Jako następny badano problem, czy chłoniaki zależne od limfocytów B, wzrastające po prze-rwaniu leczenia dostępnym na rynku rituximabem przeciwko CD20 (RITUXAN), nadal będą reagowały na leczenie CMC-544. Do tej pory, rozwijające się (nieustabilizowane) chłoniaki RL leczono przez 3 tygodnie rituximabem (RITUXAN). Wzrost chłoniaka RL był zahamowany, dopóki kontynuowano tera-pię rituximabem (RITUXAN). Po przerwaniu leczenia rituximabem (RITUXAN), chłoniaki RL gwałtow-nie urosły do wielkości około 1 g ciężaru i w tym czasie rozpoczęto leczegwałtow-nie CMC-544 w dootrze-wnowej dawce 160 g/kg. Jak przedstawiono na Fig. 21 i 22, chłoniaki RL nadal reagowały na CMC- -544 i do dnia 60 u 80% myszy stwierdzono brak guza. A zatem, CMC-544 przy trzech jest zdolny do spowodowania regresji chłoniaków zależnych od limfocytów B, których wzrost można zahamować jedynie przez ciągłe dawkowanie rituximabu (RITUXAN).
P R Z Y K Ł A D 7
DZIAŁANIE CMC-544 IN VITRO i IN VIVO I. BADANIA WIĄZANIA I TOKSYCZNOŚCI
CMC-544 badano w testach na wiązanie z CD22, jak również pod kątem aktywności w mo-delach in vitro i in vivo. CMC-544 porównywano również z CMA-676, dopasowanym do izotypu kontro-lnym koniugatem hP67.6 (IgG4) związanym z kalicheamycyną poprzez AcBut, i z rituximabem (RITU-XAN), chimeryczną IgG1 przeciwko CD20 mAb, (IDEC Pharmceuticals, San Diego, CA.), który jest dostępny na rynku i został zakupiony z firmy Medworld Pharmacy (Chestnut Ridge, NY). W badaniach domeny wiążącej G5/44 stosowano następujące przeciwciała: BU12 (Celltech, Slough, UK); BLCAM, HD239 (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA); RFB-4 (Ancell Corp, Bayport, MN); SHCL-1, Leu 14 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ); 4KB128 i To 15 (Dako Corp, Carpinteria, CA); M6/13 i M5/44 (Celltech, Slough, UK). W badaniach na blokowanie jako dodatkowe przeciwciała stosowano SJ10 (Immunotech, Fullerton, CA) i M17.1.1, M19.1.1, M38.1.1 (Celltech, Slough, UK). Stosowane w tych badaniach linie komórkowe, obejmujące linię komórek Ramos chłoniaka Burkitta (CRL-1923) i linię komórek RL chłoniaka ziarniczego (NHL) otrzymano z American Type Culture Collection. W badaniu wykrywania mykoplazmy przez reakcję łańcuchową polimerazy (ATCC, Manassas, VA) stwierdzono, że linie komórkowe są wolne od mykoplazmy. Linie komórkowe utrzymywano w formie hodowli
w zawiesinie w pożywce RPMI zawierającej 10% FBS, 10 mM HEPES, 1 mM pirogronianu sodu, 0,2%
glukozy, 100 U/ml soli sodowej penicyliny G i 100 g/ml siarczanu streptomycy.
