Wektory kodujące przeszczepione warianty kotransfekowano do komórek CHO w różnych kom-binacjach, razem z pierwotnymi łańcuchami chimerycznego przeciwciała. Aktywność wiążącą porów-nywano w teście kompetycyjnym, porównując wiązanie pierwotnego mysiego przeciwciała 5/44 z wią-zaniem z komórkami Ramos (otrzymanymi z ATCC, ludzka linia komórkowa limfoblastów chłoniaka, wyrażająca powierzchniowy CD22). Badanie to uważa się za najlepszy sposób porównania zdolności przeszczepów do wiązania się z CD22 powierzchni komórki. Wyniki przedstawiono na Fig. 14 i 15. Jak można zauważyć, pomiędzy poszczególnymi przeszczepami istnieje bardzo mała różnica i w po-równaniu z macierzystym przeciwciałem mysim wszystkie z nich działają bardziej skutecznie niż prze-ciwciało chimeryczne. Wprowadzenie 3 dodatkowych reszt ludzkich przy końcu CDR-H2 (gH6 i gH7) nie miało wpływu na wiązanie.
Wybrano kombinację przeszczepu z najmniejszą liczbą mysich reszt gL1gH7. Łańcuch lekki z przeszczepem gL1 obejmuje 6 reszt donora. Reszty V2, V4, L37 i Q45 są resztami potencjalnie ważnymi dla upakowania. Reszta H38 znajduje się przy międzyprzestrzeni VH/VL. Reszta D60 jest resztą na powierzchni w pobliżu CDR-L2 i może przyczyniać się bezpośrednio do wiązania antygenu.
Spośród tych reszt w sekwencjach zarodkowych ludzkich genów kappa z innych podgrup znaleziono reszty V2, L37, Q45 i D60. Łańcuch ciężki z przeszczepionym gH7 obejmuje 4 reszty regionu zrębo-wego donora (resztę R28 uważa się za część CDR-H1 zgodnie z definicją strukturalną stosowaną przy przeszczepianiu CDR (patrz Adair i in., (1991), publikacja zgłoszenia patentowego PCT nr WO 91/09967)). Reszty E1 i A71 są resztami powierzchniowymi w pobliżu CDR. Reszta 148 jest poten-cjalną resztą upakowania. Reszta T93 jest obecna przy międzyprzestrzeni VH/VL. Spośród tych reszt w innych genach linii zarodkowej ludzkiej podgrupy I znaleziono reszty E1 i A71. Resztę I48 znalezio-no w podgrupie 4 ludzkiej linii zarodkowej, a resztę T73 znalezioznalezio-no w podgrupie 3 ludzkiej linii zarod-kowej.
Cały DNA i sekwencję białkową dla łańcucha lekkiego i łańcucha ciężkiego, obejmującą przybli-żone pozycje intronów w obrębie genów dla regionu stałego dostarczonych przez wektory, przedsta-wiono na Fig. 16 jako SEKW. NR ID: 29 i SEKW. NR ID: 28, odpowiednio, dla łańcucha lekkiego oraz jako SEKW. NR ID: 31 i SEKW. NR ID: 30, odpowiednio, dla łańcucha ciężkiego.
Z wektorów tych wycięto DNA kodujący geny łańcuchów lekkiego i ciężkiego. DNA łańcucha ciężkiego trawiono w miejscu 5' Hindlll, a następnie traktowano fragmentem Klenowa polimerazy I DNA E. coli i uzyskano tępy koniec 5'. Po przecięciu EcoRI w miejscu 3' uzyskano fragment łańcucha ciężkiego, który oczyszczono z żeli agarozowych. W ten sam sposób wytworzono fragment łańcucha lekkiego, z tępym końcem w miejscu 5' Sful i z miejscem 3' EcoRI. Obydwa fragmenty wklonowano do wektorów ekspresyjnych opartych na DHFR i stosowano do wytworzenia stabilnych linii komórkowych w komórkach CHO.
