilość zostaje oznaczona przy użyciu cieczowego licznika scyntylacyjnego. Zawartość kamityny w prób ce wyznacza się z krzywej wzorcowej.
Znaczące błędy oznaczenia pow stają w obecności dużych ilości acylokami- tyn oraz acetylo-CoA w próbce, powodujących przesunięcie równowagi pierw szej reakcji. Rozw iązać ten problem m ożna przez przepuszczenie próbki w po staci ekstraktu nadchloranowego przez złoże amonitowe lub zwiększenie stęże nia radioaktyw nego [14C]acetylo-CoA [37].
Środowisko badane nie powinno przekraczać wartości pH 7,5, aby uniknąć hydrolizy obecnych w próbce acylokamityn, nie przeszkadzających w tym ozna czeniu oraz inaktywacji CAT. Inaktywacji tego enzymu przez jony metali zapo biega się, dodając EDTA do roztworu badanego.
M etodę stosowano do oznaczania L-kamityny w próbkach biologicznych (krew, m ocz, tkanki), uzyskując granicę detekcji 50 pmol.
Metody spektrofotometryczne
W m etodzie kolorymetrycznej [15], zwanej m etodą DTNB, cząsteczki koen zymu A, uwolnionego w wyniku odwracalnej reakcji przeniesienia grupy acety- lowej z CoA na L-kamitynę katalizowanej przez CAT, wykrywa srę za pomocą reakcji z kwasem 5,5'-ditio-bis(2-nitrobenzoesowym) (DTNB) zgodnie z reakcją opisaną poniżej. W jej wyniku tworzy się żółty anion 5-tio-2-nitrobenzoesowy (TNB- ) w ilości proporcjonalnej do zawartości kamityny w próbce.
CoA + DTNB CoA-S-TNB + T N B '.
Enzym CAT je s t wolno deaktywowany przez cząsteczkę DTNB. Inaktywa- cja enzym u m oże również wystąpić przy pH 8,5, jednakże obniżenie pH poni żej 7 zm niejsza stopień dysocjacji DTNB, co powoduje zaniżenie wyniku końcowego. D latego pom iaru dokonuje się przy pH 7,5 w środowisku buforu HEPES [15].
348 A. ŁĄCKA, J. LESZCZYŃSKA
Obecność w próbce innych niż CoA zw iązków z grupą tiolow ą może prowadzić do błędów, jednakże m ożna to w yelim inow ać poprzez utlenianie tych tioli za pom ocą H 20 2 [15].
Z powodu prostoty wykonywania, opracow ano wiele zautom atyzowanych m etod oznaczania L-kamityny m etodą DTNB służących do wykonyw ania więk szej liczby oznaczeń [23, 38, 39]. Granica detekcji w tej m etodzie została okre ślona na poziom ie 5 nm ol, przy jej w ykorzystaniu do oznaczania L-kamityny w moczu, plazm ie i tkankach.
Drugą, rzadziej stosow aną metodą, je st m etoda tiokinazow a [40]. M etoda ta oparta jest na dwóch reakcjach enzymatycznych, z których pierw szą jest reakcja odwracalnego przeniesienia grupy acetylowej z koenzymu A na kam itynę, kata lizowana przez CAT. Druga reakcja polega na wiązaniu wolnego koenzymu A z cząsteczką sorbinianu w obecności adenozyno-5'-trifosforanu (ATP) przy udziale enzymu tiokinazy (ligaza kwas: CoA (tw orząca AM P)) (EC 6.2.1.3) z utworzeniem sorbylo-koenzym u A, adenozyno-5'-m onofosforanu (AM P) oraz pirofosforanu (PPj). Pom iaru stężenia sorbylo-CoA dokonuje się przy długości fali 300 nm, a wyniki ilościow e uzyskuje się na podstaw ie krzywej wzorcowej.
CoA-SH + ATP + sorbinian sorbylo-CoA + A M P + PP,. M etoda ta wykazuje w iększą czułość niż m etoda D TN B , jednakże ze w zglę du na wykorzystanie dwóch reakcji enzym atycznych je s t bardziej skom plikowa na. Największym źródłem błędów są zm iany tem peratury, gdyż ogrzew anie pod czas pom iaru prowadzi do wzrostu absorbancji oraz tw orzy się większa ilość nie- zdysocjowanego kw asu sorbowego. Problem ten m ożna usunąć przez dokładną kontrolę temperatury.
