(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/US03/013910

(1)

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej

(21) Numer zgłoszenia: 410219

(22) Data zgłoszenia: 02.05.2003

(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:

374523

(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

02.05.2003, PCT/US03/013910

(87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

13.11.2003, WO03/092623

(13)

B1

(51) Int.Cl.

A61K 47/48 (2006.01) A61K 39/395 (2006.01) A61K 31/704 (2006.01)

(54) Kompozycja zawierająca koniugat leku obejmujący pochodne kalicheamycyny i przeciwciało, oraz kompozycja farmaceutyczna ją zawierająca

(30) Pierwszeństwo:

02.05.2002, US, 60/377,440

(43) Zgłoszenie ogłoszono:

31.10.2005 BUP 22/05

(45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.11.2016 WUP 11/16

(73) Uprawniony z patentu:

WYETH HOLDINGS LLC, Nowy Jork, US (72) Twórca(y) wynalazku:

ARTHUR KUNZ, New City, US

JUSTIN KEITH MORAN, Valley Cottage, US JOSEPH THOMAS RUBINO, Towaco, US NEERA JAIN, New City, US

EUGENE JOSEPH VIDUNAS, Middletown, US JOHN MCLEAN SIMPSON, Upper Nyack, US PAUL DAVID ROBBINS, Upper Nyack, US NISHITH MERCHANT, Palisades Park, US JOHN FRANCIS DIJOSEPH, Woodbridge, US MARK EDWARD RUPPEN, Garnerville, US NITIN KRISHNAJI DAMLE,

Upper Saddle River, US

ANDREW GEORGE POPPLEWELL, Staines, GB

(74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Magdalena Tagowska

PL 22 41 5 0 B1

(2)

Opis wynalazku

Wynalazek dotyczy kompozycji zawierającej koniugat leku obejmujący pochodne kalicheamycyny i przeciwciało, oraz kompozycji farmaceutycznej zawierającej taką kompozycję.

Niniejszym ujawniono sposoby wytwarzania koniugatów monomeryczny cytotoksyczny lek/nośnik („koniugatów") o wyższym ładunku leku i zasadniczo zmniejszonej frakcji niskoskoniugowanej (LCF).

Wynalazek dotyczy, zwłaszcza koniugatów przeciwciało przeciwko CD22 – monomeryczna kalicheamycyna. Oprócz koniugatów i kompozycji farmaceutycznych zawierających takie koniugaty według wynalazku, niniejszym przedstawiono sposoby oczyszczania koniugatów oraz ich zastosowanie.

STAN TECHNIKI

Koniugaty leków opracowane do ogólnoustrojowej farmakoterapii są swoistymi wobec celu środ- kami cytotoksycznymi. Koncepcja ta polega na sprzęganiu środka terapeutycznego z cząsteczką nośni- ka swoistego wobec określonej populacji komórek docelowych. Jako reszty kierujące naturalny wybór stanowią przeciwciała o wysokim powinowactwie wobec antygenów. Wraz z dostępnością przeciwciał monoklonalnych o wysokim powinowactwie obiecujące stały się perspektywy uzyskania środków terapeutycznych kierujących z przeciwciałem. Substancje toksyczne, które sprzęgano z przeciwciałami mo- noklonalnymi, obejmują toksyny, leki cytotoksyczne o niskim ciężarze cząsteczkowym, modyfikatory odpowiedzi biologicznej oraz radionuklidy. Koniugaty przeciwciało – toksyna nazywane są często „im- munotoksynami", podczas gdy immunokoniugaty składające się z przeciwciał i leków o niskim ciężarze cząsteczkowym, takich jak metotreksat i adriamycyna (ADRIAMYCIN), określane są mianem „chemio- immunokoniugaty". Immunomodulatory obejmują modyfikatory odpowiedzi biologicznej, które są znane z funkcji regulujących, takie jak limfokiny, czynniki wzrostu oraz aktywujący dopełniacz czynnik jadu ko- bry (CVF). Radioimmunokoniugaty składają się z radioaktywnych izotopów, które mogą być stosowane jako środki terapeutyczne do zabijania komórek przez napromienienie lub też do obrazowania. Oczekuje się, że specyficzne dostarczanie leków cytotoksycznych do komórek nowotworowych za pośrednictwem przeciwciała nie tylko zwiększy ich skuteczność przeciwnowotworową, ale również zapobiegnie niecelo- wanemu wychwytowi przez prawidłowe tkanki, poszerzając tym samym ich zastosowanie terapeutyczne.

Wynalazek wykorzystuje immunokoniugaty obejmujące przeciwciało jako kierujący nośnik, o swoistości wobec determinant antygenowych na powierzchni komórek nowotworowych sprzężone z lekiem cytotoksycznym. Wynalazek dotyczy koniugatów cytotoksyczny lek – przeciwciało, w których przeciwciało wykazuje swoistość wobec determinant antygenowych w nowotworach złośliwych zależ- nych od limfocytów B, zaburzeniach limfoproliferacyjnych oraz przewlekłych chorobach zapalnych.

Niniejszym przedstawiono także sposoby wytwarzania immunokoniugatów oraz ich zastosowania terapeutyczne.

Do stosowania klinicznego w leczeniu różnych chorób, obejmujących raka i reumatoidalne za- palenie stawów, zatwierdzono wiele środków terapeutycznych opartych na przeciwciałach lub też są one poddawane badaniom klinicznym w wielu nowotworach złośliwych, obejmujących nowotwory zło- śliwe zależne od limfocytów B i chłoniaki nieziarnicze. Jednym z takich środków opartych na przeciw- ciałach jest rituximab (RITUXAN), nieznakowane chimeryczne ludzkie przeciwciało 1γ (region + + mγ1V), które jest swoiste dla antygenu CD20 powierzchni komórki, wyrażanego na limfocytach B.

Oparte na przeciwciałach środki terapeutyczne są zależne od cytotoksyczności z udziałem dopełniacza (CDCC) lub od zależnej od przeciwciał cytotoksyczności komórkowej (ADDC) wobec limfocytów B, bądź też od stosowania radionuklidów, takich jak ¹³¹I lub ⁹⁰Y, co stwarza problemy związane z wytwarza- niem i stosowaniem dla klinicystów i pacjentów. W konsekwencji istnieje zapotrzebowanie na genera- cję immunokoniugatów, które są pozbawione wad właściwych dla aktualnie stosowanych środków terapeutycznych opartych na przeciwciałach, do leczenia wielu nowotworów złośliwych, obejmujących nowotwory złośliwe układu krwiotwórczego, jak chłoniaki nieziarnicze (NHL) i które można łatwo i skutecznie wytwarzać i wielokrotnie stosować bez wywoływania odpowiedzi odpornościowej.

Do stosowania w leczeniu szpiczaków opracowano immunokoniugaty obejmujące związek z rodziny silnych środków przeciwbakteryjnych i przeciwnowotworowych, znanych pod wspólną nazwą kalicheamycyny lub kompleks LL-E33288 (patrz patent USA nr 4,970,198 (1990)). Najsilniejsze kalicheamycyny oznaczono jako γ, a w niniejszym opisie po prostu jako „gamma". Związki te zawierają metylotrisulfid, który można poddać reakcji z odpowiednimi tiolami, uzyskując disulfid i w tym samym czasie można wprowadzić grupę funkcyjną, taką jak grupa hydrazydowa lub inna grupa funkcyjna, która jest użyteczna do przyłączenia pochodnej kalicheamycyny do nośnika. (Patrz patent USA nr 5,053,394). W pracach nad terapiami wielu różnych nowotworów stosowanie monomerycznych koniu-

(3)

gatów pochodna kalicheamycyny/nośnik było ograniczone przez dostępność konkretnych środków kierujących (nośników), jak również przez metodologie sprzęgania, które prowadzą do powstawania agregatów białkowych, gdy wzrasta ilość pochodnej kalicheamycyny (tj. obciążenie lekiem) skoniugo- wanej z nośnikiem. Ponieważ wyższe obciążenie lekiem zwiększa siłę działania koniugatu, a zatem wskazane jest możliwe największe obciążenie nośnika lekiem, o ile zachowane jest powinowactwo wobec białkowego nośnika. Obecność agregatów białek, które mogą być nieswoiście toksyczne i im- munogenne, a zatem powinny być wyeliminowane w zastosowaniach terapeutycznych, sprawia, że proces wytwarzania takich koniugatów w skali przemysłowej jest utrudniony, a wydajność produktów spada. Ilość kalicheamycyny wprowadzonej do białka nośnika (obciążenie lekiem) ilość agregatu wytworzonego w reakcji sprzęgania oraz możliwa do uzyskania wydajność końcowego oczyszczonego monomerycznego koniugatu są ze sobą powiązane. A zatem, należy wypracować kompromis pomię- dzy wyższym obciążeniem lekiem i wydajnością końcowego monomeru, przez regulowanie ilości reaktywnej pochodnej kalicheamycyny, którą dodaje się w reakcji sprzęgania.

Tendencja cytotoksycznych koniugatów leków, a zwłaszcza koniugatów kalicheamycyny, do tworzenia agregatów, staje się problematyczna zwłaszcza wówczas, gdy reakcje sprzęgania prowadzi się stosując łączniki opisane w patentach USA nr 5,877,296 i 5,773,001, których treść wprowadza się tu w całości przez odniesienie. W takim przypadku wytworzone koniugaty w dużym procencie są w postaci agregatów, a oczyszczenie koniugatów wytworzonych tymi oryginalnymi sposobami (proces CMA) do zastosowania terapeutycznego, jest dosyć trudne. W przypadku niektórych białek nośniko- wych nie jest wirtualnie możliwe wytworzenie koniugatów nawet z umiarkowanymi obciążeniami, z wyjątkiem produkcji w małej skali. W konsekwencji istnieje pilne zapotrzebowanie na ulepszone sposoby sprzęgania cytotoksycznych leków, takich jak kalicheamycyna, z nośnikami, które zminimali- zują ilość wytwarzanych agregatów, a tym samym pozwolą na możliwie wysokie obciążenie lekiem w połączeniu z rozsądną wydajnością produktu.