Zdolność G5/44 do hamowania wiązania mysiego mAb o znanej swoistości wobec CD22 bada-no metodą analizy BIAcore®, przy użyciu Fc-CD22 immobilizowanym na chipie BIAcore® CM5. Po-równywano jednostki rezonansu plazmonów powierzchniowych (RU) otrzymane dla immobilizowane-go Fc-CD22 nienasyconeimmobilizowane-go lub nasyconeimmobilizowane-go uprzednio G5/44. Analizę interakcji biomolekularnych prowadzono stosując BIACORE® 2000. Przeciwciała przepuszczano przez powierzchnię kontrolą w ślepej próbie (komora przepływu 1, pełni funkcję kontroli, bez sprzężonego białka) oraz przez bada-ną powierzchnię Fc-CD22 (komora przepływu 2) immobilizowanego na sensorowym chipie CM5, zgodnie z chemiczną metodą sprzęgania amin, do poziomu 9,042 RU. Otrzymany sensorgram stano-wi odpostano-wiedź (RU) na komorę przepływu 2 minus odpostano-wiedź (RU) na komorę przepływu 1. Drugi sensorgram otrzymano przez nasycenie komór przepływu G5/44 (100 g/ml), przed wprowadzeniem mysiego mAb przeciwko CD22, które uprzednio scharakteryzowano w odniesieniu do wiązania. Na-tychmiast po zmierzeniu odpowiedzi G5/44, poszczególne mysie mAb przeciwko CD22 poddano per-fuzji, bez usuwania G544. Rejestrowano również drugą łączną odpowiedź uzyskaną po związaniu się mysiego mAb przeciwko CD22 z CD22 pokrytym G5/44. Gdy mysie przeciwciało wiąże się z CD22 w miejscach innych niż zajmowane przez G5/44, wówczas połączone odpowiedzi powinny być addy-tywne. Gdy wiązanie G5/44 z CD22 zakłóca lub zapobiega wiązaniu z drugim przeciwciałem, wów-czas połączone odpowiedzi nie powinny być addytywne. Każdy z drugich połączonych pomiarów ko-rygowano pod względem szybkości dysocjacji „off-rate" dla interakcji G5/44:CD22.
G5/44 blokował wiązanie jedynie tych przeciwciał, które wiązały się z epitopem A/Ig-podobną domeną 1 CD22 (SHCL1 Leu 14 i HD239), co oznacza, że G5/44 w tej domenie również wiąże CD22.
Przeciwciała, które wiążą się z epitopem B/Ig-podobną domeną 3 CD22 (RFB-4), epitopem C/Ig- -podobną domena 4 CD22 (To 15) i Ig-podobną domeną 2 CD22 (4KB128), nie były blokowane przez G5/44. Wyniki te wskazują, że miejsce wiążące G5/44 na CD22 jest zlokalizowane w pierwszej dome-nie Ig-podobnej, podome-nieważ zapobiega to wiązaniu tych przeciwciał mAb przeciwko CD22, które rozpo-znają pierwszą Ig-podobną domenę CD22 (epitop A). Inne przeciwciała przeciwko CD22, M6/13 (Cell-tech, Slough, UK), o nieznanej subswoistości, były również blokowane przez G5/44 (Cell(Cell-tech, Slough, UK), mapując tym samym miejsce wiążące M6/13 z epitopem A/Ig-podobną domeną 1 CD22. Prze-ciwciało M5/44, mysie macierzyste przePrze-ciwciało G5/44, o tej samej swoistości jak G5/44, hamuje wią-zanie G5/44 i służy jako kontrola pozytywna. W badaniach tych rolę kontroli negatywnej pełni przeciw-ciało BU12 przeciwko CD19.
Wyniki przedstawiono w Tabeli 7.
T A B E L A 7: WIĄZANIE MYSIEGO M/AB PRZECIWKO CD22 O OKREŚLONEJ SWOISTOŚCI Z FC-CD22 TRAKTOWANYM UPRZEDNIO G544. ODPOWIEDZI WIĄŻĄCE WYRAŻONO JAKO JEDNOSTKI
REZONANSU PLAZMONÓW POWIERZCHNIOWYCH (RU)
cd. tabeli 7
Stosując mysie przeciwciała mAb o znanej swoistości wiązania poszczególnych domen z CD22- -Bm badano również zdolność G5/44 do blokowania wiązania się tych przeciwciał z limfocytami B. Po-nadto, badano również zdolność mAb do blokowania wiązania G5/44 z limfocytami B. W badaniach tych najpierw komórki Ramos w ilości 1 x 105 eksponowano na mysie przeciwciało przeciwko CD22 (10 g/ml humanizowanego G5/44 lub mysiego monoklonalnego przeciwciała przeciwko CD22) przez 1 godzinę w temperaturze 4°C, a następnie komórki eksponowano na G5/44 (10 g/ml). Komórki in-kubowano jeszcze przez 1 godzinę w temperaturze 4°C. Po obróbce przeciwciałem limfocyty B wytrą-cono w postaci grudki i przemyto układem PBS-1% BSA i przez 30 minut w temperaturze 4°C doda-wano odpowiednie drugie przeciwciało (kozie przeciwludzkie przeciwciało FITC (łańcuch ciężki i lekki) albo kozie przeciwmysie przeciwciało FITC (łańcuch ciężki i lekki)) w ilości 100 l i w rozcieńczeniu 1:100 w układzie PBS-1% BSA. Komórki znowu wytrącono, przemyto i ponownie zawieszono w ukła-dzie PBS-1% BSA, po czym dodano do probówki zawierającej 250 l układu PBS-1% formaldehyd.