P R Z Y K Ł A D 3
SPRZĘGANIE NAc-GAMMA KALICHEAMYCYNA DMH ACBUT Z HUMANIZOWANYM PRZE-CIWCIAŁEM PRZECIWKO CD22 (G5/44)
W typowej reakcji sprzęgania, humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 (G5/44) sprzęgano z NAc-gamma kalicheamycyna DMH AcBut OSu (pochodną kalicheamycyny) (patrz Fig. 17), przy czym docelowe stężenie białka wynosiło 7,5 mg/ml, a docelowe obciążenie pochodną kalicheamycyny wynosiło 8,5% wagowych w odniesieniu do ciężaru białka. Docelowe pH mieszaniny reakcyjnej wyno-siło 8,5 ± 0,2, a docelowe stężenia innych składników reakcji były następujące: 50 mM kwasu N-(2- -hydroksyetylo)piperazyno-N'-(4-butanosulfonowego) (HEPBS), 37,5 mM dekanianu sodu i 9% obj./obj.
etanolu. Reakcję prowadzono w temperaturze 33° ± 2°C przez 1 godzinę. Przed oczyszczeniem uzy-skano następujące wyniki analizy tej typowej reakcji: białko: 7,34 mg/ml; obciążenie kalicheamycyną:
82,7 g//mg; agregat: 93,25%; i nieskoniugowane białko (LCF): 1,07% (% powierzchni UV zgodnie z HPLC).
Badano wpływ różnych powierzchniowo czynnych dodatków oraz ich stężeń na wydajność i czystość produktu w celu określenia ich wpływu na wytwarzanie skoniugowanego monomeru (patrz Tabela 2). Reakcje prowadzono przy utrzymywaniu wszystkich parametrów na stałym poziomie, z wy-jątkiem dodatku i jego stężenia.
Koniugaty wytworzone w tych reakcjach badano pod kątem stężenia białka, obciążenia kaliche-amycyną, zawartości agregatu i LCF. Aczkolwiek zadowalające wyniki uzyskano dla wszystkich kwa-sów n-karboksylowych, w zakresie od C6 (heksanian) do C12 (dodekanian), najlepsze łączne rezultaty (niski poziom LCF, niski poziom agregatu i wysoki odzysk monomerycznego koniugatu) otrzymano dla dekanianu w zakresie stężeń w zakresie 30 mM do 50 mM.
T A B E L A 2: WPŁYW DANEGO DODATKU I JEGO STĘŻENIA NA WYNIKI SPRZĘGANIA Dodatek/stężenie Odzysk białka (% odzysku) Procent agregatu Procent LCF
Heksanian-500 mM 51,3 3,36 38,3
Heptanian-400 Mm 49,9 4,7 20,6
Oktanian-200 mM 57,3 3,27 10,6
Nanonian-100 mM 54,7 1,41 0,3
Dekanian-50 mM 56,7 1,35 0,2
Undekanian-20 mM 46,9 2,95 0,6
Dodekanian-5 mM 65,6 0,78 7,0
P R Z Y K Ł A D 4
SPOSÓB CHROMATOGRAFICZNEGO OCZYSZCZANIA I. SPOSOBY ROZDZIELANIA CHROMATOGRAFICZNEGO
Aczkolwiek stwierdzono, że najlepszym ośrodkiem do HIC jest Butylo-SEPHAROSE® 4 Fast Flow, zadowalające wyniki można również uzyskać przy nieznacznej zmianie warunków chromatogra-fii, stosując inne żywice, takie jak Octyl-SEPHAROSE® Fast Flow, PPG-600C (Tosoh Biosep), FRAC-TOGEL® EMD Propyl (EM Processing) i Source 15ISO (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).
Substancją wyjściową do oczyszczania była mieszanina z reakcji sprzęgania, zawierająca 7,2 mg/ml białka przy obciążeniu pochodną kalicheamycyny wynoszącym 83 g/mg, z 10,1% zawar-tości agregatu (% powierzchni w HPLC) i z 5,6% zawarzawar-tości LCF (% powierzchni w HPLC).