Ujawniono już sposoby sprzęgania, w których wytwarza się monomeryczny koniugat pochodna kalicheamycyny/nośnik o wyższym obciążeniu lekiem i z wyższą wydajnością oraz o zmniejszonym two- rzeniu się agregatów (patrz patenty USA nr 5,712,374 i 5,714,586, wprowadzone tu w całości przez odniesienie). Aczkolwiek w sposobach tych uzyskano koniugaty o zasadniczo zmniejszonej zawartości agregatu, stwierdzono następnie, że wytworzone koniugaty zawierają niepożądane wysokie poziomy (% powierzchni w HPLC, 45–65%) niskoskoniugowanej frakcji (LCF), frakcji, która składa się głównie z niesprzężonego przeciwciała. Obecność LCF w produkcie powoduje nieefektywne wykorzystanie przeciwciała, ponieważ frakcja ta nie zawiera cytotoksycznego leku. Może ona również współzawodni- czyć z koniugatem kalicheamycyna – nośnik, potencjalnie ograniczając możliwość dotarcia koniugatu do celu, a tym samym zmniejszając skuteczność cytotoksycznego leku. Tak więc, pożądany jest ulepszony sposób sprzęgania, w którym będzie można uzyskać znacznie mniejsze poziomy LCF, dopuszczalne poziomy ilości wytworzonych agregatów, bez znacznej zmiany własności fizycznych koniugatu.

STRESZCZENIE WYNALAZKU

Kompozycja według wynalazku zawierająca koniugat leku obejmujący pochodne kalicheamycyny oraz przeciwciało, który jest przedstawiony wzorem przedstawionym na Fig. 17, przy czym przeciw- ciało obejmuje sekwencję SEKW. NR ID: 1 jako CDR-H1, reszty 50–66 sekwencji SEKW. NR ID: 27 dla CDR-H2, SEKW. NR ID: 3 dla CDR-H3, SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2 oraz SEKW. NR ID: 6 dla CDR-13;

kalicheamycyna stanowi 4–10% wagowych koniugatu leku;

n oznacza 3 do 9; a

kompozycja zawiera mniej niż 10% wagowo nieskoniugowanego przeciwciała.

Korzystnie przeciwciało koniugatu kompozycji według wynalazku obejmuje region zmienny łań- cucha lekkiego, jak przedstawiono w SEKW. NR ID: 19 i region zmienny łańcucha ciężkiego, jak przedstawiono w SEKW. NR ID: 27.

Również w korzystnej postaci wykonania przeciwciało koniugatu kompozycji według wynalazku obejmuje łańcuch lekki składający się z reszt 21 do 239 sekwencji SEKW. NR ID: 28 oraz łańcuch ciężki składający się z reszt 20 do 466 sekwencji SEKW. NR ID: 30, przy czym przeciwciało jest wyra- żane w komórce ssaczej.

Korzystnie, kompozycja według wynalazku obejmuje koniugat przeciwciała obejmującego łań- cuch lekki składający się z sekwencji aminokwasowej wynikającej z ekspresji sekwencji SEKW. NR ID: 29 w komórce ssaczej, oraz łańcuch ciężki składający się z sekwencji aminokwasowej wynikającej z ekspresji SEKW. NR ID: 31 w komórce ssaczej.

(4)

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca wyżej opisaną kompozycję według wynalazku oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą, rozcień- czalnik lub nośnik.

Niniejszym ujawniono sposoby wytwarzania monomerycznych koniugatów cytotoksyczny lek/- nośnik („koniugatów"), takich jak koniugat w kompozycji według wynalazku, o wyższym obciążeniu i zasadniczo zmniejszonej zawartości frakcji niskoskoniugowanej (LCF). Niniejszym opisane zostały monomeryczne koniugaty pochodna kalicheamycyny – nośnik, koniugaty, kompozycje, sposoby oczyszczania koniugatów oraz zastosowania koniugatów. Bardziej konkretnie, niniejszym opisano sposoby wytwarzania monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny – przeciwciało przeciwko CD22 (CMC-544).

W jednym z ujawnień opisano ulepszony sposób sprzęgania do wytwarzania koniugatów, w którym uzyskuje się znacznie mniejsze poziomy LCF (poniżej 10%) bez zasadniczej zmiany własno- ści fizycznych lub chemicznych. Niniejszym opisano dalsze ulepszenie sposobu sprzęgania, w wyniku którego uzyskuje się nie tylko znaczące zmniejszenie poziomów LCF, ale również znaczące zmniejszenie tworzenia się agregatów w porównaniu ze znanymi sposobami, jak również uzyskuje się znacznie większe obciążenie lekiem. Opisane tu koniugaty mają wzór:

Pr(-X-W)m

w którym:

Pr oznacza białkopodobny nośnik,

X oznacza łącznik, który obejmuje produkt dowolnej grupy reaktywnej, która może reagować z białkopodobnym nośnikiem,

W oznacza cytotoksyczny lek;

m oznacza średnie obciążenie dla oczyszczonego produktu sprzęgania, przy którym cytotoksyczny lek stanowi 7-9% wagowych koniugatu; a

(-X-W)m oznacza pochodną cytotoksycznego leku.

Koniugaty można wytwarzać sposobem obejmującym etapy: (1) dodanie pochodnej cytotoksycznego leku do białkopodobnego nośnika, przy czym pochodna cytotoksycznego leku stanowi 4,5–11%

wagowych białkopodobnego nośnika; (2) inkubowanie pochodnej cytotoksycznego leku i białkowo- dobnego nośnika w nienukleofilowym, kompatybilnym z białkiem, buforowanym roztworze o pH w zakresie od około 7 do 9, z wytworzeniem monomerycznego koniugatu cytotoksyczny lek/nośnik, przy czym roztwór ten obejmuje ponadto (a) organiczny współrozpuszczalnik, oraz (b) dodatek zawierający co najmniej jeden kwas C6-C18 karboksylowy lub jego sól, przy czym inkubację prowadzi się w temperaturze w zakresie od około 30°C do około 35°C w czasie w zakresie od około 15 minut do 24 godzin;

oraz (3) poddanie koniugatu wytworzonego w etapie (2) rozdzielaniu na drodze chromatografii, w celu oddzielenia monomerycznych koniugatów pochodna cytotoksycznego leku/białkopodobny nośnik o obcią- żeniu cytotoksycznym lekiem w zakresie 4–10% wagowych i zawartości niskoskoniugowanej frakcji po- niżej 10%, od nieskoniugowanego białkopodobnego nośnika, pochodnej cytotoksycznego leku i zagre- gowanych koniugatów.

Opisany niniejszym, białkopodobny nośnik koniugatu jest wybrany z grupy obejmującej hormony, czynniki wzrostu, przeciwciała, fragmenty przeciwciał, mimetyki przeciwciał oraz ich odpowiedniki wytworzone genetycznie lub enzymatycznie.

Według wynalazku, białkopodobnym nośnikiem w koniugacie kompozycji jest przeciwciało.

Przeciwciało może być wybrane z grupy obejmującej przeciwciało monoklonalne, przeciwciało chimeryczne, ludzkie przeciwciało, humanizowane przeciwciało, przeciwciało jednołańcuchowe, fragment Fab i fragment F(ab)2.

Opisane tu humanizowane przeciwciało jest skierowane przeciwko antygenowi powierzchni komórki CD22.

Humanizowanym przeciwciałem stosowanym w rozwiązaniach według wynalazku jest przeciw- ciało przeciwko CD22 z przeszczepionym CDR, które obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego 5/44-gL1 (SEKW. NR ID: 19) oraz region zmienny łańcucha ciężkiego 5/44-gH7 (SEKW. NR ID: 27).

Korzystnie, humanizowanym przeciwciałem przeciwko CD22 jest przeciwciało z przeszczepionym CDR, obejmujące łańcuch lekki o sekwencji przedstawionej jako reszty 21 do 239 sekwencji SEKW. NR ID: 28 oraz łańcuch ciężki o sekwencji przedstawionej jako reszty 20 do 466 sekwencji SEKW. NR ID: 30.

(5)

Cytotoksycznym lekiem, który można stosować do wytwarzania monomerycznego koniugatu cytotoksyczny lek/nośnik sposobem tu opisanym jest inhibitor polimeryzacji tubuliny, czynnik alkilujący, który wiąże się i rozrywa DNA, inhibitor syntezy białek albo inhibitor kinaz tyrozynowych.

Opisany powyżej cytotoksyczny lek jest wybrany spośród kalicheamycyn, tiotepy, taksanów, daunorubicyny, doksorubicyny, epirubicyny, esperamycyn, aktynomycyny, autramycyny, azaseryn, bleomycyn, tamoksyfenu idarubicyny, dolastatyn/aurystatyn, hemiasterlin i maytanzynoidów.

Według wynalazku, cytotoksycznym lekiem jest kalicheamycyna. W szczególnie korzystnym wykonaniu, kalicheamycyną jest gamma-kalicheamycyna lub pochodna N-acetylowa gamma-kalicheamycyny.

Cytotoksyczny lek może być funkcjonalizowany 3-merkapto-3-metylobutanoilohydrazydem i jest sprzężony z białkopodobnym nośnikiem przez ulegający hydrolizie łącznik, który jest zdolny do uwolnienia cytotoksycznego leku z koniugatu po jego związaniu i wejściu do komórek docelowych.

Jako zdolny do hydrolizy łącznik można stosować kwas 4-(4-acetylofenoksy)-butanowy (AcBut).