Związane z komórkami natężenie fluorescencji mierzono metodą cytometrii przepływowej, stosując cytometr przepływowy BD FACSort.
Wyniki wskazują, że uprzednia ekspozycja G5/44 na limfocyty B CD22+ spowodowała znaczne zahamowanie późniejszego wiązania przeciwciał mAb M5/44 i M6/13 przeciwko CD22. Dla porówna-nia, G5/44 nie hamował wiązania przeciwciał przeciwko CD22 mAb RFB4, To15, HD239 i 4KB z lim-focytami B. Brak znaczącego hamowania wiązania HD239 z limlim-focytami B przez G5/44, jak wykryto metodą cytometrii przepływowej, był nieoczekiwany, zwłaszcza z uwagi na fakt, że analiza BIAcore®
wykazywała, że G5/44 może blokować wiązanie HD239 z CD22. Brak silnego hamowania wiązania HD239 przez G5/44 można wyjaśnić w oparciu o różnice w stopniu powinowactwa wobec CD22. Gdy powyższe mysie mAb przeciwko CD22 badano pod kątem zdolności do hamowania wiązania G5/44 z limfocytami B CD22+, wiązanie G5/44 hamowały SHCL1 i M6/13, ale nie inne przeciwciała mAb przeciwko CD22. Epitopy wiążące HD239 i SHCL1 mapowano do pierwszej Ig-podobnej domeny CD22. Jednakże, epitopy rozpoznawane przez M6/13 lub M5/44 nie zostały zmapowane. Opisane powyżej badania blokowania wskazują, że powyższe przeciwciała rozpoznają epitopy zlokalizowane na pierwszej Ig-podobnej domenie CD22, określanej wspólnie jako epitop A.
Dwadzieścia tysięcy komórek Ramos inkubowano z różnymi dawkami CMC-544, z i bez rituxi-mabu (RITUXAN) przez 96 godzin. Po 96 godzinach mierzono żywotność komórek przez ekskluzję jodkiem propidiowym, a następnie przez analizę metodą cytometrii przepływowej. Obliczano średnio żywotność dla 3 do 6 studzienek i dla różnego leczenia obliczano hamowanie żywotności komórek w odpowiedzi na dawkę. Tło dla hamowania żywotności komórek jako odpowiedzi obliczono od zero-wego stężenia CMC-544. Do zbadania, czy CMC-544 spowodował statystycznie istotne zahamowanie wzrostu komórek Ramos przy dawkach w zakresie 0,01 do 3 ng kalicheamycyny DMH/ml, stosowano analizę regresji logistycznej. Regresję logistyczną stosowano również do oznaczenia statystycznej istotności interakcji pomiędzy CMC-544 i rituximabem (RITUXAN). Obliczono również średnie stężenia hamujące (IC50) i odnotowano skuteczność każdego leczenia w stosunku do leczenia samym CMC- -544. Analizy statystyczne prowadzono stosując metodę PROBIT w SAS wersja 8.2.
Wyniki prowadzonych badań wskazują, że CMC-544 spowodował zależne od dawki zahamo-wanie wzrostu komórek Ramos przy dawkach w zakresie 0,01 do 3 ng kalicheamycyny DMH/ml.