Po zakończeniu reakcji sprzęgania mieszaninę reakcyjną rozcieńczono czterokrotnie dodatkiem roztworu fosforanu potasu do końcowego stężenia fosforanu (pH 8,2) 0,7 M. Po wymieszaniu roztwór ten przesączono przez filtry 0,45 . Rozcieńczony roztwór wprowadzono na kolumnę z Butyl- SE-PHAROSE® 4 Fast Flow. Łączna ilość wprowadzonego do kolumny białka wynosiła 29 mg na ml objętości złoża. Po przemyciu 0,7 M roztworem fosforanu potasu kolumnę eluowano gradientem od 0,7 M do 4 mM fosforanu potasu, pH 8,2. Wyeluowane z etapu z gradientem frakcje zebrano do dal-szej obróbki, łącznie z pulą obejmującą monomeryczny koniugat z zawartością poniżej 1% powierzch-ni agregatu i LCF. Pulę tę wprowadzono na kolumnę odsalającą SEPHADEX G-25 (Amersham Bio-sciences) w celu wymiany buforu na odpowiedni dla formulacji, składający się z 20 mM Tris-HCl i 100 mM chlorku sodu przy pH 8,0. Oczyszczony preparat CMC-544 z wymienionym buforem miał
następujące własności: obciążenie kalicheamycyną: 81 g/mg; agregat: 0,4% (% powierzchni HPLC) LCF: 0,8% (procent powierzchni HPLC).
P R Z Y K Ł A D 5
ANALIZA WIĄZANIA IMMUNOKONIUGATU NAC-GAMMA KALICHEAMYCYNA DMH ACBUT- -G5/44 (CMC-544)
Wytworzony w powyższej reakcji sprzęgania immunokoniugat humanizowanego przeciwciała przeciwko CD22 (G5/44) z kalicheamycyną (CMC-544) analizowano w badaniach wiązania, w celu określenia, czy koniugat wytworzony ulepszonym sposobem może mieć szkodliwy wpływ na wiązanie antygenu. Jak przedstawiono w Tabeli 3, procedura sprzęgania nie ma wpływu na powinowactwo wiązania antygenu z przeciwciałem. Immunokoniugat CMC-544, wytworzony znanym i nowym sposo-bem sprzęgania, wiąże docelowy antygen z podobnym powinowactwem, które nie różni się od powi-nowactwa dla nieskoniugowanego przeciwciała G5/44.
T A B E L A 3: POWINOWACTWO WIĄZANIA CMC-544 WYTWORZONEGO SPOSOBAMI SPRZĘGANIA PRZY UŻYCIU CMA-676 i CMC-544
Przeciwciało przeciwko CD22 KD (M) KA (1/M) kd (1/s) ka (1/Ms) Procent LCF Humanizowane G5/44 1,30 x 10-10 7,90 x 109 2,80 x 10-5 2,20 x 105 100 CMC-544 (21 m/mg) (sposób
z CMA-676) 1,20 x 10-10 8,10 x 109 6,10 x 10-5 4,90 x 105 25 CMC-544 (87 m/mg) (sposób
z CMC-544) 1,50 x 10-10 6,60 x 109 6,90 x 10-5 4,60 x 105 3,3 Analizy biosensoryczne prowadzono stosując BIAcore® 2000 (BIAcore AB, Uppsala, Szwecja).