W celu zmniejszenia agregacji i zwiększenia obciążenia lekiem, jako dodatek w sposobie sprzę- gania stosuje się kwas oktanowy lub jego sól, albo kwas dekanowy lub jego sól.

Koniugaty stosowane w kompozycji według wynalazku oczyszcza się przez rozdzielanie meto- dą chromatografii.

Jako sposób rozdzielania metodą chromatografii do oddzielenia monomerycznego koniugatu pochodna leku-nośnik stosuje się chromatografię wykluczania zależnego od wielkości cząstek (SEC).

Jako sposób chromatograficznego rozdzielania do oddzielenia monomerycznego koniugatu pochodna leku-nośnik, można też stosować HPLC, FPLC lub chromatografię z użyciem SEPHACRYL®

S-200.

Ponadto, jako sposób chromatograficznego rozdzielania do oddzielenia monomerycznego koniugatu pochodna leku-nośnik, stosuje się chromatografię z interakcją hydrofobową (HIC). HIC można prowadzić stosując ośrodek do chromatografii Fenyl SEPHAROSE® 6 Fast Flow, Butyl SEPHARO- SE® 4 Fast Flow, Octyl SEPHAROSE® 4 Fast Flow, TOYOPEARL® Ether-650M, ośrodek MACRO- -PREP metyl HIC lub MACRO-PREP t-Butyl HIC. Szczególnie korzysny do prowadzenia HIC jest ośrodek do chromatografii Butyl SEPHAROSE® 4 Fast Flow.

Niniejszym opisano monomeryczny koniugat pochodna cytotoksycznego leku/nośnik, wytwo- rzony wyżej wskazanym sposobem. Według wynalazku w koniugacie, jako cytotoksyczny lek stosuje się kalicheamycynę, a jako nośnik stosuje się przeciwciało.

Przeciwciało do stosowania w opisanych koniugatach jest wybrane z grupy obejmującej prze- ciwciało monoklonalne, przeciwciało chimeryczne, ludzkie przeciwciało, humanizowane przeciwciało, przeciwciało jednołańcuchowe, fragment Fab i fragment F(ab)2. Według wynalazku jako przeciwciało w koniugacie stosuje się humanizowane przeciwciało skierowane przeciwko antygenowi powierzchni komórki CD22. W szczególności, humanizowanym przeciwciałem przeciwko-CD22 jest korzystnie prze- ciwciało z przeszczepionym CDR, które obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego 5/44-gL1 (SEKW.

NR ID: 19) oraz region zmienny łańcucha ciężkiego 5/44-gH7 (SEKW. NR ID: 27).

Humanizowanym przeciwciałem w koniugacie stosowanym według wynalazku jest humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 z przeszczepionym CDR, obejmujące fragment łańcucha lekkiego o sekwencji przedstawionej w SEKW. NR ID: 28 oraz fragment łańcucha ciężkiego o sekwencji przedstawionej w SEKW. NR ID:30.

Humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 może być przeciwciałem z przeszczepionym CDR, które jest wariantem przeciwciała otrzymanego metodą dojrzewania powinowactwa i ma zwięk- szone powinowactwo wobec ludzkiego CD22.

Kalicheamycyna w koniugacie kompozycji według wynalazku jest N-acetylo-gamma-kaliche- amycyną.

Pochodna kalicheamycyny może być funkcjonalizowana 3-merkapto-3-metylo-butanoilohydra- zydem.

Łącznikiem stosowanym do sprzęgania leku z nośnikiem, jak to zostało niniejszym opisane, jest ulegający hydrolizie łącznik, który jest zdolny do uwolnienia cytotoksycznego leku z koniugatu po jego związaniu i wejściu do komórek docelowych. Zdolnym do hydrolizy łącznikiem może być kwas 4-(4- -acetylofenoksy)butanowy (AcBut).

Niniejszym opisano również monomeryczny koniugat pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciw-CD22, o wzorze Pr(X-S-S-W)_m, w którym: Pr oznacza przeciwciało przeciwko CD22; X oznacza zdolny do hydrolizy łącznik, który obejmuje produkt dowolnej grupy reaktywnej, która może re-

(6)

agować z przeciwciałem; W oznacza rodnik kalicheamycyny; m oznacza średnie obciążenie dla oczyszczonego produktu sprzęgania, przy którym kalicheamycyna stanowi 4–10% wagowych koniugatu; a (-X-S-S-W)m oznacza pochodną kalicheamycyny.

Wyżej wskazane przeciwciało jest wybrane z grupy obejmującej przeciwciało monoklonalne, przeciwciało chimeryczne, ludzkie przeciwciało, humanizowane przeciwciało, przeciwciało jednołańcu- chowe, fragment Fab i fragment F(ab)2.

Przeciwciałem jest przeciwciało przeciwko CD22 o swoistości wobec ludzkiego CD22, które zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych jako H1 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 1) dla CDR-H1, jako H2 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 2) albo jako H2' (SEKW. NR ID: 13) lub jako H2" (SEKW. NR ID: 15) albo jako H2'" (SEKW. NR ID:

16) dla CDR-H2, lub jako H3 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 3) dla CDR-H3, oraz łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych jako L1 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 4) dla CDR-L1, jak L2 na Fig. (SEKW. NR ID: 5) dla CDR-L2, albo L3 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 6) dla CDR-L3.

Przeciwciało przeciwko CD22 może zawierać łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych w SEKW. NR ID: 1 dla CDR-H1, SEKW. NR ID: 2 lub SEKW. NR ID: 13 lub SEKW. NR ID: 15 lub SEKW. NR ID: 16 dla CDR-H2, albo SEKW. NR ID: 3 dla CDR-H3, oraz łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych w SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2, albo SEKW. NR ID: 6 dla CDR-L3.

Przeciwciało przeciwko CD20 może obejmować SEKW. NR ID: 1 dla CDR-H1, SEKW. NR ID: 2 albo SEKW. NR ID: 13 lub SEKW. NR ID: 15 albo SEKW. NR ID: 16 dla CDR-H2, SEKW. NR ID: 3 dla CDR-H3, SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2, oraz SEKW. NR ID: 6 dla CDR-L3.

Humanizowanym przeciwciałem przeciwko CD22 może być także przeciwciało przeciwko CD22 z przeszczepionym CDR, które obejmuje domenę zmienną obejmującą regiony zrębowe ludzkiego akceptora i CDR nie-ludzkiego donora.

Inne opisane tu humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 zawiera region zrębowy ludzkiego akceptora, w którym regiony domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała są oparte na ludzkiej sekwencji zgodności podgrupy I i w pozycjach 1, 28, 48, 71 i 93 zawierają reszty nie-ludzkiego donora. W innym wykonaniu, humanizowane przeciwciało zawiera ponadto reszty nie-ludzkiego donora w pozycjach 67 i 69.

Humanizowane przeciwciało z przeszczepionym CDR może obejmować domenę zmienną łańcu- cha lekkiego obejmującą region zrębowy ludzkiego akceptora oparty na ludzkiej sekwencji zgodności podgrupy I, która ponadto zawiera reszty nieludzkiego donora w pozycjach 2, 4, 37, 38, 45 i 60. Prze- ciwciało z przeszczepionym CDR może ponadto zawierać resztę nie-ludzkiego donora w pozycji 3.

Zgodnie z wynalazkiem, przeciwciało w koniugacie jest przeciwciałem z przeszczepionym CDR i obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego 5/44-gL1 (SEKW. NR ID: 19) oraz region zmienny łań- cucha ciężkiego 5/44-gH7 (SEKW. NR ID: 27).

Przeciwciało z przeszczepionym CDR zgodnie z wynalazkiem obejmuje łańcuch lekki składają- cy się z reszt 21 do 239 sekwencji z SEKW. NR ID: 28 oraz łańcuch ciężki składający się z reszt 20 do 466 sekwencji z SEKW. NR ID: 30.

Przeciwciało przeciwko CD22 z przeszczepionym CDR może stanowić wariant przeciwciała otrzymany metodą dojrzewania powinowactwa i ma zwiększone powinowactwo wobec ludzkiego CD22.

Opisane tu przeciwciało przeciwko CD22 może być chimerycznym przeciwciałem obejmującym sekwencje domen zmiennych łańcucha lekkiego i ciężkiego przeciwciała monoklonalnego, jak przedstawione odpowiednio w SEKW. NR ID: 7 i SEKW. NR ID: 8.

Alternatywnie przeciwciało przeciwko CD22 obejmuje hybrydowy CDR ze skróconą sekwencją CDR donora, w której brakującą część CDR donora zastąpiono inną sekwencją, która tworzy funkcjo- nalny CDR.

Według wynalazku pochodną cytotoksycznego leku stanowi N-acetylo-pochodna gamma-kalicheamycyny.

Niniejszym opisano sposób wytwarzania stabilnej, liofilizowanej kompozycji monomerycznego koniugatu pochodna cytotoksycznego leku/nośnik. Stabilną liofilizowaną kompozycję monomerycznego koniugatu pochodna cytotoksycznego leku/nośnik wytwarza się przez (a) rozpuszczenie monomerycznego koniugatu pochodna cytotoksycznego leku/nośnik do końcowego stężenia 0,5 do 2 mg/ml

(7)

w roztworze zawierającym środek krioochronny w stężeniu 1,5%–5% wagowych, polimerowy wypeł- niacz w stężeniu 0,5–1,5% wagowych, elektrolity w stężeniu 0,01 M do 0,1 M, czynnik ułatwiający rozpuszczanie w stężeniu 0,005–0,05% wagowych, czynnik buforujący w stężeniu 5–50 mM, przy którym końcowe pH roztworu mieści się w zakresie 7,8–8,2, oraz wodę; (b) porcjowanie powyższego roztworu do fiolek w temperaturze +5°C do +10°C; (c) zamrożenie roztworu w temperaturze mrożenia -35°C do -50°C; (d) poddanie zamrożonego roztworu początkowemu etapowi liofilizacji pod pierwszym ciśnieniem suszenia wynoszącym ok. 2,67 do 10,67 Pa (20 do 80 mikronów) przy temperaturze przechowywania od -10°C do -40°C przez 24 do 78 godzin; oraz (e) poddanie liofilizowanego produktu z etapu (d) drugiemu etapowi suszenia pod ciśnieniem suszenia wynoszącym ok. 2,67 do 10,67 Pa (20 do 80 mikronów) przy temperaturze przechowywania od +10°C do + 35°C przez 15 do 30 godzin.