Średnie stężenie hamujące (IC50) dla samego CMC-544 wynosiło 0,029 ng/ml. Do komórek
traktowa-nych CMC-544 dodano rituximab (RITUXAN) w stężeniach 2, 20 i 200 g/ml, w celu określenia staty-stycznej istotności interakcji pomiędzy rituximabem (RITUXAN) i cytotoksyczną aktywnością CMC- -544. Rituximab (RITUXAN), dodawany w stężeniach 20 i 200 g/ml bez CMC-544, nie miał istotnego na wzrost komórek (111,7% i 94,0% wzrostu dla nośnika, odpowiednio). W kombinacji z CMC-544 trzy stężenia rituximabu (RITUXAN) spowodowały statystycznie istotne (p <0,05) przesunięcia w pętli w lewo i przerwanie krzywej dawka-odpowiedź dla CMC-544. Kombinacja z rituximabem w stężeniach 2 i 200 g/ml spowodowała największe przesunięcia w krzywych dawka – odpowiedź. Te dwie krzywe nie różniły się statystyczne, ale były zasadniczo różne (p<0,05) od krzywej dla kombinacji z dawką 20 g/ml.
Wyniki obserwowane w pierwszym badaniu potwierdzono drugim badaniem (wyników nie przedstawio-no). Średnie stężenia hamujące dla kombinacji 2, 20 i 200 g/ml rituximabu (RITUXAN) plus CMC-544 odpowiednio wynoszą 0,0072, 0,0081 i 0,0072 ng/ml. Średnie stężenie hamujące dla CMC-544 plus rituximab (RITUXAN) są około czterokrotnie wyższe niż wartości IC50 dla samego CMC-544.
II AKTYWNOŚĆ PRZECIWNOWOTWOROWA IN VIVO WOBEC PODSKÓRNYCH KSENO-PRZESZCZEPÓW I OGÓLNOUSTROJOWO ROZSIANYCH CHŁONIAKÓW ZALEŻNYCH OD LIM-FOCYTÓW B U MYSZY SCID
Samice atymicznych myszy nagich, o ciężarze ciała 18–22 g, poddano całkowitemu napromienie-niu (400 radów). Napromienienie w dalszym stopnapromienie-niu osłabiło układ odpornościowy myszy, zwiększając szansę przyjęcia nowotworu. Trzy dni po napromienieniu myszom wstrzyknięto podskórnie w prawy bok 107 komórek RL w MATRIGEL (Collaborative Biomedical Products, Belford, MA, rozcieńczony w pożywce RPMI w stosunku 1:1. Gdy guzy osiągnęły odpowiednią wielkość (0,3 g, na ogół po 21 dniach), myszom podawano w sterylnym roztworze soli fizjologicznej, w dawce 0,2 ml/mysz, ip. CMC- -544, rituximab (RITUXAN) lub CHOP (patrz poniżej). Pierwszy dzień podawania leku oznaczono jako dzień 1. Dnia 5 i 9 (leczenie = g4Dx3) podawano dwie dodatkowe dawki. Leczenie CHOP obejmowało cyklofosfamid (C) (CYTOXAN, Bristol-Meyers Squibb Co., Princeton, NJ) w dawce 40 mg/kg ip; dokso-rubicynę HCl (H), (Sigma-Aldrich, Co., St Louis, MO) w dawce 3,3 mg/kg ip; winkrystynę (O), (GensiaSi-cor Pharmaceuticals Irvine, CA) w dawce 0,5 mg/kg ip; oraz prednizon (P), (Roxane Labs., Columbia, OH) w dawce 0,2 mg/kg po. CHO podawano według tego samego schematu dawkowania, jak CMC-544 i rituximab (RITUXAN) (q4Dx3), zaś prednizon podawano doustnie co drugi dzień, łącznie 5 dawek (q2Dx5). Guzy mierzono przynajmniej raz w tygodniu i obliczano ciężar guza (g) = 0,5 (szerokość gu-za/2) (długość guza). Obliczano średnią dla grupy, SEM, i porównywano ją ze średnią dla grupy leczonej nośnikiem na istotność statystyczną, stosując wielotorowe testy T. Średnie w grupach zapisywano aż do 50 dnia, lub do śmierci myszy (co przerywa średnią w grupie) lub do momentu, w których guz urósł do zbyt dużych rozmiarów (>3,5 g) i mysz należało uśmiercić. Po upływie tego czasu, ciężar guza odnoto-wywano jedynie dla pojedynczych myszy w całej leczonej grupie. Pod koniec każdego badania w każdej leczonej grupie zapisywano również liczbę myszy wolnych od guza.