Metoda spektrofluorymetryczna
M etoda fluorym etryczna oznaczania ilościow ego kam ityny jest oparta na dwóch reakcjach enzym atycznych [40]. Pierw szą z nich je s t reakcja katalizow a na przez CAT przeniesienia grupy acetylowej z acetylo-CoA na kam itynę, druga reakcja jest katalizow ana przez dehydrogenazę 2-oksoglutaranow ą (OGDH). W tej reakcji CoA reaguje z 2-oksoglutaranem w obecności dinukleotydu niko- tynoam idoadeninowego (NAD+) z wytw orzeniem cząsteczki bursztynylo-CoA. Obie reakcje zachodzą w tem peraturze pokojowej w ciągu 15-30 m inut. Zm iana zawartości N A D + je s t m ierzona fluorymetrycznie.
CoA + 2-oksoglutaran + NA D + ° — ->• bursztynylo-CoA + NADH. Odm ianę tej m etody zaproponowali Schafer i Reichm ann [41]: pom iar zmian zawartości tw orzonego zredukow anego dinukleotydu nikotynoam idoadeninow e- go (NADH) m etodą spektrofotom etryczną przy długości fali 340 nm . M etoda zo stała w ykorzystana do oznaczenia L-kamityny w m oczu, surowicy krwi i tkan kach, a granica jej detekcji w yniosła 500 pm ol.
Metody enzymatyczne
Jak to zostało opisane wcześniej, duża część metod oznaczania L-kamityny jest oparta na reakcjach enzymatycznych, jednakże w piśmiennictwie opisywane są one zazwyczaj n ieja k o metody enzymatyczne, lecz noszą mylące nazwy zwią zane z m etodą detekcji jednego z produktów reakcji.
Jedną z m etod enzymatycznych jest m etoda wykorzystywana przy oznacza niu L-kamityny w teście enzymatycznym firmy Roche [42]. W teście tym wyko rzystywany jest szereg powiązanych ze sobą substratowo reakcji enzymatycz nych, które opisuje poniższy schemat:
L-kamityna + acetylo-CoA CAT»- acetylo-L-kamityna + CoA, CoA + ATP + octan ACS» acetylo-CoA + AMP + PP;, AM P + ATP 2 ADP,
2 A D P + 2 PEP PK >- 2 ATP + 2 pirogronian,
2 p i r o g r o n i a n + 2 NADH + 2 H + LPH» 2 L - m l e c z a n + 2 NAD+. Pierw szą reakcją jest opisana uprzednio reakcja acetylowania L-kamityny z w ykorzystaniem acetylotransferazy kamitynianowej. Powstający w tej reakcji koenzym A je s t następnie acetylow any przez syntetazę acetylokoenzymu A (ACS) (ligaza kw as : CoA; EC 6.2.1.2) w obecności ATP z wytworzeniem AMP oraz cząsteczki pirofosforanu. Kolejna reakcja w opisywanym szeregu po lega n a wytw orzeniu adenozyno-5'-difosforanu (ADP) przy udziale enzymu m iokinazy (M K) (fosfotransferaza ATP : AMP; EC 2.7.4.3) w obecności ATP, przy czym ilość uzyskanego ADP je s t równoważna połowie ilości L-kamityny w pierwszej reakcji s z e r e g u . C zw artą reakcją, katalizowaną przez kinazę piro-
g r o n i a n o w ą (PK) (fosfotransferaza ATP : pirogronian; EC 2.7.1.40), jest wytwo rzenie pirogronianu z fosfoenolopirogronianu (PEP) w obecności ADP. Czą steczka pirogronianu je s t substratem w ostatniej reakcji, w której przy udziale dehydrogenazy m leczanowej (LDH) (oksydoreduktaza L -m leczan: NAD; EC 1.1.1.28) następuje redukcja pirogronianu do L-mleczanu w NADH, którego ilość je s t m ierzona spektrofotom etrycznie przy długości fali 334, 340 lub 365 nm . Ilość z u ż y w a n e g o w tym szeregu reakcji NADH jest równoważna po
ł o w i e ilości L - k a m i t y n y .
Test e n z y m a t y c z n y p r z e z n a c z o n y j e s t d o o z n a c z a n i a L - k a m i t y n y w m o c z u , o s o c z u i p l a z m i e , n i e p o d a n o j e g o g r a n i c y d e te k c ji.