Środek krioochronny stosowany do liofilizacji koniugatu cytotoksyczny lek/nośnik może być wybrany z grupy obejmującej alditol, mannitol, sorbitol, inozytol, glikol polietylenowy, kwas aldonowy, kwas uronowy, kwas aldarowy, aldozy, ketozy, aminocukry, alditole, inozytole, gliceroaldehydy, arabi- nozę, liksozę, pentozę, rybozę, ksylozę, galaktozę, glukozę, heksozę, idozę, mannozę, talozę, hepto- zę, glukozę, fruktozę, kwas glukonowy, sorbitol, laktozę, mannitol, metylo--glukopiranozyd, maltozę, kwas izoaskorbinowy, kwas askorbinowy, sorbozę, kwas glukarynowy, erytrozę, treozę, arabinozę, allozę, altrozę, gulozę, idozę, talozę, erytrulozę, rybolozę, ksylulozę, psikozę, tagatozę, kwas glukoro- nowy, kwas glukonowy, kwas glukarynowy, kwas galakturonowy, kwas mannuronowy, glukozaminę, galaktozaminę, sacharozę, trehalozę, kwas neuraminowy, arabinany, fruktany, galaktany, galakturo- niany, glukany, mannany, ksylany, lewan, fukoidan, karageninę, galaktokorolozę, pektyny, kwasy pek- tynowe, amylozę, pullulan, glukogen, amylopektynę, celulozę, dekstran, pustulan, chitynę, agarozę, keratynę, chrondroitynę, dermatan, kwas hialuronowy, kwas alginowy, żywicę ksantanową, skrobię, sacharozę, glukozę, laktozę, trehalozę, glikol etylenowy, glikol polietylenowy, glikol polipropylenowy, glicerol i pentaerytrytol.

Korzystnie środkiem krioochronnym jest sacharoza, która jest obecna w stężeniu 1,5% wagowych.

Polimerowy wypełniacz stosowany w sposobie liofilizacji może być wybrany spośród dekstranu 40 lub hydroksyetyloskrobi 40, a jego stężenie wynosi 0,9% wagowych.

Elektrolitem stosowanym w roztworze liofilizacyjnym może być chlorek sodu, który jest obecny w stężeniu 0,05 M.

W opisanym sposobie liofilizacji stosuje się czynnik ułatwiający rozpuszczanie. Korzystnie, czynnikiem ułatwiającym rozpuszczanie jest środek powierzchniowo czynny. Szczególnie korzystnie, środkiem powierzchniowo czynnym może być polisorbat 80, który jest obecny w stężeniu 0,01% wagowych.

Jako środek buforujący stosuje się trometaminę, która jest obecna w stężeniu 0,02 M. Korzyst- nie, na początku etapu liofilizacji pH roztworu wynosi 8,0. Roztwór zawierający koniugat cytotoksyczny lek/nośnik porcjuje się do fiolek w temperaturze +5°C przed rozpoczęciem tego etapu.

Roztwór w fiolkach zamraża się w temperaturze -45°C; zamrożony roztwór poddaje się począt- kowemu etapowi liofilizacji w warunkach pierwszego ciśnienia suszenia wynoszącego ok. 8 Pa (60 mikronów) i w temperaturze przechowywania -30°C przez 60 godzin; liofilizowany produkt poddaje się drugiemu etapowi suszenia w warunkach drugiego ciśnienia wynoszącego ok. 8 Pa (60 mikronów) i w temperaturze przechowywania +25°C przez 24 godziny.

Niniejszym ujawniono kompozycję zawierającą terapeutycznie skuteczną dawkę monomerycznego koniugatu pochodna cytotoksycznego leku/nośnik wytworzonego wyżej opisanym sposobem.

Nośnikiem w monomerycznym koniugacie pochodna cytotoksycznego leku/nośnik jest białko- podobny nośnik wybrany spośród hormonów, czynników wzrostu, przeciwciał i mimetyków przeciwciał.

Białkopodobnym nośnikiem może być ludzkie przeciwciało monoklonalne, przeciwciało chimeryczne, ludzkie przeciwciało lub przeciwciało humanizowane.

Humanizowane przeciwciało jest korzystnie skierowane przeciwko antygenowi powierzchni ko- mórki CD22.

Przeciwciało przeciwko CD22 wykazuje swoistość wobec ludzkiego CD22 i zawiera łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych jako H1 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 1) dla CDR-H1, jako H2 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 2) albo H2' (SEKW. NR ID: 13) lub H2" (SEKW. NR ID: 15) lub H2"' (SEKW. NR ID: 16) dla CDR-H2, lub jako H3 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 3) dla CDR-H3, oraz obejmuje łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych jako L1 na Fig. 1 (SEKW. NR

(8)

ID: 4) dla CDR-L1, jako L2 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 5) dla CDR-L2, albo jako L3 na Fig. 1 (SEKW. NR ID: 6) dla CDR-L3.

Przeciwciało przeciwko CD22 zawiera, korzystnie, łańcuch ciężki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych w SEKW. NR ID: 1 dla CDR- -H1, SEKW. NR ID: 2 lub SEKW. NR ID: 13 lub SEKW. NR ID: 15 lub SEKW. NR ID: 16 dla CDR-H2, albo SEKW. NR ID: 3 dla CDR-H3, oraz łańcuch lekki, w którym domena zmienna obejmuje CDR o co najmniej jednej spośród sekwencji przedstawionych w SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2, lub SEKW. NR ID: 6 dla CDR-L3.

Bardziej szczegółowo, przeciwciało przeciwko CD22 obejmuje SEKW. NR ID: 1 dla CDR-H1, SEKW. NR ID: 2 lub SEKW. NR ID: 13 lub SEKW. NR ID: 15 lub SEKW. NR ID: 16 dla CDR-H2, SE- KW. NR ID: 3 dla CDR-H3, SEKW. NR ID: 4 dla CDR-L1, SEKW. NR ID: 5 dla CDR-L2 i SEKW. NR ID: 6 dla CDR-L3.

Humanizowanym przeciwciałem przeciwko CD22 może być humanizowane przeciwciało przeciwko CD22 z przeszczepionym CDR, które obejmuje region zmienny łańcucha lekkiego 5/44-gL1 (SEKW. NR ID: 19) oraz region zmienny łańcucha ciężkiego 5/44-gH7 (SEKW. NR ID: 27).

W szczególności, humanizowanym przeciwciałem przeciwko CD22 jest przeciwciało z przeszczepionym CDR o swoistości wobec ludzkiego CD22, które obejmuje łańcuch lekki o sekwencji przedstawionej w SEKW. NR ID: 28 oraz łańcuch ciężki o sekwencji przedstawionej SEKW. NR ID: 30.

Przeciwciało z przeszczepionym CDR, może stanowić wariant przeciwciała o zwiększonym powinowactwie wobec ludzkiego CD22, otrzymanego metodą dojrzewania powinowactwa.

Zgodnie z wynalazkiem cytotoksycznym lekiem jest kalicheamycyna, a w szczególności N-acetylo-kalicheamycyna.

Kompozycja tu ujawniona może ewentualnie zawierać dodatkowy środek bioaktywny. Takim środkiem bioaktywnym może być cytotoksyczny lek, czynnik wzrostu lub hormon.

W niniejszym zgłoszeniu opisano sposoby leczenia pacjenta z zaburzeniem proliferacyjnym przez podawanie pacjentowi terapeutycznie skutecznej dawki kompozycji farmaceutczynej według wynalazku. Kompozycję tę można podawać podskórnie, dootrzewnowo, dożylnie, dotętniczo, doszpikowo, dokanałowo, przezskórnie, donosowo, miejscowo, dojelitowo, dopochwowo, podjęzykowo lub doodbytniczo. W szczególności, kompozycję farmaceutyczną według wynalazku podaje się dożylnie.

Kompozycję podaje się człowiekowi cierpiącemu na zaburzenie proliferacyjne, takie jak rak.

Rakiem jest rak pochodzenia nabłonkowego złośliwy zależny od limfocytów B. Rakiem złośliwym za- leżnym od limfocytów B może być białaczka lub chłoniak, który wyraża antygen powierzchni komórki CD22.

Rakiem może też być rak wywodzący się z nabłonka lub mięsak.

W innym aspekcie opisano sposób leczenia raka złośliwego zależnego od limfocytów B przez podawanie pacjentowi z takim rakiem terapeutycznie skutecznej ilości kompozycji zawierającej koniugat cytotoksyczny lek-przeciwciało przeciwko CD22. Rakiem złośliwym zależnym od limfocytów B może być chłoniak, a zwłaszcza chłoniak nieziarniczy.

Oprócz kalicheamycyny stosowanej w rozwiązaniach według wynalazku, cytotoksyczny lek, któ- ry może być stosowany do wytwarzania koniugatów jest wybrany z grupy obejmującej tiotepę, taksany, winkrystynę, daunorubicynę, doksorubicynę, epirubicynę, aktynomycynę, autramycynę, azaseryny, bleomycyny, tamoksyfen, idarubicynę, dolastatyny/aurystatyny, hemiasterliny, maytanzynoidy i esperamycyny.

