Zapoznanie z podstawowymi reakcjami i właściwościami białek i aminokwasów. ZAKRES OBOWIĄZUJĄCEGO MATERIAŁU
Wzory aminokwasów, enancjomery, diastereoizomery, konformery, aminokwasy egzo- i endogenne, aminokwasy jako jony obojnacze, punkt izoelektryczny, reakcje charakterystyczne dla aminokwasów, wiązanie peptydowe, białka, koloidy, struktura I, II, III i IV rzędowa protein, reakcje charakterystyczne dla białek, wysalanie i denaturacja. ODCZYNNIKI 15% HgSO4 w 3 M H2SO4 30% NaOH 0,1% ninhydryna w acetonie 50% NaOH 0,01 M CuSO4 10% NaOH 5% Pb(CH3COO)2 5% alfa-naftol w etanolu podbromin sodu (roztwór Br2
w 10% NaOH) kwas sulfanilowy w HCl 20% NaOH 1M CH3COOH (NH4)2SO4 nasycony roztwór 5% HgCl2 5% Cu(CH3COO)2 10% CCl3COOH 20% kwas sulfosalicylowy 30% kwas fosforowolframowy 0,1 M HCl 0,9 % NaCl żelatyna NaNO2 HNO3 stęż. formalina kwas glioksalowy tryptofan H2SO4 stęż. arginina histydyna kazeina 1M NaOH błękit bromotymolowy zieleń bromokrezolowa mocznik
UWAGA: Wodorotlenek sodu, kwas siarkowy, trichlorooctowy, solny, azotowy oraz formalina są silnie
żrące. Sole rtęci i ołowiu są toksyczne. Pracując z nim obowiązuje stosowanie rękawic ochronnych i
okularów.
PRZYGOTOWANIE ODCZYNNIKÓW Przygotuj:
5 cm3 roztworu chlorowodorku argininy (rozpuść niewielką ilość aminokwasu w 5 cm3 1 M HCl) 5 cm3 roztworu chlorowodorku histydyny (rozpuść niewielką ilość aminokwasu w 5 cm3 1 M HCl) 5 cm3 roztworu chlorowodorku tryptofanu (rozpuść niewielką ilość aminokwasu w 5 cm3 1 M HCl)
50 cm 3 1 % roztworu żelatyny (odważoną ilość żelatyny wsyp do 20 cm3 gorącej wody, pozostaw na 20 minut do spęcznienia, a następnie rozpuść w temperaturze wrzenia i rozcieńcz do 50 cm3)
50 cm3 ok. 3% roztworu albuminy (dopełnij białko jaja do objętości 50 cm3 a następnie dokładnie wymieszaj) 5 cm3 5% roztworu azotynu sodu
10 cm3 0,1 M roztworu HCl
OPIS ĆWICZENIA a. Reakcja Millona
Do dwóch probówek nalej po 3 ml 2% roztwór albuminy i 1 % żelatyny. Dodaj 1 ml 15% roztworu siarczanu rtęci w 3M kwasie siarkowym i ogrzewaj na wrzącej łaźni wodnej przez 10 minut. Następnie dodaj 1 ml 1% roztworu azotynu sodu. Które z białek wykazuje intensywniejsze zabarwienie roztworu.
b. Odczyn ksantoproteinowy
Do 3 ml roztworów żelatyny i albuminy umieszczonych w dwóch probówkach dodaj po 1 ml stężonego kwasu azotowego i ogrzej do wrzenia nad palnikiem. Po ochłodzeniu dodawaj kroplami 30% roztwór NaOH do zalkalizowania roztworu. Co dzieje się po dodaniu kwasu, jak zachowuje się białko po ogrzaniu z HNO3 a jak po zalkalizowaniu.
c. Reakcja ninhydrynowa
Do 3 ml roztworów białek dodaj 0,5 ml 0,1% roztworu ninhydryny w acetonie. Roztwory ogrzej do wrzenia i zanotuj wynik reakcji.
d. Odczyn biuretowy
Do 3 ml roztworów białek umieszczonych w 2 probówkach dodaj po 1 ml nasyconego roztworu NaOH i zamieszaj. Dodaj 1-5 krople 0,01 M roztworu siarczanu miedzi. Wystąpienie niebiesko-fioletowej barwy
świadczy o obecności białek. Przeprowadź analogiczną reakcję używając roztworu mocznika zamiast białka.
e. Wykrywanie aminokwasów siarkowych
Do dwóch probówek wlej po 3 ml używanych poprzednio roztworów białek. Do daj po 3 ml 10% roztworu NaOH a następnie dodaj 2-3 krople 5% roztworu octanu ołowiu. Mieszaninę ogrzewać do wrzenia. Czarne zabarwienie pochodzące od siarczku ołowiu świadczy o obecności siarki.
f. Wykrywanie tryptofanu (reakcja Adamkiewicza-Hopkinsa)
Do 1 ml 1% roztworu tryptofanu dodaj 1 ml roztworu kwasu glioksalowego lub formaliny, zamieszaj i wprowadź, po ściance, 1 ml stężonego kwasu siarkowego. Reakcję powtórz z roztworem albuminy.