Do oceny działania na rozsiane chłoniaki samego CMC-544 lub w kombinacji z innymi środkami bioaktywnymi stosowano model myszy SCID. Samcom myszy SCID (CB17 SCID), o ciężarze ciała 20–25 g, przez żyłę ogonową wstrzykiwano 106 komórek Ramos (0,2 ml). Dnia 3 lub 9 po wstrzyknię-ciu komórek myszom podawano nośnik, koniugaty (CMC-544 lub CMC-676) albo rituximab (RITU-XAN) ip, łącznie 3 dawki. W schemacie leczenia od dnia 3 dawki podawano w dniu 3, 7 i 11. W sche-macie leczenia od dnia 9 dawki podawano w dniu 9, 13 i 17. W schesche-macie leczenia od dnia 9 poda-wano również kombinacje CMC-544 i rituximabu (RITUXAN), jak opisano powyżej. Myszy monitoro-wano codziennie i gdy wystąpiło porażenie kończyn tylnych, myszy uśmiercano. Stosomonitoro-wano 7 do 10 myszy w każdej leczonej grupie. Dla każdej grupy obliczano średni czas przeżycia, (±SD), media-nę, minimalne i maksymalne czasy przeżycia. Różnice w rozkładzie przeżywalności pomiędzy po-szczególnymi grupami oznaczano stosując nieparametryczny test Long-rank, a istotność oznaczano przy poziomie 0,05. Krzywe przeżycia konstruowano stosując metodę Kaplana-Meiera.
W pierwszym teście badano wpływ dwóch różnych schematów dawkowania na czasy przeżycia myszy SCID z rozsianym chłoniakiem. W pierwszym badaniu obserwowano początkowe dawkowanie leku 3 dni po dożylnym wstrzyknięciu komórek nowotworowych (model rozwijania), a w drugim badaniu obserwowano opóźnione dawkowanie leku po 9 dniach po wstrzyknięciu komórek nowotworowych (mo-del ustabilizowany). W każdym badaniu podawano dootrzewnowo 3 dawki w 4-dniowych odstępach (Q4Dx3) CMC-544 (160 g/kg), CMA-676 (160 g/kg) albo rituximab (RITUXAN) (20 mg/kg). W modelu rozwijania u myszy leczonych nośnikiem średni czas przeżycia wynosił 27 dni (Fig. 23, Tabela 8).
CMA-676, dopasowana do izotypu kontrola dla CMC-544, nie zwiększył w znaczny sposób cza-su przeżycia (p>0,05). CMC-544 znacznie zwiększył czas przeżycia do 41 dni, zaś rituximab miał
po-ważny wpływ na zwiększenie czasu przeżycia do >125 dni (znacznie większy niż CMC-544, p<0,05).
Opóźnione dawkowanie, które daje komórkom możliwość krążenia (naprowadzanie) i osadzenia się w docelowych tkankach (model ustabilizowany) zmieniło wyniki dla CMC-544 i rituximabu (RITUXAN).
CMA-676 ponownie nie miał istotnego wpływu na czasy przeżycia (Fig. 24, Tabela 8). Rituximab (RI-TUXAN) zwiększył średni czas przeżycia do 62,6 dnia, a CMC-544 poprawił tę średnią do 83,5 dnia.
W modelu ustabilizowanym nie obserwowano zasadniczej różnicy pomiędzy działaniem CMC-544 i rituximabu (RITUXAN).