Korzystnie, cytotoksycznym lekiem jest N-acetylo-kalicheamycyna.

Opisane niniejszym leczenie obejmuje podawanie koniugatu cytotoksycznego leku według wynalazku razem z jednym lub więcej środkami bioaktywnymi wybranymi spośród przeciwciał, czyn- ników wzrostu, hormonów, cytokin, antyhormonów, ksantyn, interleukin, interferonów i leków cytotoksycznych.

Środkiem bioaktywnym może być przeciwciało, które jest skierowane przeciwko antygenowi powierzchni komórki wyrażanemu w nowotworach złośliwych zależnych od limfocytów B. Przeciwciało skierowane przeciwko antygenom powierzchni komórki wyrażanym w nowotworach złośliwych zależ- nych od limfocytów B jest korzystnie wybrane z grupy obejmującej przeciwciało przeciwko CD129, przeciwciało przeciwko CD20 i przeciwciało przeciwko CD33. Przeciwciała takie obejmują przeciwciała przeciwko CD20, rituximab (RITUXAN).

Środkami bioaktywnymi mogą być cytokiny lub czynniki wzrostu, które obejmują, ale nie wy- łącznie interleukinę 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF i G-CSF.

(9)

Środkami bioaktywnymi mogą być także hormony, które obejmują estrogeny, androgeny, progestyny i kortykosteroidy.

Alternatywnie środek bioaktywny stanowi cytotoksyczny lek wybrany spośród doksorubicyny, daunorubicyny, idarubicyny, aklarubicyny, zorubicyny, mitoksantronu, epirubicyny, karubicyny, noga- lamycyny, menogarilu, pitarubicyny, walrubicyny, cytarabiny, gemcytabiny, triflurydyny, ancytabiny, enocytabiny, azacytydyny, doksyflurydyny, pentostatyny, broksurydyny, kapecytabiny, kladrybiny, decytabiny, floksurydyny, fludarabiny, gougerotyny, puromycyny, tegafuru, tiazofuryny, adriamycyny (ADRIAMYCIN), cisplatyny, karboplatyny, cyklofosfamidu, dakarbazyny, winblastyny, winkrystyny, mitoksantronu, bleomycyny, mekloretaminy, prednizonu, prokarbazyny, metotreksatu, fluorouracyli, etopozydu, taksolu, analogów taksolu i mitomycyny.

Terapeutycznie skuteczną kompozycję koniugatu cytotoksyczny lek-przeciwciało przeciwko CD22 podaje się, korzystnie, razem z jedną lub więcej niż jedną kombinacją cytotoksycznych leków jako część schematu leczenia, przy czym kombinacja środków cytotoksycznych jest wybrana spośród następujących kombinacji: CHOPP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); CHOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna i prednizon); COP (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon); CAP-BOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, prokarbazyna, bleomycyna, winkrystyna i prednizon); m-BACOD (metotreksat, bleomycyna, doksorubicyna, cyklofosfamid, winkrystyna, deksametazon i leukoworyna); ProMACE-MOPP (prednizon, metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, etopozyd, leukowaryna, mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); ProMACE-CytaBOM (prednizon, metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, etopozyd, leukoworyna, cytarabina, bleomycyna i winkrystyna); MACOP-B (metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, winkrystyna, prednizon, bleomycyna i leukoworyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); ABVD (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna, winblastyna i dakarbazyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna) naprzemiennie z ABV (adriamycyna (ADRIAMY- CIN)/doksorubicyna, bleomycyna i winblastyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna) naprzemiennie z ABVD (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna, winblastyna i dakarbazyna), ChlVPP (chlorambucyl, winblastyna, prokarbazyna i prednizon); IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat i etopozyd); MIME (metylo-gag, ifosfamid, metotreksat i etopozyd); DHAP (deksametazon, duża dawka cytarabiny i cisplatyna); ESHAP (etopozyd, metyloprednizolon, duża dawka cytarabiny i cisplatyna); CEPP(B) (cyklofosfamid, etopozyd, prokarbazyna, prednizon i bleomycyna); CAMP (lomustyna, mitoksantron, cytarabina i prednizon); i CVP-1 (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon).

Terapeutycznie skuteczną kompozycję koniugatu cytotoksyczny lek-przeciwciało przeciwko CD22 podaje się, korzystnie, przed podaniem jednej lub więcej spośród powyższych kombinacji leków cytotoksycznych. Terapeutycznie skuteczną kompozycję koniugatu cytotoksyczny lek-przeciwciało przeciwko CD22 można podawać równie korzystnie po podaniu jednej lub więcej spośród powyższych kombinacji leków cytotoksycznych jako część schematu leczenia.

Rozwiązania według wynalazku umożliwiają leczenie agresywnych chłoniaków, przy czym leczenie takie obejmuje podawanie wymagającemu takiego leczenia pacjentowi terapeutycznie skutecznej kompozycji monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny – przeciwciało przeciwko CD22 razem z jednym lub więcej środkami bioaktywnymi.

Ponadto niniejszym opisano zastosowanie kompozycji według wynalazku do leczenia pacjenta z zaburzeniem proliferacyjnym, takim jak nowotwór. Nowotworem takim jest zwłaszcza rak złośliwy zależny od limfocytów B, który wyraża na powierzchni komórki antygen CD22. Rakiem złośliwym za- leżnym od limfocytów B jest, zwłaszcza białaczka lub chłoniak. W jednym z wykonań, nowotworem jest rak lub białaczka.

Terapeutycznie skuteczną dawkę kompozycji farmaceutycznej według wynalazku można poda- wać podskórnie, dootrzewnowo, dożylnie, dotętniczo, doszpikowo, dokanałowo, przezskórnie, donosowo, miejscowo, dojelitowo, dopochwowo, podjęzykowo lub doodbytniczo.

Dożylne podawanie terapeutycznie skutecznej dawki kompozycji według wynalazku jest szcze- gólnie korzystne.

Niniejszym przedstawiono zastosowanie monomerycznego koniugatu pochodna kalicheam y- cyny/przeciwciało przeciwko CD22 według wynalazku do leczenia pacjenta z rakiem złośliwym za- leżnym od limfocytów B, takim jak chłoniak nieziarniczy. Monomeryczny koniugat pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciwko CD22 można korzystnie podawać z jednym lub więcej środka- mi bioaktywnymi.

(10)

Wyżej wskazane środki bioaktywne są wybrane z grupy obejmującej przeciwciała, czynniki wzrostu, hormony, cytokiny, antyhormony, ksantyny, interleukiny, interferony i cytotoksyczne leki.

Środek bioaktywny może być przeciwciałem skierowanym przeciwko antygenowi powierzchni komórki wyrażanemu przez nowotwory złośliwe zależne od limfocytów B, takim jak przeciwciało przeciwko CD19, przeciwciało przeciwko CD20 i przeciwciało przeciwko CD33. Korzystnie przeciwciałem przeciwko CD20 jest rituximab (RITUXAN).

Środki bioaktywne obejmują też cytokiny lub czynniki wzrostu, takie jak interleukina 2 (IL-2), TNF, CSF, GM-CSF i G-CSF albo hormony, które obejmują estrogeny, androgeny, progestyny i kortykosteroidy.

Środkiem bioaktywnym może być ponadto cytotoksyczny lek wybrany spośród doksorubicyny, daunorubicyny, idarubicyny, aklarubicyny, zorubicyny, mitoksantronu, epirubicyny, karubicyny, nogala- mycyny, menogarilu, pitarubicyny, valrubicyny, cytarabiny, gemcytabiny, triflurydyny, ancytabiny, enoci- tabiny, azacytydyny, doksyflurydyny, pentostatyny, broksurydyny, kapecytabiny, kladrybiny, decytabiny, floksurydyny, fludarabiny, gougerotyny, puromycyny, tegafuru, tiazofuryny, adriamycyny (ADRIAMYCIN), cisplatyny, karboplatyny, cyklofosfamidu, dakarbazyny, winblastyny, winkrystyny, mitoksantronu, bleomycyny, mekloretaminy, prednizonu, prokarbazyny, metotreksatu, flurouracili, etopozydu, taksolu, ana- logów taksolu i mitomycyny.

Terapeutycznie skuteczną dawkę monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny/- przeciwciało przeciwko CD22 można podawać razem z jedną lub więcej niż jedną kombinacją cytotoksycznych środków jako część schematu leczenia, przy czym kombinacja cytotoksycznych środków jest wybrana spośród następujących: CHOPP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); CHOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna i prednizon); COP (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon); CAP-BOP (cyklofosfamid, doksorubicyna, prokarbazyna, bleomycyna, winkrystyna i prednizon); m-BACOD (metotreksat, bleomycyna, doksorubicyna, cyklofosfamid, winkrystyna, deksametazon i leukoworyna); ProMACE-MOPP (prednizon, metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, etopozyd, leukoworyna, mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna); ProMACE- -CytaBOM (prednizon, metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, etopozyd, leukoworyna, cytarabina, bleomycyna i winkrystyna); MACOP-B (metotreksat, doksorubicyna, cyklofosfamid, winkrystyna, prednizon, bleomycyna i leukoworyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna);

ABVD (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna, winblastyna i dakarbazyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna) naprzemiennie z ABV (adriamycyna (ADRIA- MYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna i winblastyna); MOPP (mekloetamina, winkrystyna, prednizon i prokarbazyna) naprzemiennie z ABVD (adriamycyna (ADRIAMYCIN)/doksorubicyna, bleomycyna, winblastyna i dakarbazyna); ChlVPP (chlorambucyl, winblastyna, prokarbazyna i prednizon); IMVP-16 (ifosfamid, metotreksat i etopozyd); MIME (metylo-gag, ifosfamid, metotreksat i etopozyd); DHAP (deksametazon, duża dawka cytarabiny i cisplatyna); ESHAP (etopozyd, metylopredizolon, duża dawka cytarabiny i cisplatyna); CEPP(B) (cyklofosfamid, etopozyd, prokarbazyna, prednizon i bleomycyna); CAMP (lomustyna, mitoksantron, cytarabina i prednizon); CVP-1 (cyklofosfamid, winkrystyna i prednizon), ESHOP (etopozyd, metylopredizolon, duża dawka cytarabiny, winkrystyna i cisplatyna);

EPOCH (etopozyd, winkrystyna i doksorubicyna przez 96 godzin z dawkami typu bolus cyklofosfamidu i z doustnym podawaniem prednizonu), iCE (ifosfamid, cyklofosfamid i etopozyd), CEPP(B) (cyklofosfamid, etopozyd, prokarbazyna, prednizon i bleomycyna), CHOP-B, (cyklofosfamid, doksorubicyna, winkrystyna, prednizon i bleomycyna), CEPP-B (cyklofosfamid, etopozyd, prokarbazyna i bleomycyna) i P/DOCE (epirubicyna lub doksorubicyna, winkrystyna, cyklofosfamid i prednizon).