CD22mFc kowalencyjnie immobilizowano na biosensorowym chipie pokrytym karboksymetylodekstra-nem aktywowanym N-hydroksysukcynimidem (CM5), zgodnie ze standardowymi metodami chemicz-nego sprzęgania amin, przy gęstości białka około 2000 jednostek rezonansowych. Próbki CMC-544 lub G5/44 rozcieńczono w buforze HBS (10 mM HEPES, pH 7,4, zawierającym 150 mM NaCl, 3 mM EDTA i 0,005% polisorbat 20 (obj./obj.)) i w celu związania wstrzykiwano w stężeniu w zakresie 1 do 100 nM na powierzchnię chipu biosensorowego pokrytego CD22mFc przy szybkości przepływu 30 l/min przez 3 minuty. Po fazie wiązania dysocjację związanego przeciwciała monitorowano przez przemywanie chipa buforem HBS przez 15 minut. Powierzchnię antygenową regenerowano przez przemywanie przez 30 sekund biosensorowego chipa 15 l buforu do regeneracji (10 mM NaOH i 200 mM NaCl), a następnie przez 2 minuty stanowiące czas stabilizacji przed następnym cyklem. Stałe kinetyczne obliczono metodą nieliniowej analizy regresji najmniejszych kwadratów, stosując model do-pasowania krzywych wiązania 1:1 Lagmuir i program BIAevaluation (wersja 3.0, BIAcore). Wiązanie antygenu z CMC-544 oceniono metodą analizy rezonansu plazmonów powierzchniowych, stosując CD22mFc kowalencyjnie immobilizowany na biosensorowym chipie. Wyniki analiz kinetycznych wiąza-nia CMC-544 i G5/44 z CD22mFc wskazują, że po dopasowaniu całości danych do modelu wiązawiąza-nia 1:1 Langmuir z wyrównaniem dla przeniesienia mas, zarówno CMC-544, jak i nieskoniugowany G544, wiążą CD22 z podobnym powinowactwem (CMC-544:CD22 KD = 200 pM; G5/44:CD22 KD = 235 pM). Sprzę-ganie z kalicheamycyną nie ma wpływu na zdolność G5/44 do skutecznego wiązania CD22mFc.
Wiązanie CMC-544 i G5/44 z CD22 wyrażanym na powierzchni komórek chłoniaka zależnego od limfocytów B badano również metodą cytometrii przepływowej. W badaniu tym jako kontrole dopa-sowane do izotypu stosowano gemtuzumab przeciwko CD33 mAb (hP67.6) i jego koniugat z ka-licheamycyną CMA-676 (gemtuzumab ozogamycyna). Jako kontrolę pozytywną stosowano rituximab (RITUXAN), chimeryczną ludzką IgG1 przeciwko ludzkiemu CD20 mAb. Jako kontrole negatywne stosowano również oczyszczone poliklonalne IgG1 i IgG4. Wiązanie CMC-544 i G5/44 z CD22 na Ramos lub RL BCL było podobne i odróżnialne od wiązania dla ludzkiej poliklonalnej IgG4. Dla RL BCL stwierdzono mniejszą powierzchnię wyrażania CD22 niż dla Ramos BCL. Dla porównania, wią-zanie CMA-676 lub gL1gH7 z obydwoma BCL było podobne do wiązania dla ludzkiej poliklonalnej IgG4, co jest zgodne z brakiem wyrażania CD33 (danych nie pokazano). Dla tych samych komórek stwierdzono silne wiązanie z rituximabem (RITUXAN) przeciwko CD20. W przeciwieństwie do hP67.6 i CMA-676, ani dla CMC-544 ani dla G5/44 nie wykazano żadnego wiązania z CD22- CD33+ w ko-mórkach białaczki HL-60 (danych nie pokazano). Wyniki te sugerują, że sprzęganie G5/44 z ka-licheamycyną nie ma wpływu na jej swoistość wobec antygenu. CMC-544 konkretnie rozpoznaje
CD22 na ludzkich limfocytach B, ale nie na limfocytach B mysich, szczurzych, psich, świńskich lub naczelnych (cynomolgus i rezus) (danych nie przedstawiono).