Prowadzono badanie wstępne w celu określenia, czy rituximab (RITUXAN) ma jakikolwiek wpływ, pozytywny lub negatywny, na przeżycie w odpowiedzi na CMC-544. CMC-544 (160 g/kg) podawano bez i z rituximabem (RITUXAN) (20 mg/kg, wysoką dawkę kombinacji leku oznaczono jako (HD)). Ponadto z małymi dawkami CMC-544 (80 g/kg) podawano małe dawki rituximabu (RITUXAN) (10 mg/kg). Przy dawkach 80 g/kg lub 10 mg/kg związków nie podawano oddzielnie z uwagi na ograniczoną liczbę myszy w badaniu. Tę kombinację, CMC-544 (80 g/kg) z rituximabem (RITUXAN) (10 mg/kg), oznaczono jako kombinację ze średnią dawką (MD) i badano ją w celu określenia działa-nia niższych dawek kombinacji leków na przeżycie myszy SCID. CMC-544 (160 g/kg) i sam rituximab (RITUXAN) (20 mg/kg), podawano jak opisano powyżej dla modelu ustabilizowanego. Każdy z tych leków zwiększył średni czas przeżycia, odpowiednio do 58,5 i 50,5 dnia (Fig. 25, Tabela 9). Dla kom-binacji średni czas przeżycia nieznacznie (aczkolwiek w statystycznie nieistotny sposób, p>0,05) zwiększył się do 64,4 dnia przy dużej dawce kombinacji. Kombinacja przy średniej dawce wynoszącej 80 g/kg CMC-544 i 10 mg/kg rituximabu (RITUXAN) znacznie zwiększyła (p<0,05 w stosunku do grupy leczonej nośnikiem) czas przeżycia, średnio do 92,4 dnia. Wyniki te sugerują, że niższe dawki kombinacji CMC-544 i rituximabu (RITUXAN) były uzasadnione.
T A B E L A 9: OPIS POMIARÓW CZASÓW PRZEŻYCIA WE WSTĘPNYM BADANIU KOMBINACJI Związek Średni czas
CMC MD = CMC544 średnia dawka, 80 g/kg CMC HD = CMC-544 duża dawka, 160 g/kg Ritux MD = Rituximab średnia dawka, 10 mg/kg Ritux HD = Rituximab duża dawka, 20 mg/kg
Badano również kombinację CMC-544 i rituximabu (RITUXAN). Leczenie prowadzono w nastę-pujących grupach: CMC-544 w dawkach 40, 80 i 160 g/kg; rituximab (RITUXAN) w dawkach 5, 10 i 20 mg/kg; i CMC-544 w dawce 40 g/kg plus rituximab (RITUXAN) w dawce 5 mg/kg, CMC-544 w dawce 80 g/kg plus rituximab (RITUXAN) w dawce 10 mg/kg i CMC-544 w dawce 160 g/kg plus rituximab (RITUXAN) w dawce 20 mg/kg. Wszystkie dawki rituximabu (RITUXAN) nieznacznie popra-wiły średni czas przeżycia w zakresie 33 do 40 dni (dla wszystkich dawek p<0,05 w porównaniu ze średnim czasem przeżycia w grupie leczonej nośnikiem, wynoszącym 25,8 dnia, Fig. 26, Tabela 10).
Duża dawka CMC-544, 160 g/kg, zwiększyła średni czas przeżycia do 85 dni, to było zgodnie z wynikami podanymi dla dwóch wcześniejszych badań. Połączenie CMC-544 z rituximabem (RITU-XAN) nie przyniosło znacznej poprawy czasów przeżycia (Fig. 27, Tabela 10). Każda z dwóch niż-szych dawek CMC-544 (80 i 40 g/kg) poprawiła znacznie (p<0,05) czasy przeżycia, w porównaniu z odnotowanymi dla wysokiej dawki CMC-544. Dla dawek CMC-544 40 i 80 g/kg, odpowiednio u 90% i 80% myszy obserwowano przeżycie przez 125 dni. W obydwu grupach z kombinacją leków 100% myszy przeżyłoaż do 125 dnia. Niższe dawki CMC-544 są bardziej skuteczne niż wysoka daw-ka, 160 g/kg.
Rituximab (RITUXAN) w kombinacji z CMC-544 nie miał oczywistego wpływu na aktywność wobec modelu rozsianego chłoniaka z limfocytów B u myszy SCID w badanych dawkach (patrz powy-żej). Stosując model podskórnego ksenoprzeszczepu chłoniaka z limfocytów B u myszy nagich Balb/c, oceniano również, czy CMC-544, podawany z rituximabem (RITUXAN) spowodował nasilenie lub za-hamowanie aktywności przeciwnowotworowej. W podskórknym modelu chłoniaka z limfocytów B guzy ustabilizowano do średniego ciężaru 300 mg, a następnie podawano dootrzewnowo dwa badane środki terapeutyczne. CMC-544 stosowano w dawkach 20 lub 80 g/kg Q4Dx3, z lub bez rituximabu (RITUXAN) (20 mg/kg Q4Dx3). Współpodawanie rituximabu (RITUXAN) nie zwiększyło ani nie zaha-mowało w sposób istotny (p>0,05) skuteczności terapeutycznej CMC-544 (Fig. 28). W badaniu tym rituximab (RITUXAN), podawany sam, hamował wzrost chłoniaka RL z limfocytów B (57% zahamo-wania wzrostu guza w dniu 20, p<0,05 w stosunku do grupy leczonej nośnikiem), podobnie jak obser-wowano dla niższej dawki CMC-544.
