Magdalena Wojtas1
Streszczenie: Białko Starmaker (Stm) kontroluje powstawanie otolitów w uchu wewnętrznym ryb. Stm wiąże jony wapnia oraz wyraźnie wpływa na powstawanie kryształów węglanu wapnia. Kryształy stają się owalne i wielokrotnie mniejsze od kryształów kontrolnych. Badania białek kontrolujących biomineralizację umożliwiają projektowanie nowych materiałów o ciekawych właściwościach.
Słowa kluczowe: Starmaker, otolit, biomineralizacja, IDP, PILP
1. Wprowadzenie
Biominerały, takie jak muszle mięczaków, zęby czy kości znacznie różnią się właściwościami od nieorganicznych kryształów, np. szkliwo, które jest biominerałem fosforanu wapnia jest dużo twardsze i odporniejsze na ścieranie niż czysty fosforan wapnia. Różnice te wynikają z obecności organicznych cząsteczek w biominerale [1]. Białka kontrolujące biomineralizaję mogą znaleźć zastosowanie w projektowaniu nowych materiałów o ciekawych właściwościach, jednakże wymaga to dokładnego poznania mechanizmu działania tych białek na poziomie molekularnym [2], (opis patentowy US/2010/0150982).
Otolity, inaczej kamyczki błędnikowe są biominerałami zbudowanymi z węglanu wapnia oraz białek i odpowiadają za odczuwanie równowagi i przyspieszenia przez ryby [3]. Białka stanowią bardzo mały procent w składzie otolitu (około 1-5%), jednak mają ogromny wpływ na wielkość, kształt i odmianę polimorficzną węglanu wapnia [4].
Białko Starmaker (Stm) pochodzące z ryby Danio rerio kontroluje powstawanie otolitów.
W nieobecności tego białka lub kiedy powstawała jego krótsza forma otolity były dużo większe, zmieniały kształt ze sferycznego i obłego na nieregularny. Ponadto zmieniała się odmiana polimorficzna węglanu wapnia z aragonitu na kalcyt. Skutkiem tych zmian była między innymi utrata zdolności orientowania się ryb w szybko płynącej wodzie. Eksperymenty in vivo dowodzą, że Stm pełni kluczową rolę podczas biomineralizacji otolitów u Danio rerio [5]. Warto zwrócić uwagę, że Stm jest tylko jednym z wielu białek występujących w otolitach, więc zbadanie struktury i funkcji Stm wymaga otrzymania tego białka w postaci homogennego preparatu. Otrzymanie białka Stm z jego naturalnego źródła w ilości umożliwiającej jego zbadanie jest praktycznie niewykonalne. Dlatego sekwencję DNA kodującą Stm wprowadzono do odpowiedniego szczepu komórek bakteryjnych. Umożliwiło syntezę Stm w dużej ilości, a także otrzymanie preparatu białka Stm w formie oczyszczonej [5,6].
Białko Stm jest ciekawym obiektem badawczym ze względu na swoją strukturę. Należy ono do grupy białek inherentnie nieuporządkowanych (IDP, ang. intrinsically disordered protein) [6].
Oznacza to, że białko nie posiada ściśle określonej struktury drugo- i trzeciorzędowej. Może ono występować jako populacja cząsteczek o różnych konformacjach, a także może zmieniać swoją strukturę pod wpływem różnych czynników, takich jak oddziaływania z innymi białkami, jony wapnia itp. [7,8].
W niniejszej pracy pokazano, że białko Stm posiada zdolność wiązania wapnia, a także zbadano wpływ izolowanego białka Stm na powstawanie kryształów węglanu wapnia. Opisany poniżej układ eksperymentalny biomineralizacji in vitro pozwolił przybliżyć mechanizm tworzenia
1 Politechnika Wrocławska, Wydziałowy Zakład Biochemii, magdalena.wojtas@pwr.wroc.pl
kryształów węglanu wapnia w obecności białka. Stm Otrzymane wyniki potwierdzają ważną rolę Stm w biomineralizacji
2. Materiały i metody
2.1. Wiązanie jonów wapnia przez Stm
Zdolność wiązania jonów wapnia przez Stm była badana z wykorzystaniem techniki dot blot i radioaktywnego izotopu wapnia [9]. 2 µg białka o stężeniu 1 mg/ml nakładano na błonę nitrocelulozową. Nitrocelulozę przemywano następnie trzy razy buforem o składzie: 10 mM imidazol, 60 mM KCl, 5 mM MgCl2, pH 6,8. Po przemyciu błonę umieszczano w tym samym buforze, zawierającym dodatkowo izotop 45Ca (1 µCi/l) w postaci chlorku wapnia. Błonę inkubowano z izotopem 45Ca przez pół godziny, a następnie przemywano etanolem, suszono i poddawano autoradiografii.