P R Z Y K Ł A D 6
ANALIZA DZIAŁANIA CMC-544 IN VITRO I IN VIVO I. CYTOTOKSYCZNOŚĆ IN VITRO
Porównywano działanie CMC-544 wytworzonego w procesach z zastosowaniem CMA-676 i CMC-544 na wzrost in vitro linii komórkowych chłoniaka zależnego od limfocytów B CD22+, RL, Daudi, Raji i Ramos. W celu uwidocznienia nieswoistego wobec antygenu działania koniugatu stoso-wano dopasowany do izotypu koniugat kalicheamycyny skierowany na ludzkie CD33 (CMA-676). Uży-cie nieskoniugowanej N-Ac gamma kalicheamycyny DMH (lek uwolniony z koniugatu po hydrolizie kwasowej) wskazuje, że każda ze stosowanych linii komórkowych była wrażliwa na śmiertelne działa-nie kalicheamycyny. W Tabeli 4 przedstawiono wyniki tych badań w oparciu o równoważnik kaliche-amycyny, a w Tabeli 5 przedstawiono te same wyniki wyrażone jako stężenia skoniugowanego białka przeciwciała. Dostarczanie kalicheamycyny do komórek CD22+ za pośrednictwem CD22 było co naj-mniej 10 razy bardziej skuteczne w zabijaniu docelowych komórek, niż w przypadku tego samego nieskoniugowanego leku. Dopasowany do izotypu koniugat kontrolny (CMA-676) miał cytotoksycz-ność mniejszą lub podobną jak nieskoniugowana pochodna kalicheamycyny. Jak widać w Tabeli 4, koniugat wytworzony w procesie sprzęgania z CMC-544 może zapewnić równoważne działanie cyto-toksyczne przy mniejszych stężeniach przeciwciała, niż koniugat wytworzony w procesie sprzęgania z zastosowaniem CMA-676.
T A B E L A 4: ZAHAMOWANIE WZROSTU PRZEZ SKONIUGOWANĄ KALICHEAMYCYNĘ (IC50 Pm dla kalicheamycyny)
T A B E L A 5. ZAHAMOWANIE WZROSTU PRZEZ SKONIUGOWANE PRZECIWCIAŁO (IC50 g/ml PRZECIWCIAŁA)
Cytotoksyczność in vivo. CMC-544 wytworzony w procesie wytwarzania CMC-544 badano w ksenoprzestrzeniach chłoniaka zależnego od limfocytów B. W badaniach tych stosowano dwa no-wotwory, choniaki z limfocytów B, RAMOS i RL. Chłoniak RL jest linią komórek chłoniaka nie-Burkitta, pochodzącą od NHL, zaś RAMOS pochodzi pierwotnie od komórek chłoniaka Burkitta. Na Fig. 18 przedstawiono reprezentatywne badanie, w którym CMC-544 i mysi odpowiednik tego przeciwciała wykazały skuteczność w hamowaniu wzrostu komórek chłoniaka z limfocytów B RAMOS w sposób zależny od dawki.
Koniugat humanizowanego przeciwciała okazał się bardziej skuteczny niż jego mysi odpowied-nik. W badaniu tym najniższa dawka koniugatu kalicheamycyny zdolna do znacznego zahamowania wzrostu chłoniaka wynosiła 10 g/kg skoniugowanej NAc-gamma kalicheamycyny-DMH. W przeci-wieństwie do tego, nieskoniugowane przeciwciało, G5/44, w dawce 10 mg/kg podawanej dootrzew-nowo w schemacie podobnym jak dla koniugatów, nie miało wpływu na wzrost dootrzew-nowotworu.
Podobne badania prowadzono stosując model chłoniaka RL. W Tabeli 6 przedstawiono łączną analizę z trzech niezależnych badań, w których oceniano przeciwnowotworowe działanie CMC-544 wobec nowotworów RL NHL o wielkości 300–400 mg u myszy nagich. Po 3 tygodniach CMC-544 w sposób zależny od dawki spowodował regresję nowotworów. Na podstawie analiz statystycznych powyższych badań minimalną dawkę CMC-544 w modelu chłoniaka RL ustalono na 20 g/kg w odniesieniu do zawartości kalicheamycyny. W żadnych z tych trzech badań nie obserwowano przy-padków śmiertelnych. Wyższe dawki (60–320 g/kg) CMC-544 spowodowały prawie całkowitą regre-sję chłoniaka RL. Reasumując, wyniki uzyskane w modelach z dwoma chłoniakami z limfocytów B wyraźnie wskazują, że CMC-544 jest zdolny do spowodowania regresji nowotworu.