D rugą opisaną m etodą enzymatyczną jest cykl enzymatyczny zaproponowa ny przez Takahashiego i wsp. [43]. Zachodząca cykliczna reakcja enzymatyczna, opisana przez schem at na rys. 2, katalizowana przez dehydrogenazę kamitynia- now ą (EC 1.1.1.108), wyizolowaną zAlicagens sp., prowadzi do akumulacji tio-
-NADH przy stałej szybkości, która jest proporcjonalna do stężenia L-kamityny. Pomiaru spektrofotometrycznego dokonuje się przy długości fali 415 nm,
ozna-350 A. ŁĄCKA, J. LESZCZYŃSKA
czenie wykonuje się w stałej temperaturze 37 °C. Autorzy [43] wykorzystali opi saną metodę do oznaczania L-kamityny w osoczu krwi. Granica detekcji tej m e tody nie została określona.
NAD*
NADH
Rys. 2. Schemat reakcji cyklu enzymatycznego [43]
Metody chromatograficzne
Spośród m etod polegających na rozdziale chrom atograficznym do iloś ciowego oznaczania L-kamityny i jej estrów najczęściej wykorzystuje się m etody z wykorzystaniem wysokosprawnej chrom atografii cieczowej (HPLC).
H P L C z detekcją spektrofotometryczną. W ykorzystując m etodę HPLC z detekcją spektrofotom etryczną, kam itynę oznacza się bezpośrednio [44] oraz w postaci pochodnych 4'-brom o-fenacylow ych [45],
Przy oznaczaniu kam ityny m etodą bezpośrednią [44] zastosowano kolum nę Supelcosil N H 2 (250 x 4,6 m m, i.d.; 5 Jim) oraz izokratyczny przepływ fazy ru chomej, na którą składał się acetonitiyl oraz 0,02 M bufor fosforanowy (pH 3) w stosunku objętościowym 7 5 :25. Pomiaru dokonywano przy długości fali 205 nm. Mimo dużej prostoty (brak tw orzenia pochodnych, przepływ izokratyczny fazy ruchomej) m etoda ta nie jest enancjoselektyw na oraz m a zbyt m ałą czułość oznaczeń kam ityny (granica detekcji na poziom ie 100 nmoli), aby m ogła być wykorzystana do próbek biologicznych.
Najczęściej stosowanym i pochodnymi kam ityny oznaczanymi przy rozdzia le HPLC z pom iarem spektrofotom etrycznym są pochodne 4,-brom ofenacylowe, przy czym opisanych zostało kilka m etod ich otrzym ywania. W przypadku zasto sowania bromku 4'-brom ofenacylu (BPB) tw orzą się pochodne w obecności ete rów koronowych w środow isku acetonitrylu [46], eterów koronowych i w odoro węglanu potasu [47] lub A^A-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) [48]. Niektórzy autorzy nie uzyskali jednak pochodnych w tych warunkach [29]. Ograniczeniem estryfikacji kam ityny przy użyciu odczynników bromofenacylowych jest obec ność w próbce innych zw iązków zawierających gm pę karboksylową.
Pochodne kam ityny i acylokam ityn z BPB uzyskane w obecności eterów koronowych w środow isku acetonitrylu [46] podczas ogrzew ania do tem peratu ry 60 °C w płuczce ultradźw iękowej w czasie 90 m inut rozdzielano na kolumnie
Ultrasphere ODS IP (250 x 4,6 mm i.d.; 5 pm ) przy przepływie 1,6 ml/min fazy ruchomej, którą stanowiły rozpuszczalniki w zmiennych w czasie proporcjach: woda, acetonitryl oraz roztwory trietyloam iny i kwasu fosforowego. Uzyskano dobry rozdział pochodnych i dobrze wykształcone piki podczas pomiaru przy długości fali 245 nm oraz w czasie elucji pojedynczej próbki 55 minut. Przy tej samej długości fali występuje także absorpcja acetonitiylu i roztworu trietylo aminy, jednakże pom iar przy innej długości fali, np. 254 nm, powoduje spadek czułości m etody naw et o 20%. Niekorzystny wpływ eluatu na absorbancję autorzy [46] usunęli przez pom iar w gradiencie przepływu. Minimalna granica detekcji została określona na poziom ie 20 pmol.