Monomeryczny koniugat pochodna kalicheamycyny/ przeciwciało przeciwko CD22 można rów- nież przed podaniem jednej lub więcej kombinacji cytotoksycznych środków jako część schematu leczenia.

Terapeutycznie skuteczną dawkę monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny/prze- ciwciało przeciwko CD22 podaje się korzystnie po podaniu jednej lub więcej kombinacji cytotoksycznych środków, jako część schematu leczenia.

Terapeutycznie skuteczną dawkę monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny/prze- ciwciało przeciwko CD22 podaje się jako część schematu leczenia razem z przeciwciałem skierowanym przeciwko antygenowi powierzchni komórki wyrażanemu przez nowotwory złośliwe zależne od limfocytów B, i ewentualnie dawka taka obejmuje również jedną lub więcej kombinacji środków cytotoksycznych.

(11)

Niniejszym opisano także zastosowanie monomerycznego koniugatu pochodna kalicheamycyny/przeciwciało przeciwko CD22 według wynalazku do wytwarzania leku do leczenia zaburzenia proli- feracyjnego. Lek taki można stosować do leczenia zaburzeń proliferacyjnych zależnych od limfoc y- tów B, sam lub w kombinacji z innymi środkami bioaktywnymi.

KRÓTKI OPIS RYSUNKÓW

Na Fig. 1 przedstawiono sekwencję aminokwasów CDR mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44 (SEKW NR ID:1 do 6).

Na Fig. 2 przedstawiono sekwencję DNA (SEKW NR ID:52 i 53) i białka (SEKW NR ID:7) domeny zmiennej łańcucha lekkiego (VL) mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44.

Na Fig. 3 przedstawiono sekwencję DNA (SEKW NR ID:54 i 55) i białka (SEKW NR ID: 8) domeny zmiennej łańcucha ciężkiego (VH) mysiego przeciwciała monoklonalnego 5/44.

Na Fig. 4 przedstawiono strategię usuwania miejsca glikozylacji i reaktywnej lizyny w CDR-H2 (SEKW NR ID:9–12 i 14).

Na Fig. 5 przedstawiono projekt przeszczepu dla sekwencji łańcucha lekkiego 5/44 (SEKW NR ID: 7). DPK-9 oznacza sekwencję szkieletu akceptora ludzkiej linii zarodkowej (SEKW NR ID: 17).

Linie pionowe wskazują różnice pomiędzy resztami mysimi i ludzkimi. Sekwencje podkreślone wska- zują reszty donora, które zostały zachowane w przeszczepie. CDR wskazano tłustą pochyłą czcionką (nie przedstawione dla DPK-9). Przeszczep gL1 (SEKW NR ID: 19) obejmuje 6 reszt, a przeszczep gL2 (SEKW NR ID: 20) obejmuje 7 reszt szkieletu donora.

Na Fig. 6 przedstawiono projekt przeszczepu dla sekwencji łańcucha ciężkiego 5/44 (SEKW NR ID: 8); DP7 (SEKW NR ID: 21) oznacza sekwencję szkieletu akceptora ludzkiej linii zarodkowej. Linie pionowe wskazują różnice pomiędzy resztami mysimi i ludzkimi. Sekwencje podkreślone wskazują reszty donora, które zostały zachowane w przeszczepie. CDR wskazano tłustą pochyłą czcionką (nie przedstawiono dla DP7).

Przeszczepy gH4 (SEKW NR ID: 24) i gH6 (SEKW NR ID: 26) obejmują 6 reszt szkieletu donora. Przeszczepy gH5 (SEKW NR ID: 25) i gH7 (SEKW NR ID: 27) obejmują 4 reszty szkieletu donora.

Na Fig. 7 przedstawiono mapę pMRR14 wektora.

Na Fig. 8 przedstawiono mapę pMRR10.1 wektora.

Na Fig. 9 przedstawiono wyniki testu BIAcore® dla chimerycznych mutantów 5/44.

Na Fig. 10 przedstawiono oligonukleotydy dla połączenia gH1 5/44 i genu gL1 (SEKW NR ID: 32–47).

Na Fig. 11 przedstawiono mapę plazmidu dla przejściowego wektora pCR2.1 (544gH1).

Na Fig. 12 przedstawiono mapę plazmidu dla przejściowego wektora pCR2.2 (544gL1).

Na Fig. 13 przedstawiono kasety oligonukleotydów stosowanych do dalszych przeszczepów (SEKW NR ID: 56–65).

Na Fig. 14 przedstawiono wykres badania kompetycyjnego fluorescencyjnie znakowanego mysiego przeciwciała 5/44 i przeszczepionych wariantów.

Na Fig. 15 przedstawiono wykres badania kompetycyjnego fluorescencyjnie znakowanego mysiego przeciwciała 5/44 i przeszczepionych wariantów.

Na Fig. 16 przedstawiono pełną sekwencję DNA (SEKW NR ID: 29, 31, 66 i 67) i białka (SEKW NR ID: 28 i 30) dla przeszczepionych łańcuchów ciężkiego i lekkiego.

Na Fig. 17 przedstawiono schemat koniugatu DMH przeciwciało-NAc-gamma-kalicheamycyna.

Na Fig. 18 przedstawiono wykres wpływu CMC-544 na wzrost chłoniaka zależnego od limfocy- tów B RAMOS.

Na Fig. 19 przedstawiono wykres wpływu CMC-544 na duże chłoniaki zależne od limfocytów B w modelu ksenoprzeszczepu u myszy nagich in vivo.

Na Fig. 20 przedstawiono wykres, na którym porównano wpływ CMC-544 wytworzonego w procesie sprzęgania z CMA-676 i z CMC-544 na wzrost chłoniaka RL.

Na Fig. 21 przedstawiono wykres, na którym wykazano, że duży chłoniak RL traktowany rituxi- mabem (RITUXAN) jest podatny na leczenie CMC-544.

Na Fig. 22 przedstawiono wykres ilustrujący wpływ rituximabu (RITUXAN) na cytotoksyczne działanie CMC-544.

Na Fig. 23 przedstawiono wykres ilustrujący działanie CMC-544, rituximabu (RITUXAN) i CMA- -676 na przeżycie myszy SCID z rozsianym wczesnym chłoniakiem RAMOS B.

Na Fig. 24 przedstawiono wykres ilustrujący działanie CMC-544, rituximabu (RITUXAN) i CMA- -676 na przeżycie myszy SCID z rozsianym późnym chłoniakiem RAMOS B.

(12)

Na Fig. 28 przedstawiono wykres ilustrujący aktywność przeciwnowotworową CMC-544 z ritu- ximabem (RITUXAN) i bez rituximabu wobec nieziarniczego chłoniaka RL.

Na Fig. 29 przedstawiono wykres ilustrujący aktywność przeciwnowotworową CMC-544 i CHOP wobec nieziarniczego chłodniaka RL.

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Koniugaty tu opisane zawierają cytotoksyczny lek derywatyzowany łącznikiem, który obejmuje dowolną grupę reaktywną, która reaguje z białkopodobnym nośnikiem i tworzy koniugat pochodna cytotoksycznego leku-białkopodobny nośnik. Konkretnie, opisane tu koniugaty, w tym koniugaty w kompozycji według wynalazku, zawierają cytotoksyczny lek derywatyzowany łącznikiem, który obejmuje dowolną reaktywną grupę, która reaguje z przeciwciałem stosowanym jako białkopodobny nośnik, z wytworzeniem koniugatu pochodna cytotoksycznego leku – przeciwciało.

Konkretnie, przeciwciała reagują z antygenem powierzchni komórki nowotworów złośliwych za- leżnych od limfocytów B. Poniżej opisano ulepszony sposób wytwarzania i oczyszczania takich koniu- gatów. W wyniku stosowania konkretnych współrozpuszczalników, dodatków i określonych warunków reakcji oraz określonego sposobu rozdzielania, uzyskuje się monomeryczny koniugat pochodna cytotoksycznego leku/przeciwciało o znacznie zmniejszonej LCF. W przeciwieństwie do formy zagregowa- nej, forma monomeryczna ma istotną wartość terapeutyczną, a zmniejszenie LCF i zasadnicze zmniejszenie agregacji prowadzi do wykorzystania wyjściowego przeciwciała w terapeutycznie efektywny sposób przez zapobieżenie współzawodnictwu LCF z wyżej skoniugowaną frakcją (HCF).

