Mirosława Różycka1
Streszczenie:. Gen kodujący białko Starmaker-like (Stm-l) został odkryty w wyniku przeszukiwania biblioteki cDNA ryżanki japońskiej za pomocą fragmentu genu białka Stramaker (Stm). Pochodzący z danio pręgowanego Stm, należy do klasy białek inherentnie nieustrukturyzowanych i uczestniczy w procesie biomineralizacji otolitów w uchu wewnętrznym ryby. Wstępne analizy bioinformatyczne pokazują, że Stm-l również jest białkiem nieustrukturyzowanym. Nadekspresja w układzie bakteryjnym i oczyszczenie białka Stm-l pozwolą scharakteryzować jego właściwości strukturalne i funkcjonalne.
Słowa kluczowe: Biomineralizacja, białka inherentnie nieustrukturyzowane, Starmaker-like
1. Wprowadzenie
Biomineralizacja jest szeroko rozpowszechnionym w przyrodzie procesem umożliwiającym organizmom żywym wytwarzanie nieorganicznych kryształów stanowiących mocne i trwałe materiały budulcowe. Proces biomineralizacji jest bardzo złożony i jak dotąd nie do końca poznany.
Do dzisiaj udało się scharakteryzować tylko niewiele białek zaangażowanych w procesy biomineralizacji. Otolity, struktury obecne w uchu wewnętrznym ryb kostnoszkieletowych, odgrywają bardzo ważną rolę w odczuwaniu zmiany położenia oraz dźwięków. W danio pręgowanym biomineralizacja otolitów jest kontrolowana przez białko Starmaker, które należy do klasy białek wewnętrznie nieustrukturyzowanych (IDPs, ang. Intrinsically Disordered Proteins) [1].
Pomimo, że gen białka Starmaker-like (Stm-l) z ryżanki japońskiej i gen kodujący białko Starmaker nie wykazują dużego podobieństwa w sekwencji nukleotydowej, to zauważalna jest podobna struktura oraz wzór ekspresji obu tych genów. To wszystko może wskazywać na zachowaną rolę białka Stm-l w procesach biomineralizacji otolitów [2].
Na podstawie wykonanej analizy sekwencji aminokwasowej białka Stm-l zauważono, iż najprawdopodobniej należy ono do klasy IDPs, które charakteryzują się brakiem dobrze zdefiniowanej struktury drugo- i trzeciorzędowej w warunkach fizjologicznych, a co za tym idzie niezwykłą elastycznością i plastycznością [3]. Jednak przypuszczenia te wymagają przeprowadzenia odpowiednich eksperymentów na oczyszczonym preparacie białka.
Z wyżej wymienionych powodów postanowiono wyekspresjonować białko Stm-l w systemie bakteryjnym, dzięki czemu, możliwe byłoby jego oczyszczenie i następnie wykonanie szeregu badań pozwalających na charakteryzację jego właściwości strukturalnych i funkcjonalnych.
2. Materiały i metody
2.1. Otrzymanie konstruktu pQE-80L/Stm-l
Syntetyczny (Life Technologies) cDNA białka Stm-l posiadający sekwencję zoptymalizowaną do ekspresji w bakteriach Escherichia coli, wklonowano, wykorzystując techniki inżynierii
1 Wydziałowy Zakład Biochemii Politechniki Wrocławskiej, ul. Gdańska 7/9 50-344 Wrocław miroslawa.rozycka@pwr.wroc.pl
genetycznej, do wektora pQE-80L (Qiagen) za pomocą miejsc rozpoznawanych przez enzymy restrykcyjne BamHI i HindIII (MBI Fermentas) [4]. Po potwierdzeniu prawidłowości sekwencji sprawdzono ekspresję i rozpuszczalność rekombinowanego białka Stm-l, które posiadało na aminowym końcu dodatkowe, pochodzące z wektora, reszty aminokwasowe MRGSHHHHHHGS (His6/Stm-l) (rys.1).
Rys. 1. Schemat ekspresjonowanego białka His6/Stm-l. Liczby 1 i 361 oznaczają pierwszy i ostatni aminokwas białka Stm-l. Znakiem minus zaznaczono 12 dodatkowych reszt aminokwasowych pochodzących z wektora.