Uzyskanie pochodnych kamityny z BPB w obecności AOV-diizopropyloetylo- aminy (DIPEA) w środowisku acetonitiylu wymagały wstępnego przekształcenia kamityny i acylokamityn w sole octanowe [48], W takiej postaci kamityna reago wała z DIPEA, a tworzenie końcowej pochodnej 4'-bromofenacylowej zachodziło w łagodnych warunkach (37 °C, 30 minut). Wykorzystana w pracy kolumna Hy- persil BDS C8 (200 x 4,6 mm, i.d.; 5 |im ) oraz faza ruchoma (woda, acetonitiyl oraz roztwory trietyloaminy i kwasu fosforowego w proporcjach zmiennych v. czasie) dały dobry rozdział pochodnych i dobrą oznaczalność przy długości fali 260 nm, przy czym czas pojedynczego oznaczenia skrócono do 30 minut.
Inną drogę otrzymywania 4'-bromofenacylowych pochodnych kamityny za proponowali M inkler i wsp. [30], Uzyskali oni pochodnąw wyniku reakcji L -k a r-
nityny z trifluorometanosiarczanem 4'-bromofenacylu, reagentem zsyntetyzowa- nym w tym celu. Reakcja tworzenia pochodnej kamityny, rozdzielanej chroma tograficznie, została przeprowadzona w obecności DIPEA w środowisku aceto- nitrylu w ciągu 10 minut w temperaturze pokojowej [49].
H P L C z d e te k c ją flu o ry m etry czn ą. M etody HPLC z detekcją fluoryme- tiyczną są stosow ane zazwyczaj do oznaczania kamityny po reakcji z wytworze niem odpowiedniej pochodnej. Opisano wiele odczynników wykorzystanych do tworzenia wykrywalnych w ten sposób związków, z których wybrane zostały przedstawione w tab. 1.
Rozdział chromatograficzny HPLC z detekcją fluorymetiyczną został także za proponowany przy wykorzystaniu reaktora z immobilizowanymi enzymami [58]. W tej metodzie, której schemat przedstawiono na rys. 3, kamityna i jej pochodne acylowe zostają rozdzielone na kolumnie TSK-gel ODS 80Ts (4,6 x 150 mm i.d.), a następnie zostają przepuszczone przez kolumny z osobno immobilizowanymi enzymami: hydrolaząacetylokamitynianową(ACK), dehydrogenazą kamityniano- w ą(C D H ) (E.C. 1.1.1.108) oraz diaforazą (DIA) (EC 1.8.1.4). Podczas oznacze nia L-kamityny i jej O-acylowych estrów przebiegają następujące reakcje:
a c y l o - L - k a m i t y n a + H20 ACH»- L - k a m i t y n a + RCOOH,
L - k a m i t y n a + (3-NAD+ CD^ *> d e h y d r o k a m i t y n a + (3-NADH + H+, N A D H + r e s a z u r y n a — ■>- NAD+ + r e z o r u f l n a .
352 A. ŁĄCKA. J. LESZCZYŃSKA
Tabela 1. Charakterystyka wybranych związków wykorzystywanych do oznaczania L-kamityny i jej estrów za pomocą metody HPLC z detekcją spektrofluoiymetryczną
Nazwa związku 2 A:m Granica
detekcji Lit. Trifluorometanosulfonian
2-(2,3-naftalimino)-etylu 259 394 790 fmoi [29]
9-antrylodiazometan (ADAM) 365 450 50 fmol [50]
6(4-aminofenylo)-3-cyjano-4--[4-(dietyloamino)fenylo]-2-metylopirydyna 363 533 60 fmol [51]
4-(2-aminoetyloamino)-7-nitro-2,1,3-benzoksa-
diazol (NBD-ED) 485 540 100 fmol [52]
2-(4-hydrazynokarbonyłofenylo)-4,5-difenylo- imidazol (HCPI) 340 475 nie określono [53] 4-(2-aimnoetyloamino)-N-(4-metoksyfenylo)--1,8-naftalimid 436 524 30 fmol [54] 3-bromo-metylo-6,7-dimetoksy-1 -metylo- -2( 1 H)chinoksalinon 380 455 nie określono [55]
1-aminoantracen (1-AA) 248 418 100 pmol [56, 57]
2
Rys. 3. Schemat aparatury do oznaczania L-kamityny techniką HPLC z reaktorem enzymatycznym [58] (1 - piec, 2 — kolumna, 3 - pompa, 4 — detektor, pozostałe objaśnienia w tekście)
Eluent, który stanowi zm ienny w czasie układ m etanolu, buforu fosforano wego i roztworów: siarczanu sodu oraz heptanosiarczanu sodu, je st m ieszany po