I. NOŚNIKI

Nośniki/środki kierujące korzystnie stanowią białkopodobne nośniki/środki kierujące. Jako no- śnik/środki kierujące wymienić można hormony, czynniki wzrostu, przeciwciała, fragmenty przeciwciał, mimetyki przeciwciał oraz ich odpowiedniki wytworzone na drodze inżynierii genetycznej lub enzymatycznie i nośniki takie określa się dalej pojedynczo lub w odniesieniu do grupy jako „nośniki". Zasadniczą własnością nośnika jest jego zdolność do rozpoznawania i wiązania się z przeciwciałem lub receptorem związanym z niepożądanymi komórkami, które następnie są internalizowane. Przykłady nośników, które można stosować w opisanych tu koniugatach, ujawniono w patencie USA nr 5,053,394, którego treść wprowadza się tu w całości przez odniesienie. Korzystnymi nośnikami są przeciwciała i mimetyki prze- ciwciał.

Do wytwarzania mimetyków przeciwciał, które wiążą się z epitopami antygenowymi ze swoisto- ścią przeciwciała, stosowano wiele nie-immunoglobulinowych szkieletów białkowych (publikacja zgło- szenia PCT nr WO 00/34784). Przykładowo, zaprojektowano szkielet typu „minibody", który jest po- krewny fałdzie immunoglobuliny, przez wykreślenie trzech nici z domeny zmiennej łańcucha ciężkiego przeciwciała monoklonalnego (Tramontano i in., J. Mol. Recognit. 7:9, 1994). Białko to obejmuje 61 reszt i można je stosować do prezentowania dwóch hiperzmiennych pętli. Te dwie pętle randomizo- wano i wybrano produkty do wiązania antygenu, ale jak do tej pory przydatność szkieletu okazała się nieco ograniczona, z uwagi na problemy z rozpuszczalnością. Innym szkieletem, który stosuje się do prezentacji pętli jest tendamistat, białko, które swoiście hamuje ssacze alfa-amylazy i stanowi 74 resz- tę, sześcioniciowego, beta-warstwowego białka typu „sandwich", którego warstwy utrzymywane są razem przez dwa wiązania disulfidowe. (McConnell i Hoess, J. Mol. Biol. 250:460, 1995). Szkielet ten obejmuje trzy pętle, ale do tej pory pod względem potencjału randomizacyjnego zbadano tylko dwie z tych pętli.

Jako szkielety badano inne białka i stosowano je do wykazania randomizowanych reszt na po- wierzchniach alfa-helikalnych (Nord i in., Nat. Biotechnol. 15:772, 1997; Nord i in., Protein Eng. 8:601, 1995), pętli pomiędzy alfa-helisami w wiązkach alfa-helis (Ku i Schultz, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:6552, 1995) oraz pętli usztywnionych przez mostki disulfidowe, takich jak obecne w małych inhibi- torach proteazy (Markland i in., Biochemistry 35:8045, 1996; Markland i in., Biochemistry 35:8058, 1996; Rottgen i Collins, Gene 164; 243, 1995; Wang i in., J. Biol. Chem. 270:12250, 1995).

Przykłady nośników przeciwciał, które można stosować w rozwiązaniach tu opisanych, obejmu- ją przeciwciała monoklonalne, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała humanizowane, ludzkie prze-

(13)

ciwciała i ich biologicznie aktywne fragmenty. Korzystnie, przeciwciała takie są skierowane przeciwko antygenom powierzchni komórki wyrażanym na komórkach i/lub tkankach docelowych w zaburzeniach proliferacyjnych, takich jak rak. Przykłady konkretnych przeciwciał skierowanych przeciwko antyg e- nom powierzchni komórki na komórkach docelowych obejmują, ale nie wyłącznie, przeciwciała przeciwko antygenowi CD22, który jest nadmiernie wyrażany w większości chłoniaków zależnych od limfocytów B; G5/44, humanizowaną formę mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD22;

przeciwciała przeciwko antygenowi CD33 powierzchni komórki, który jest przeważający w niektórych ludzkich nowotworach szpikowych, zwłaszcza w ostrej białaczce szpikowej; pP67.6, humanizowaną formę mysiego przeciwciała przeciwko CD33 (patrz, patent USA nr 5,773,001); przeciwciało przeciwko antygenowi PEM stwierdzonemu w wielu nowotworach pochodzenia nabłonkowego, oznaczone jako mP67.6 (patrz I.D. Bernstein i in., J. Clin. Invest. 79:1153 (1987) i I.D. Bernstein i in., J. Immunol. 128:

867–881 (1992)); oraz humanizowane przeciwciało przeciwko antygenowi węglowodan-Lewis Y, wy- rażanemu nadmiernie w wielu guzach litych, oznaczone jako hu3S193 (patrz, patent USA nr 6,310,185 B1). Ponadto, na rynku dostępnych jest kilka przeciwciał, takich jak rituximab (RITUXAN) i trastuzumab (HERCEPTIN®), które również można stosować jako nośniki/środki kierujące. Rituxi- mab (RITUXAN) jest chimerycznym przeciwciałem przeciwko CD20, stosowanym do leczenia różnych chłoniaków zależnych od limfocytów B, a trastuzumab (HERCEPTIN®) jest humanizowanym przeciw- ciałem przeciwko Her2 stosowanym do leczenia raka sutka.

Jako nośnik można stosować cząsteczkę humanizowanego przeciwciała z przeszczepionym CDR skierowanego przeciwko antygenowi powierzchni komórki CD22, oznaczonemu G5/44. Przeciw- ciało to jest humanizowaną formą mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko CD22, które jest skierowane przeciwko antygenowi powierzchni komórki CD22, przeważającemu w pewnych chłonia- kach ludzkich. Stosowane tu określenie „cząsteczka przeciwciała z przeszczepionym CDR" odnosi się do cząsteczki przeciwciała, w której łańcuch ciężki i/lub lekki obejmuje jeden lub więcej regionów de- terminujących dopasowanie (CDR), obejmujących zmodyfikowany CDR (dalej CDR) od przeciwciała donora (np. mysiego przeciwciała monoklonalnego) przeszczepiony do szkieletu regionu zmiennego łańcucha ciężkiego i/lub lekkiego przeciwciała akceptora (np. przeciwciała ludzkiego). Korzystnie, takie przeciwciało z przeszczepionym CDR zawiera domenę zmienną obejmującą regiony zrębowe ludzkiego akceptora, jak również jeden lub więcej spośród CDR donora, jak określone powyżej.

Do przeszczepiania CDR można stosować każdą odpowiednią sekwencję regionu zrębowego części zmiennej akceptora, biorąc pod uwagę klasę/typ przeciwciała donora, od którego pochodzą CDR, w tym regiony zrębowe mysie, naczelnych i ludzkie. Przykładami ludzkich regionów zrębowych, które można stosować są KOL, NEWM, REI, EU, TUR, TEI, LAY i POM (Kabat i in., Sequences of Proteins of Immunological Interest, wydanie 5, 1991, U.S. Department of Health i Human Services, Public Health Service, National Institutes of Health). Przykładowo, KOL i NEWM można stosować dla łańcucha ciężkiego, REI można stosować dla łańcucha lekkiego, a EU, LAY i POM można stosować dla obydwu łańcuchów, ciężkiego i lekkiego.

W przeciwciałach z przeszczepionymi CDR korzystnie jako przeciwciało akceptora stosuje się przeciwciało obejmujące łańcuchy, które są homologiczne z łańcuchami przeciwciała donora. Łańcu- chy ciężkie i lekkie akceptora nie muszą koniecznie pochodzić od tego samego przeciwciała i w razie potrzeby mogą obejmować łańcuchy złożone zawierające regiony zrębowe pochodzące od różnych łańcuchów.

W przeciwciałach z przeszczepionymi CDR regiony zrębowe również nie muszą obejmować dokładnie tej samej sekwencji, jak regiony przeciwciała akceptora. Przykładowo, reszty nietypowe można zmienić na reszty występujące częściej w danej klasie lub typie łańcucha akceptora. Alterna- tywnie, wybrane reszty w regionach zrębowych akceptora można zmienić tak, aby odpowiadały resz- tom obecnym w tej samej pozycji przeciwciała donora lub na resztę, która stanowi konserwatywne podstawienie dla reszty znajdującej się w tej samej pozycji przeciwciała donora. Zmiany takie powinny być utrzymane w zakresie minimum koniecznego do zachowania powinowactwa przeciwciała donora.

Protokół doboru reszt w regionach zrębowych akceptora, które mogą wymagać zmiany, podano w publikacji PCT Nr WO 91/09967, której treść wprowadzono tu w całości.

Reszty donora stanowią reszty z przeciwciała donora, tj. przeciwciała, od którego pierwotnie pochodzą CDR.

Przeciwciało może obejmować łańcuch ciężki, w którym domena zmienna jako CDR-H2 (jak określono w publikacji Kabat i in., (supra)) obejmuje H2', w którym sekwencję z potencjalnym miejscem glikozylacji usunięto w celu zwiększenia powinowactwa przeciwciała wobec antygenu.

(14)

Alternatywnie lub ponadto, przeciwciało może obejmować łańcuch ciężki, w którym domena zmienna jako CDR-H2 (jak określono w publikacji Kabat i in., (supra)) obejmuje H2'', w którym reszta lizyny znajduje się w pozycji 60. Tę resztę lizyny, która usytuowana jest w eksponowanej pozycji w obrębie CDR-H2, i zgodnie z przypuszczeniami może potencjalnie reagować z czynnikami sprzęga- jącymi, powodując zredukowanie powinowactwa wiązania z antygenem, zastąpiono alternatywnym aminokwasem.

Ponadto, przeciwciało może obejmować łańcuch ciężki, w którym domena zmienna jako CDR- -H2 (jak określono w publikacji Kabat i in., (supra)) obejmuje H2''', w którym zarówno sekwencję z miejscem potencjalnej glikozylacji, jak i resztę lizyny w pozycji 60, zastąpiono alternatywnymi amino- kwasami.