2.2. Biomineralizacja in vitro
Wzrost kryształów węglanu wapnia prowadzono na płytce 96-dołkowej do hodowli komórkowych. Na studzienkę przypadało 30 µl białka Stm o stężeniu 1 mg/mL w buforze A (10 mM Tris, 100 mM NaCl, 10% glicerol). Stężenie końcowe białka wynosiło 100 µg/mL, a stężenie końcowe chlorku wapnia 10 mM. Objętość końcowa wynosiła 0,3 mL. Płytkę umieszczano w zamkniętym szczelnie eksykatorze ze stałym węglanem amonu w ilości 10 g.
Węglan amonu jest nietrwały i rozkłada się na amoniak i dwutlenek węgla. Dwutlenek węgla dyfundując do roztworu białka z chlorkiem wapnia powodował wzrost kryształów węglanu wapnia.
Kryształy rosły przez 24 godziny w temperaturze pokojowej w zamkniętym eksykatorze. Powstałe w tych warunkach kryształy przemywano delikatnie 96% etanolem, przenoszono na szkiełko mikroskopowe, poddawano napyleniu złotem i analizowano z wykorzystaniem skaningowego mikroskopu elektronowego. Część powstałych kryształów przenoszono na płytkę mikroskopową bez przemywania 96% etanolem.
3. Wyniki i dyskusja
Białko Stm, podobnie jak inne białka kontrolujące powstawanie kryształów ma bardzo wiele ujemnie naładowanych reszt aminokwasowych. Ujemnie naładowane reszty najprawdopodobniej są zaangażowanie w wiązanie jonów wapnia. W eksperymencie, którego wynik przedstawia rys 1.
pokazano, że Stm ma zdolność wiązania jonów wapnia.
Rys. 1. Wiązanie jonów wapnia przez albuminę wołową, kalmodulinę i Stm. Zaczernienie świadczy o obecności izotopu 45Ca związanego z białkiem zaadsorbowanym do nitrocelulozy.
Dla porównania przedstawiono także wynik dla kalmoduliny jako kontroli pozytywnej i albuminy wołowej jako kontroli negatywnej. Zgodnie z oczekiwaniem kalmodulina wiąże jony wapnia, natomiast albumina wołowa nie.
Eksperyment biomineralizacji in vitro pokazał, że Stm ma bardzo duży wpływ na powstawanie kryształów węglanu wapnia (rys. 2).
Rys. 2. Wpływ białka Stm na powstawanie kryształów węglanu wapnia w eksperymencie biomineralizacji in vitro.
Skala zaznaczona w lewym dolnym rogu wynosi 20 µm. (A) Kontrolny kryształ węglanu wapnia powstały w nieobecności białka. (B) Kryształy węglanu wapnia powstałe w obecności Stm. Kryształy po inkubacji w eksykatorze
były przemywane etanolem. (C) Kryształy węglanu wapnia powstałe w obecności Stm. Kryształy po inkubacji w eksykatorze nie były przemywane.
Kryształy powstające w obecności Stm są dużo mniejsze niż kryształy kontrolne, powstające w obecności buforu A. Długość krawędzi kryształu kontrolnego (rys. 2A) wynosi około 40 µm, natomiast średnica kryształu powstałego w obecności Stm wynosi poniżej 10 µm (rys. 2B, C).
Oznacza to, że Stm powoduje około 100-krotne zmniejszenie objętości kryształów. Ilość powstałych kryształów także była różna w obu przypadkach. Białko Stm indukowało powstawanie o wiele większej ilości kryształów w porównaniu z kontrolą. Ponadto, Stm wyraźnie wpływa na kształt kryształów węglanu wapnia. Kryształy kontrolne miały sześcienny kształt, typowy dla kryształów kalcytu, natomiast kryształy powstające w obecności Stm były sferyczne.
Na rys. 2C przedstawiono kryształy powstałe w obecności Stm, które nie były przemyte etanolem przed analizą preparatu pod mikroskopem elektronowym. W odróżnieniu od kryształów przemywanych etanolem są one pokryte fazą ciekłokrystaliczną.
Wszystkie te obserwacje wskazują na mechanizm działania Stm w procesie powstawania kryształów węglanu wapnia. Zwiększona ilość kryształów świadczy o wpływie Stm na zarodkowanie kryształów. Zdolność wiązania jonów wapnia przez mocno ujemnie naładowane Stm może powodować lokalne zwiększenie stężenia jonów i powstawanie większej ilości zarodków kryształów. Mniejszy rozmiar kryształów może wskazywać na hamujący wpływ Stm na powstające kryształy, podobnie jak w przypadku innych białek zaangażowanych w biomineralizację [10].