Schemat z kombinacją środków chemioterapeutycznych CHOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna i prednizon) jest najczęściej stosowaną metodą terapeutyczną w leczeniu pacjentów z chłoniakiem nieziarniczym. Przeciwnowotworowe działanie CHOP porównywano z działaniem CMC- -544 w ustabilizowanych ksenoprzeszczepach chłoniaka RL z limfocytów B. Poszczególne składniki schematu CHOP stosowano u myszy nagich w odpowiednich maksymalnych tolerowanych dawkach (danych nie podano), jak następuje: cyklofosfamid (C) 40 mg/kg IP, doksorubicyna (H) 3,3 mg/kg IP, winkrystyna (O) 0,5 mg/kg IP i prednizon (P) 0,2 mg/kg PO. CHO podawano Q4Dx3, a P podawano PO, Q2Dx5. CMC-544 podawano IP, Q4Dx3 w dawce 160 g/kg równoważnika kalicheamycyny. Le-czenie CHOP początkowo spowodowało znaczne hamowanie wzrostu chłoniaka RL z limfocytów B (Fig. 29). Jednakże, po 3 tygodniach guzy ponownie rosły z podobną szybkością wzrostu, jak w grupie leczonej nośnikiem. W przeciwieństwie do powyższego, przeciwnowotworowe działanie CMC-544 było całkowite i trwało przez cały okres badania. Wyniki te sugerują, że CMC-544, w dawkach znacznie niższych od maksymalnej dawki nieletalnej u myszy nagich, jest znacznie skuteczniejszy niż terapia skojarzona CHOP.
Badania te wykazują, że rituximab (RITUXAN), jako dodatek do CMC-544, spowodował znacz-ny wzrost aktywności cytotoksycznej CMC-544, obserwowanej w stosunku do komórek chłoniaka Ramos z limfocytów B. Donoszono ostatnio o synergistycznej interakcji rituximabu (RITUXAN) i glu-kokortykosterodów w komórkach Ramos. Ponadto, gdy rituximab (RITUXAN) podawano w kombinacji z 10 M deksametazonu, obserwowano synergistyczny wzrost zahamowania w 4 do 8 dodatkowych liniach komórkowych.
Zgodnie z doniesieniami, sam rituximab (RITUXAN) w dawce 0,4 do 10 g/ml, spowodował istotne, aczkolwiek małe (maksymalnie 18%) zahamowanie wzrostu komórek Ramos. Był on ponadto aktywny w 6 spośród 8 linii komórkowych chłoniaka nieziarniczego zależnego od limfocytów B, przy inkubacji w dawce 10 g/ml (48 godzin inkubacji). W publikacji Ghetie i in., wykazano, że po 24 godzi-nach inkubacji z komórkami Ramos, rituximab (RITUXAN), w dawce 10 g/ml, spowodował 6,2%
wzrostu apoptozy (w porównaniu z 3,5% dla komórek traktowanych nośnikiem). Zgodnie z bieżącymi badaniami, rituximab (RITUXAN), w dawkach 20 i 200 g/ml, gdy był podawany sam, nie miał wpływu na wzrost komórek Ramos. W badaniach na myszach nie stwierdzono żadnej interakcji pomiędzy CMC-544 i rituximabem (RITUXAN) ani w modelu rozsianym, ani w modelu podskórnego
kseno-przeszczepu. Badane kombinacje leków nie zakłócały ani nie wzmagały działania poszczególnych składników. Należało potwierdzić, czy zmniejszenie dawek każdego leku w modelu rozsianym wpłynie na zmianę w tych obserwacjach.