h, Wykrywanie argininy (odczyn Sakaguchiego)
Do 1 ml roztworu argininy dodaj 2-3 krople 5% roztworu α-naftolu w etanolu, zamieszaj a następnie dodawaj kroplami roztwór podbrominu sodu. Czerwone zabarwienie wskazuje na obecność argininy. Reakcję powtórz z roztworem albuminy.
i. Wykrywanie histydyny (odczyn Pauly’ego)
Do 1 ml roztworu histydyny dodaj 2 ml kwasu sulfanilowego (0,9 g kwasu sulfanilowego rozpuść w 9 ml stężonego HCl i rozcieńczyć wodą destylowaną do 100 ml) oraz 1 ml 5% roztworu NaNO2 (świeżo przygotowanego), następnie zamieszaj i dodaj 1 ml 20% NaOH. Histydyna daje barwę żółto-czerwoną. Reakcję przeprowadź również dla roztworu albuminy.
j. Wytrącania izoelektryczne białek
Do probówki wlej 2 ml 2% roztworu albuminy i ogrzewaj na wrzącej łaźni wodnej przez kilka minut, a następnie dodaj 2 krople 1 M roztworu kwasu octowego. Powstaje obfity osad wytrąconego białka.
k. Wytrącanie silnym elektrolitem
Do 2 ml roztworu albuminy wlej taką samą objętość nasyconego roztworu siarczanu amonu. Zaobserwuj zmiany.
l. Wytrącanie jonami metali ciężkich
Do 3 probówek wlej po 2 ml roztworu albuminy. Do pierwszej dodawaj kroplami 5% roztwór chlorku rtęci(II), do drugiej 5% roztwór octanu ołowiu a do trzeciej 5% roztwór azotanu miedzi. Po dodaniu każdej kropli mieszaj roztwór. Po ile kropel każdego z roztworów trzeba dodać w celu uzyskania zmętnienia a ile w celu uzyskania osadu.
ł. Wytrącania anionem
W trzech probówkach umieść po 2 ml roztworu albuminy a następnie dodawaj kroplami następujące odczynniki:
- 10% roztwór kwasu trichlorooctowego - 20% roztwór kwasu sulfosalicylowego - 32% roztwór kwasu fosforowolframowago
m. Wytrącanie alkoholem
Do 2 ml roztworu albuminy dodaj 10 ml 96% etanolu i probówkę odstaw na 5-10 minut. Osad odwiruj i sprawdź jego rozpuszczalność w:
- wodzie destylowanej - 0,9% roztworze NaCl - 0,1 M roztworze HCl
n. Wyznaczanie punktu izoelektrycznego kazeiny
Do kolbki miarowej o pojemności 50 cm3 wsyp 0,25 g kazeiny i dodaj 25 ml wody destylowanej (ogrzanej uprzednio do 400C) oraz 5 cm3 1 M roztworu NaOH. Zawartość naczynia mieszaj do całkowitego rozpuszczenia białka a następnie dodaj 5 cm3 1 M roztworu CH3COOH i uzupełnij wodą do kreski. Otrzymuje się w ten sposób roztwór kazeiny w 0,1 M roztworze octanu sodu.
Przygotuj 9 probówek. Do pierwszej odmierz 3,2 cm3 1 M roztworu kwasu octowego i 6,8 cm3 wody a następnie dokładnie wymieszaj. Do pozostałych ośmiu probówek wlej po 5 cm3 wody destylowanej. Następnie przenieś 5 cm3 roztworu z pierwszej probówki do drugiej, a z niej, po wymieszaniu, przelej 5 cm3 do trzeciej itd. Następnie do każdej z probówek dodaj 1 cm3 otrzymanego na wstępie roztworu kazeiny i jej zawartość zamieszaj. Zaobserwuj zmiany w wyglądzie zawartości probówek zaraz po wymieszaniu oraz po 30 minutach. pH w buforu octanowego uzyskanego w dziewięciu kolejnych probówkach wynosi odpowiednio: 3,5; 3,8; 4,1; 4,4; 4,7; 5,0; 5,3; 5,6 oraz 5,9. W której probówce wystąpił najobfitszy osad białka? Ile wynosi punkt izoelektryczny kazeiny.
o. Właściwości amfoteryczne białek
Przygotuj cztery probówki. Do 1 i 3 wlej po 5 cm3 wody destylowanej natomiast do 2 oraz 4 taką samą objętość roztworu żelatyny. Następnie do 1 i 2 probówki dodaj 2-3 krople roztworu zieleni bromokrezolowej zaś do 3 i 4 roztwór błękitu bromotymolowego. Do próbek 1 i 2 wkraplaj (licząc ilość kropli dodanych do każdej z probówek) 0,01 M HCl do zmiany zabarwienia roztworu na żółte. Z kolei do probówek 3 i 4 dodawaj kroplami 0,01 M NaOH do momentu uzyskania barwy niebieskiej. Porównaj objętość roztworu kwasu oraz roztworu zasady potrzebne do wywołania zmiany barwy wskaźnika w probówkach zawierających wodę destylowaną oraz roztwór białka.