Zmiana kształtu kryształów pod wpływem Stm może być tłumaczona większym powinowactwem Stm do krawędzi kryształu. Ciekawy obraz uzyskano dla kryształów rosnących wobec Stm, których nie przemywano etanolem (rys. 2C). Obserwowana faza ciekłokrystaliczna na powierzchni kryształów może być wynikiem działania Stm. Gower i wsp. pokazali, że ujemnie naładowany polimer (np. białko o dużej zawartości reszt ujemnie naładowanych) może indukować w pierwszym etapie tworzenia kryształu fazę ciekło krystaliczną, która następnie przechodzi w fazę stałokrystaliczną lub w postać amorficzną. W skrócie indukowaną przez białko fazę ciekłokrystaliczną nazwano PILP (ang. polymer induced liquid precursor) [11,12]. Tworzenie się PILP jest możliwe dzięki zdolności wiązania jonów wapnia przez Stm (rys. 1).
Węglan wapnia, jako substancja trudno rozpuszczana i obojętna dla organizmu może być potencjalnie wykorzystany jako nośnik leków. Lek zamknięty w krysztale węglanu wapnia będzie powoli uwalniany, ponieważ węglan wapnia trudno rozpuszcza się w środowisku wodnym.
Jednakże, kryształy węglanu wapnia muszą być bardzo małe i nie mogą mieć ostrych krawędzi [13]. Fakt, że Stm powoduje zmniejszenie rozmiarów kryształów oraz zaokrąglenie ich krawędzi może mieć praktyczne zastosowanie w tworzeniu tanich nośników leków.
Praca powstała dzięki finansowaniu przez Narodowe Centrum Nauki (numer grantu: 1200/B/H03/2011/40) i Politechnikę Wrocławską.
Literatura
[1] F Cuisinier, C Robinson (2007; 2008) The Structure of Teeth: Human Enamel Crystal Structure.: 177-182.
[2] D Ren, Q Feng, X Bourrat (2011) Effects of additives and templates on calcium carbonate mineralization in vitro. Micron 42: 228-245.
[3] MD Ross, KG Pote (1984) Some Properties of Otoconia. Philosophical Transactions of the Royal Society of London B, Biological Sciences 304: 445-452.
[4] D Allemand, N Mayer-Gostan, H De Pontual, G Boeuf, P Payan (2007; 2008) Fish Otolith Calcification in Relation to Endolymph Chemistry.: 291-308.
[5] C Sollner, M Burghammer, E Busch-Nentwich, J Berger, H Schwarz, C Riekel et al (2003) Control of crystal size and lattice formation by starmaker in otolith biomineralization. Science 302: 282-286.
[6] TM Kaplon, G Rymarczyk, M Nocula-Lugowska, M Jakob, M Kochman, M Lisowski et al (2008) Starmaker exhibits properties of an intrinsically disordered protein. Biomacromolecules 9: 2118-2125..
[7] VN Uversky, AK Dunker (2010) Understanding protein non-folding. Biochim Biophys Acta 1804: 1231-1264.
[8] VN Uversky (2009) Intrinsically disordered proteins and their environment: effects of strong denaturants, temperature, pH, counter ions, membranes, binding partners, osmolytes, and macromolecular crowding. Protein J 28: 305-325.
[9] K MARUYAMA, T MIKAWA, S EBASHl (1984) Detection of Calcium Binding Proteins by 45Ca Autoradiography on Nitrocellulose Membrane after Sodium Dodecyl Sulfate Gel Electrophoresis. Journal of Biochemistry 95: 511-519.
[10] K Delak, S Collino, JS Evans (2009) Polyelectrolyte domains and intrinsic disorder within the prismatic Asprich protein family. Biochemistry 48: 3669-3677.
[11] LB Gower, DJ Odom (2000) Deposition of calcium carbonate films by a polymer-induced liquid-precursor (PILP) process. J Cryst Growth 210: 719-734.
[12] SE Wolf, J Leiterer, V Pipich, R Barrea, F Emmerling, W Tremel (2011) Strong stabilization of amorphous calcium carbonate emulsion by ovalbumin: gaining insight into the mechanism of 'polymer-induced liquid precursor' processes. J Am Chem Soc 133: 12642-12649..
[13] Y Ueno, H Futagawa, Y Takagi, A Ueno, Y Mizushima (2005) Drug-incorporating calcium carbonate nanoparticles for a new delivery system. J Control Release 103: 93-98.
B
IOMINERALIZATION ACTIVITY OFS
TARMAKER PROTEIN.
Formation of biominerals, like bone, teeth or shell is strictly regulated by proteins. Otoliths existing in fish inner ear are mineral deposits, responsible for gravity sensing and the perception of sound. Otoliths are composed of calcium carbonate associated with small fraction of organic molecules which control the crystal growth. Starmaker protein (Stm) from Danio rerio, acts as a component of otoliths which controls the size, shape, and polymorph of crystals. In this study, it has been shown that Stm binds calcium ions. Moreover, an in vitro calcium carbonate crystallization system was established to examine the role of Stm in the formation of crystals. SEM analyses indicated that the dimensions of calcite crystals growing in the presence of Stm were smaller in comparison with those growing without Stm. The shape of crystals growing in the presence of Stm were smooth and spherical in contrast to control crystals growing without Stm. Stm induces liquid precursor of calcium carbonate crystals. Obtained data suggest that Stm might find application in creation of new drug delivery system.