2.2. Ekspresja His6/Stm-l
Otrzymanym konstruktem transformowano komórki kompetentne E. coli szczepu BL21(DE3)pLysS (Merck). Hodowlę prowadzono w temperaturze 29°C, na płynnym podłożu TB [4] zawierającym antybiotyki chloramfenikol i karbenicylinę, aż do uzyskania gęstości optycznej OD600 0,8-0,9. Pobierano dwukrotnie próbkę 1 ml hodowli przed indukcją, a następnie do hodowli dodawano induktora ekspresji białka w postaci izopropylo-β-D-1-tiogalaktopiranozydu. Co godzinę, od momentu indukcji ekspresji białka aż do 4 godzin po indukcji, pobierano dwukrotnie 1 ml hodowli. Następnie pobrane próbki wirowano w celu oddzielenia masy komórek od pożywki, odrzucono supernatant, a osady komórek zawieszono w buforze do nakładania próbek 2×SB [4]
(próbki sprawdzające ekspresję białka) lub w buforze do lizy (próbki sprawdzające rozpuszczalność białka).
2.3. Rozpuszczalność His6/Stm-l
Próbki przygotowane do sprawdzania rozpuszczalności białka His6/Stm-l pobrane podczas hodowli poddano lizie poprzez dwukrotne rozmrożenie na lodzie i ponowne zamrożenie. Następnie do rozmrożonych próbek dodano roztworu DNazy i RNazy w celu hydrolizy zbędnych kwasów nukleinowych i inkubowano w 4°C jeszcze przez 0,5 h. Tak przygotowane próbki wirowano przy maksymalnych obrotach aby oddzielić frakcję białek rozpuszczalnych (supernatant) od frakcji białek nierozpuszczalnych (osad). Pobrane próbki supernatantów i osadów przygotowano do naniesienia na żel poliakryloamidowy poprzez zawieszenie ich w buforze 2×SB [4].
2.4. SDS-PAGE
Analizę ekspresji i rozpuszczalności otrzymanego białka rekombinowanego wykonano za pomocą techniki SDS-PAGE, wykorzystując układ nieciągły żelu 4% i 15% [5]. Jako znacznik wagowy wykorzystano marker PMWM – The Unstained Protein Molecular Weight Marker (MBI Fermentas). Białka w żelu poliakrylamidowym wizualizowano za pomocą barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250 oraz barwnika Stains-All.
3. Wyniki
3.1. Analiza bioinformatyczna Stm-l
Dzięki wykorzystaniu programu Composition Profiler [6] możliwe było porównanie udziału każdego z aminokwasów w białku Stm-l (rys.2a) z ich udziałem w sekwencjach białek skatalogowanych w bazie SwissProt 51. Baza ta zawiera zarówno sekwencje białek globularnych,
jak i IDPs. Podobne porównanie wykonano posługując się bazą PDB S25 zawierającą sekwencje białek globularnych oraz bazą DisProt 3.4, która zbiera sekwencje białek należących do IDPs.
Analiza ta pokazała, że skład aminokwasowy Stm-l wykazuje ogromne podobieństwo do składu białek nieustrukturyzowanych. Stm-l zawiera dużo reszt polarnych i obdarzonych ładunkiem, przy jednoczesnym małym udziale reszt niepolarnych, co jest cechą charakterystyczną białek należących do IDPs [3].
a) Analiza sekwencji składu aminokwasowego za pomocą programu Composition Profiler b) Analiza sekwencji aminokwasowej za pomocą algorytmu PONDR VL-XT.
Algorytm PONDR VL-XT [7] wykorzystując pierwszorzędową sekwencję aminokwasową białka umożliwia dokładniejsze określenie, które fragmenty Stm-l są pozbawione struktury drugorzędowej. Algorytm ten działa na zasadzie sieci neuronowej, do której wprowadzone zostały sekwencje białek nieustrukturyzowanych, których przynależność do klasy IDP została potwierdzona doświadczalnie. Taka analiza wykazała, że białko Stm-l jest praktycznie w całości pozbawione struktury i tylko w trzech miejscach istnieje prawdopodobieństwo tworzenia się szczątkowych struktur drugorzędowych (rys.2b).
3.2. Analiza ekspresji i rozpuszczalności białka His6/Stm-l w systemie bakteryjnym
Analiza elektroforetyczna ekspresji His6/Stm-l wykazała, iż osiąga ona maksymalną wartość już w trzeciej godzinie od momentu dodania induktora do hodowli (rys.3, ślady 1-4).
Rys. 3. Analiza elektroforetyczna ekspresji i rozpuszczalności białka His6/Stm-l.
a) Wizualizacja białek za pomocą barwnika Coomassie Brilliant Blue R-250.
b) Wizualizacja białek za pomocą barwnika Stains-All.