T A B E L A 6: DZIAŁANIE PRZECIWNOWOTWOROWE CMC-544 WOBEC KSENOPRZESZCZEPÓW RL NHL U MYSZY NAGICH
DAWKA KALICHEAMYCYNY
G/KG ŚREDNI STOPIEŃ WZROSTU
NOWOTWORU1 % T/C2 WARTOŚĆ P-VALUE
W FUNKCJI NOŚNIKA3
Nośnik 6,74 – –
20 2,87 43 0,011
40 1,34 20 <0,001
60 0,58 9 <0,001
80 0,54 8 <0,001
160 0,21 3 <0,001
320 0,10 1 <0,001
1 Stopień wzrostu nowotworu (RTG) obliczony jako (ciężar nowotworu po 3 tygodniach/ciężar nowotworu dnia 1) dla każdego zwierzęcia
2 100* (średni RTG dla dawki CMC-544 /średni RTG dla grupy z nośnikiem)
3 wartość p z jednostronnego testu t dla CMC-544 w porównaniu z nośnikiem, z zastosowaniem transformacji rank RTG jako zmiennej odpowiedzi. We wszystkich testach t błąd określano w oparciu o zbiorcze wariancje, s2, we wszystkich leczonych grupach (s2=154,54)
Stosując modele chłoniaka RL i RAMOS badano również zdolność CMC-544, wytworzonego nowym sposobem, do hamowania wzrostu dużych ustabilizowanych chłoniaków z limfocytów B w kse-noprzeszczepach. Nowotwory pozostawiono do wzrostu do fazy 1,5 lub 2 g ciężaru guza, a następnie CMC-544 lub dopasowany do izotypu koniugat jako kontrolę negatywną (CMA-676) podawano do-otrzewnowo w dawce 160 g/kg skoniugowanej kalicheamycyny, z zachowaniem początkowego schematu dawkowania w dniach 1, 5 i 9. Ten sam schemat dawkowania do spowodowania długotrwa-łej regresji nowotworów w małym stadium rozwoju (patrz Tabela 6). Jak przedstawiono na Fig. 19, podawanie CMC-544 myszom z dużym chłoniakiem RAMOS spowodowało stopniową regresję po-czątkowego ciężaru chłoniaka, a po 20 dniach u trzech spośród czterech myszy z guzem guza, nie stwierdzono. Monitorowanie tych uwolnionych od guza myszy aż do 50 dnia nie wykazało ponownego wzrostu cofającego się chłoniaka RAMOS. Dla porównania, w dopasowanej do izotypu grupie kontrol-nej, CMA-676 nie wykazywał działania na wzrost nowotworu. Cztery spośród pięciu myszy z dużym guzem, które leczono CMA-676, należało uśmiercić przez dniem 15, ponieważ ciężar guza osiągnął blisko 15% ciężaru ciała.
Podobne badanie z CMC-544 prowadzono w modelu chłoniaka RL. Dootrzewnowe podawanie CMC-544 w dawce 160 g/kg przy podobnym schemacie, jak opisano uprzednio, w ciągu 30 dni spo-wodowało >90% regresję początkowego ciężaru chłoniaka RL. Jednakże, do dnia 45, u 2 myszy z grupy ze skurczonymi chłoniakami zaobserwowano ponowny wzrost guzów. Wyniki te wskazują, że CMC-544 jest zdolny do spowodowania regresji małych, jak również dużych, ustabilizowanych chło-niaków. W niewielu badaniach, tu nie przedstawionych, chłoniaki RL, które sporadycznie ponownie rosły po początkowej regresji wywołanej CMC-544, traktowano ponownie CMC-544. Badania te wykaza-ły, że nowotwory RL były nadal reaktywne w drugim przebiegu leczenia CMC-544 i ponownie cofały się.
A zatem, leczenie CMC-544 może być skuteczne przeciwko chłoniakom zależnym od limfocytów B, zarówno o małym, jak i o dużym ciężarze, z możliwością powtórzenia terapii.
II. PORÓWNANIE IN VIVO KONIUGATU WYTWORZONEGO W PROCESACH SPRZĘGANIA