Przeciwciało tu opisane może być wybrane z grupy obejmującej: przeciwciało kompletne obej- mujące łańcuchy ciężkie i lekkie o pełnej długości; jego biologicznie aktywny fragment, taki jak fragment Fab, zmodyfikowany Fab, Fab', F(ab')2 lub Fv; monomer lub dimer o łańcuchu lekkim lub cięż- kim; przeciwciało jednołańcuchowe, np. jednołańcuchowe Fv, w którym domeny zmienne ciężkiego i lekkiego łańcucha są połączone łącznikiem peptydowym. Podobnie, regiony zmienne łańcucha cięż- kiego i lekkiego można odpowiednio łączyć z domenami innych przeciwciał.

Przeciwciało może również obejmować zmodyfikowany fragment Fab, w którym modyfikacja polega na addycji jednego lub więcej aminokwasów, w celu umożliwienia przyłączenia cząsteczki efektora lub reportera do C-końca łańcucha ciężkiego. Korzystnie, dodatkowe aminokwasy tworzą zmodyfikowany region zawiasowy zawierający jedną lub dwie reszty cysteinowe, do których może być przyłą- czona cząsteczka efektora lub reportera.

Domeny regionu stałego przeciwciała, jeśli są obecne, można je wybrać w zależności od pro- ponowanej funkcji przeciwciała, a zwłaszcza od funkcji efektorowych, które może być, lub mogą nie być, wymagane. Przykładowo, domenami regionu stałego mogą być domeny ludzkiej IgA, IgD, IgE, IgG lub IgM. Gdy przeciwciało przeznaczone jest do zastosowań terapeutycznych i funkcje efektorowe przeciwciała są wymagane, szczególnie można stosować domenę regionu stałego ludzkiej IgG, a zwłaszcza izotypów IgG1 i IgG3. Alternatywnie, gdy przeciwciało jest przeznaczone do celów terapeutycznych, a funkcje efektorowe przeciwciała nie są ani wymagane ani pożądane, można stosować izotypy IgG2 i IgG4 lub można zmutować region Fc IgG1 w celu zniesienia funkcji efektorowych.

Przeciwciało tu opisane ma powinowactwo wiązania co najmniej 5x10^-8 M, korzystnie co najmniej 1x10^-9M, bardziej korzystnie co najmniej 0,75x10^-10 M, a najkorzystniej co najmniej 0,5x10^-10 M.

Niniejszym opisano koniugaty immunotoksyn oraz sposoby wytwarzania tych koniugatów z zastosowaniem wariantów przeciwciał lub mimetyków przeciwciał. Warianty przeciwciał są korzystnie skierowane przeciwko CD22 i wykazują poprawione powinowactwo wobec CD22. Warianty takie można otrzymać zgodnie z wieloma protokołami powinowactwa dojrzewania obejmującymi mutowanie CDR (Yang i in., J. Mol. Biol., 254, 392–403, 1995), mieszanie łańcucha (Marks i in., Bio/Technology, 10, 779–783, 1992), stosowanie czynników mutujących szczepy E. coli (Low i in., J. Mol. Biol., 260, 359–368, 1996), mieszanie DNA (Patten i in., Curr. Opin. Biotechnol., 8, 724–733, 1997), stosowanie prezentacji na fagu (Thompson i in., J. Mol. Biol., 256, 77–88, 1996) oraz metodą seksualnego PCR (ang. sexual PCR) (Crameri i in., Nature, 391, 288–291, 1998).

Do wyrażania sekwencji DNA kodujących nośnik obejmujący przeciwciała stosowane w roz- wiązaniach według wynalazku można stosować dowolny odpowiedni układ komórka gospodarza/- nośnik. Do wyrażania, częściowo, fragmentów przeciwciał, takich jak fragmenty Fab i F(ab')2, a zwła- szcza fragmentów Fv i fragmentów przeciwciała jednołańcuchowego, na przykład jednołańcuchowe Fv, można stosować układy bakteryjne, na przykład E. coli, oraz układy z innymi mikroorganizmami. Do wytwarzania większych przeciwciał, obejmujących cząsteczki kompletnych przeciwciał, jako układy ekspresyjne można stosować eukariotyczne komórki gospodarza, np. komórki ssacze. Odpowiednie ssacze komórki gospodarza obejmują komórki CHO, komórki szpiczaka, komórki drożdży, komórki owadzie, komórki hybrydoma, komórki NSO, VERO lub PER C6. Odpowiednie układy ekspresyjne obejmują również zwierzęta i rośliny transgeniczne.

II. ŚRODKI TERAPEUTYCZNE

Środkami terapeutycznymi odpowiednimi do stosowania w rozwiązaniach opisanych niniejszym są cytotoksyczne leki, które hamują lub przerywają polimeryzację tubuliny, środki alkilujące, które wiążą się i przerywają DNA oraz środki, które hamują syntezę białek lub niezbędnych białek komór- kowych, takich jak kinazy białkowe, enzymy i cykliny. Przykłady takich cytotoksycznych leków obejmu- ją, ale nie wyłącznie, tiotepę, taksany, winkrystynę, daunorubicynę, doksorubicynę, epirubicynę, akty-

(15)

nomycynę, autramycynę, azaseryny, bleomycyny, tamoksyfen, idarubicynę, dolastatyny/aurystatyny, hemiasterliny, kalicheamycyny, esperamycyny i maytanzynoidy. Korzystnymi cytotoksycznymi lekami są kalicheamycyny, które stanowią przykład antybiotyków przeciwnowotworowych opartych na trisulfi- dzie metylowym. Przykłady kalicheamycyn, odpowiednich do stosowania zgodnie z wynalazkiem, ujawniono, na przykład, w patentach USA nr 4,671,958; 4,970,198; 5,053,394; 5,037,651 i 5,079,233, które wprowadza się tu w całości przez odniesienie. Korzystnymi kalicheamycynami są pochodne gamma-kalicheamycyny lub N-acetylowe pochodne gamma-kalicheamycyny.

III. KONIUGATY POCHODNA CYTOTOKSYCZNEGO LEKU/NOŚNIK Koniugaty tu opisane mają wzór

Pr(-X-W)m

w którym:

Pr oznacza białkopodobny nośnik,

X oznacza łącznik, który obejmuje produkt dowolnej grupy reaktywnej, która może reagować z białkopodobnym nośnikiem,

W oznacza cytotoksyczny lek;

m oznacza średnie obciążenie dla oczyszczonego produktu sprzęgania, przy którym kalicheamycyna stanowi 4–10% wagowych koniugatu; a

(-X-W)m oznacza cytotoksyczny lek.

Korzystnie, X ma wzór:

(CO - Alk¹ - Sp¹ - Ar - Sp² - Alk² - C(Z¹) = Q - Sp), w którym:

Alk¹ i Alk² niezależnie oznaczają wiązanie lub rozgałęziony albo nierozgałęziony łańcuch (C1-C10) alkilenowy;

Sp¹ oznacza wiązanie, -S-, -O-, -CONH-, -NHCO-, -NR'-, -N(CH2CH2)2N- albo -X-Ar'-Y-(CH2)n-Z, gdzie X, Y i Z niezależnie oznaczają wiązanie, -NR'-, -S- lub -O-, pod warunkiem, że gdy n=0, wów- czas co najmniej jeden spośród Y i Z musi oznaczać wiązanie, a Ar' oznacza 1,2-, 1,3- albo 1,4-fenylen ewentualnie podstawiony jedną, dwoma lub trzema grupami, a takimi jak (C1-C5) alkil, (C1-C4) alkoksyl, (C1-C4) tioalkil, halogen, grupa nitrowa, -COOR', -CONHR’, -(CH2)nCOOR’, -S(CH2)nCOOR’,

-O(CH2)nCONHR' albo -S(CH2)nCONHR', pod warunkiem, że gdy Alk¹ oznacza wiązanie, Sp¹ oznacza wiązanie;

n oznacza liczbę całkowitą od 0 do 5;

R' rozgałęziony lub nierozgałęziony łańcuch (C1-C5),

ewentualnie podstawiony jedną lub dwoma grupami, takimi jak -OH, (C1-C4) alkoksyl, (C1-C4) tioalkoksyl, halogen, grupa nitrowa, grupa (C1-C3) dialkilaminowa lub (C1-C3) trialkilo-amonio-A^-, w któ- rej A^- oznacza farmaceutycznie dopuszczalny anion tworzący sól,

Ar oznacza 1,2-, 1,3- lub 1,4-fenylen, ewentualnie podstawiony jedną, dwoma lub trzema grupami, takimi jak (C1-C6) alkil, (C1-C5) alkoksyl, (C1-C4) tioalkoksyl, halogen, grupa nitrowa, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR',

-O(CH2)nCONHR' lub -S(CH2)nCONHR', w którym n i R' mają uprzednio podane znaczenia, albo 1,2-, 1,3-, 1,4-, 1,5-, 1,6-, 1,7-, 1,8-, 2,3-, 2,6- lub 2,7-naftyliden, albo

przy czym każdy naftyliden lub fenotiazyna ewentualnie są podstawione jedną, dwoma, trzema lub czterema grupami, takimi jak (C1-C6) alkil, (C1-C5) alkoksyl, (C1-C4) tioalkoksyl, halogen, grupa nitrowa, -COOR', -CONHR', -O(CH2)nCOOR', -S(CH2)nCOOR’, albo -S(CH2)nCONHR', w których n i R' mają wyżej podane znaczenia, pod warunkiem, że gdy Ar oznacza fenotiazynę, Sp¹ oznacza wiązanie przyłączone jedynie do atomu azotu;

Sp² oznacza wiązanie, -S- lub -O-, pod warunkiem, że gdy Alk² oznacza wiązanie, wówczas Sp² oznacza wiązanie;