Model rozsianego chłoniaka zależnego od limfocytów B z komórkami Ramos został opisany w publikacji Flavell i in. Zgodnie z doniesieniami, średnia czasów przeżycia w grupie myszy leczonych nośnikiem wynosiła 34–36 dni. U myszy rozwijało się porażenie kończyn tylnych, które postępowało, powodując stan konania, a wkrótce potem śmierć. Analiza histologiczna narządów wykazała, że naj-częściej atakowanymi narządami były nadnercza, śledziona i przestrzeń podpajęczynówkowa. W prze-strzeni podpajęczynówkowej często pojawiają się nacieki rozszerzające się w kierunku mózgu. Ritu-ximab (RITUXAN) działał dobrze, gdy podawano go we wczesnej fazie procesu chorobowego myszom SCID z rozsianym chłoniakiem (Fig. 23), ale był mniej skuteczny przy podawaniu dnia 9 w modelu z ustabilizowaną fazą (Fig. 24). Rituximab (RITUXAN), będący izotypem IgG1, najprawdopodobniej działa poprzez mechanizmy efektorowe mysiego gospodarza. Mechanizmy te obejmują cytotoksycz-ność, której pośredniczy dopełniacz i/lub zależną od przeciwciała cytotoksyczność komórkową po-przez rekrutację komórek naturalnych zabójców, które są obecne u myszy SCID. Wstrzyknięte komór-ki nowotworowe Ramos prawdopodobnie stają się wcześniej bardziej podatne na mechanizmy odpor-nościowe gospodarza, które aktywowano rituximabem (RITUXAN), zanim zyskają możliwość nacieka-nia do dotkniętych narządów. Nieskoniugowanego przeciwciała G5/44 (cząsteczka kierująca w CMC- -544) nie badano jeszcze w modelu rozsianego guza u myszy SCID, ale nie odnotowano jego działa-nia przy podawaniu w modelu podskórnych ksenoprzeszczepów. Nie oczekuje się, że G5/44, jako izotyp IgG4, będzie aktywował mechanizmy efektorowe gospodarza, a tym samym będzie miał działa-nie przeciwnowotworowe.
G5/44 skoniugowany z kalicheamycyną (CMC-544) działa w przeciwny sposób niż rituximab (RITUXAN), dając lepsze wyniki przy podawaniu w ustabilizowanej fazie choroby. Przyczyna, dla któ-rej CMC-544 ma lepsze działanie w ustabilizowanej fazie, nie jest jasna, ale faza ustabilizowana w bliższym stopniu odzwierciedla sytuację kliniczną. CMA-676, dopasowany izotyp, niewiążący koniu-gat kontrolny, nie miał znacznego wpływu na średnie czasy przeżycia. Wyniki w modelu myszy SCID z rozsianym chłoniakiem sugerują wyraźnie, że w celu określenia maksymalnej dawki skutecznej (MED), dawki CMC-544 należy zmniejszyć. Dawka 160 g/kg była mniej aktywna od niższych dawek 80 i 40 g/kg. Powód nie jest jasny, ale dawka 160 g/kg może znacznie przekraczać dawkę MED.
Problemowi temu poświęcono dalsze badania.
Zgodnie z publikacją Mohammad i in., terapię CHOP (cyklofosfamid (C) 40 mg/kg IV, oksorubi-cyna (H) 3,3 mg/kg IV, winkrystyna (O) 0,5 mg/kg IV i prednizon (P) 0,2 mg/kg PO) stosowano w modelu podskórnych przeszczepów z linią komórkową rozsianego wielokomórkowego chłoniaka, DLCL. Jako dawki w terapii CHOP stosowano dawki oznaczone jako maksymalne dawki tolerowane.
Leczenie, CHO podawane raz IV i P, stosowane raz dziennie przez 5 dni, uważano za „aktywne”
i uzyskano wartość T/C 25,8%. Nie zapisywano liczy wyleczonych nowotworów. Wyniki w modelu opisanym przez Mohammada i in., wydają się podobne do obserwowanych w terapii CHOP (podawa-nej IP, Q4Dx3) w opisanym tu modelu RL. W przeciwieństwie do CMC-544, w żadnym z badań CHOP nie uzyskano wyniku długotrwałych wyleczeń.
T A B E L A 10: OPISOWE POMIARY CZASU PRZEŻYCIA W BADANIACH KOMBINACJI Leczenie Średni czas
przeżycia Średnia
przeżycia Średnia