Ślady 1-4, lizaty komórek bakteryjnych transformowanych pQE-80L/Stm-l pobrany z hodowli przed indukcją ekspresji białka (0h) oraz w 1, 2 i 3 godzinie hodowli od momentu indukcji ekspresji białka; Ślad 5, marker wagowy; Ślady 6-10, frakcje białek nierozpuszczalnych z próbek pobranych przed indukcją oraz w 1, 2, 3, i 4 godzinie po indukcji; Ślady
10-15, frakcje białek rozpuszczalnych z próbek pobranych przed indukcją oraz w 1, 2, 3, i 4 godzinie po indukcji.
a) b)
a)
b)
Porównując próbki sprawdzające rozpuszczalność białka można zauważyć, że znajduje się ono we frakcji białek rozpuszczalnych. Ponadto His6/Stm-l barwi się za pomocą barwnika Stains-All na niebiesko, co jest cechą charakterystyczną kwaśnych białek (rys.3b).
4. Podsumowanie
Przeprowadzone analizy białka Stm-l pozwalają stwierdzić, że białko to należy do klasy IDPs, co czyni go niezwykle interesującym obiektem badawczym. Aby potwierdzić otrzymane wyniki in silico należy przeprowadzić szereg doświadczeń na homogennym preparacie białka.
Przedstawione powyżej wyniki pokazują, że udało się otrzymać stabilny konstrukt umożliwiające ekspresję rozpuszczalnego białka Stm-l w hodowli bakteryjnej. Otrzymane białko rekombinowane posiada znacznik sześciu reszt histydylowych, dzięki czemu możliwe będzie jego oczyszczenie za pomocą chromatografii powinowactwa na złożu zawierającym zimmobilizowane jony kobaltu.
Dopiero oczyszczenie i otrzymanie czystego preparatu białka pozwoli na zbadanie jego właściwości strukturalnych oraz funkcjonalnych.
Literatura
[1] M. Wojtas, P. Dobryszycki, A. Ożyhar (2012). Intrinsically Disordered Proteins in Biomineralization, Advanced Topics in Biomineralization, Jong Seto (Ed.).
[2] B. Bajoghli, M. Ramialison, N. Aghaallaei, T. Czerny, J. Wittbrodt (2009) Identification of Starmaker-Like in Medaka as a Putative Target Gene of Pax2 in the Otic Vesicle. Development Dynamics 238:2860-2866.
[3] V. N. Uversky, A. K. Dunker (2010) Understanding protein non-folding. Biochimica et Biophysica Acta 1804: 1231-1264.
[4] J. Sambrook, E. E. Fritsch, T. Maniatis (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. New York, USA: Cold Spring Harbor Laboratory Press.
[5] U. K. Laemmli (1970) Clevage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685.
[6] V. Vaic, V. N. Uversky, A. K. Dunker, S. Lonardi (2007) Composition Profiler: a tool for discovery and visualization of amino acid composition differences. BMC Cioinformatics 8: 211.
[7] P. Romero, Z. Obradovic, A.K. Dunker (1997) Sequence data analysis for long disordered regions prediction in the calcineurin family. Genome Inform Ser Workshop Genome Inform 8:110–124.
Podziękowanie: Praca finansowana z dotacji Ministerstwa Nauki i Szkolnictwa Wyższego na działalność statutową Wydziału Chemicznego Politechniki Wrocławskiej.
BIOINFORMATIC ANALYSIS AND EXPRESSION OF STARMAKER-LIKE PROTEIN IN ESCHERICHIA COLI
Gene encoding medaka Starmaker-like (Stm-l) protein was identified previously by a large-scale random in situ hybridization screen of genes using a fragment of gene encoding Starmaker (Stm) protein from Danio reiro. Stm belongs to a class of intrinsically disordered proteins (IDPs) and controls otoliths biomineralization in the inner ear of fish. Albeit there is no significant sequence similarity between Stm and Stm-l proteins, they have similar genomic structure and expression pattern what can suggest a conserved function of encoding proteins. In our studies we want to facilitate exploration of the molecular basis of Stm-l function. Preliminary bioinformatics analysis has shown that Stm-l protein is also member of IDPs class. A stable construct containing Stm-l cDNA was obtained and expressed in the bacterial system as a soluble protein. Overexpression of Stm-l and then protein purification will allow to further characterize its structural and functional properties.