16. Ćwiczenie 12
16.1 Reakcje enzymatyczne – wstęp teoretyczny
Pod pojęciem enzymów rozumiemy grupę naturalnych biokatalizatorów makromolekularnych. Prawie wszystkie enzymy są białkami, za wyjątkiem kilku znanych przypadków kwasów rybonukleinowych o własnościach katalitycznych. W przeciwieństwie do wielu katalizatorów niebiałkowych enzymy cechuje wielka specyficzność katalizowanych reakcji oraz duża stereo-, regio- oraz enancjoselektywność reakcji. Wykazują również często dużą swoistość w stosunku do substratu (w przypadku substratów optycznie czynnych wiele z nich jest aktywna wyłącznie w stosunku do jednego z enancjomerów).
Cząsteczki enzymów mogą mieć charakter czysto białkowy (ureaza, pepsyna, trypsyna itd.) mogą także zawierać części apeptydowe. Zgodnie z przyjętą nomenklaturą enzym jako całość nazywamy holoenzymem, jego część białkową – apoenzymem zaś reszty apeptydowe – grupami prostetycznymi lub koenzymami. Do najważniejszych koenzymów należą grupy hemowe, wolne oraz fosforylowane witaminy i ich pochodne (NADP, FAD, CoA), flawonoidy, fosforany nukleozydów, chinony. Aktywność wielu enzymów jest zależna od obecności jonów metali jak też niektórych anionów nieorganicznych.
W bezpośredni kontakt z substratem wchodzi nie całe białko lecz tylko pewne jego ugrupowanie aminokwasowe. Ugrupowania te nazywamy centrami katalitycznymi lub centrami aktywnymi enzymu. Każdy enzym ma przynajmniej jedno centrum aktywne, znamy jednak wiele posiadających po kilka miejsc wiązania substratu. W centrum aktywnym, obok skierowanych do jego wnętrza reszt aminokwasowych, znajdują się związane kowalencyjnie lub koordynacyjnie grupy prostetyczne oraz ewentualne jony potrzebne do wystąpienia prawidłowej aktywności enzymatycznej. Aminokwasy tworzące centrum aktywne (zwane czasami aminokwasami kontaktowymi) mają zazwyczaj charakter polarny i aktywne chemicznie grupy funkcyjne, przez co są zdolne do oddziaływań kowalencyjnych, koordynacyjnych, jonowych i wodorowych zarówno z substratem jak i koenzymem. Siła wiązania jest niewielka, rzędu 10-50 kJ*mol-1. Centra katalityczne umiejscowione są na ogół w zagłębieniu cząsteczki, izolowanym od środowiska zewnętrznego. Specyficzność wiązania zależy od precyzyjnie określonego ułożenia atomów w miejscu aktywnym. Substrat musi mieć odpowiedni kształt aby dopasować się do miejsca aktywnego. Obok czynnika geometrycznego istotny jest aspekt stereoelektronowy. Wiązana molekuła musi charakteryzować się, obok właściwego kształtu, właściwym rozkładem gęstości elektronowej, umożliwiającym wiązania z polarnymi grupami funkcyjnymi znajdującymi się w miejscu wiązania. Miejsca aktywne wielu enzymów nie są strukturami sztywnym, a ich kształt ulega często zmianie po skompleksowaniu cząsteczki substratu. Wynika z tego iż komplementarny względem substratu kształt miejsca katalitycznego pojawić się może w tym przypadku dopiero do związaniu substratu. Enzymy wykazujące takie właściwości cechuje często mniejsza specyficzność i większa różnorodność katalizowanych reakcji.
Wiele reakcji w organizmach żywych katalizowanych jest przez enzymy o podobnym działaniu lecz odmiennej strukturze. Mówimy wówczas o izoenzymach. Różnice takie są dostrzegalne przede wszystkim w materiale pochodzącym z tkanek różnych gatunków, jednakże często preparat enzymatyczny uzyskany z jednego organizmu jest niehomogeniczny i można go rozdzielić na białka o takiej samej aktywności biologicznej lecz odmiennej strukturze. Izoenzymy są szczególnie często spotykane w przypadku enzymów wykazujący strukturę oligomeryczną (są zbudowane z kilku podjednostek – protomerów). Często jedna tkanka wytwarza głównie jeden protomer a inna – drugi protomer. Protomery pochodzące z różnych źródeł mogą łączyć się w różnych kombinacjach, tworząc różne izoenzymy.
16.1.2 Klasyfikacja enzymów
Rosnąca ilość poznanych enzymów spowodowała konieczność wprowadzenia ich ujednoliconej nomenklatury. Nazwy systematyczne składają się z dwóch części. Cześć pierwsza nazwy, o końcówce –aza, mówi o typie katalizowanej reakcji. Druga część nazwy enzymu wskazuje na substrat (substraty) na który działa enzym. W przypadku transferaz i oksydoreduktaz w nazwach uwzględnia się donor i akceptor. Przy transferazach jako przedrostek podaje się grupę przenoszoną. W grupie ligaz podaje się (w nawiasie) produkt powstały z rozpadu nukleotydu wysokoenergetycznego, wykorzystanego w reakcji. Nazwę substratu podaje się w dopełniaczu liczby pojedynczej (np.: oligonukleotydaza dezoksyrybonukleinianu), w przypadku gdy w reakcji biorą udział dwa substraty ich nazwy podaje się w mianowniku liczby pojedynczej, rozdzielone dwukropkiem (np.: N-metylotransferaza S-adenozylometionina : guanidynooctan). Jeżeli dany enzym katalizuje dwa, następujące po sobie przekształcenia, nazwa drugiego powinna być ujęta w nawias i znajdować się jako trzeci człon nazwy (np.: oksyreduktaza L-aminokwas : NAD (dezaminująca)). Dodatkowo utworzono kod liczbowy
służący do klasyfikacji enzymów. Każdemu enzymowi przyporządkowany jest czteroliczbowy ciąg. Pierwsza liczba określa przynależność enzymu do jednej z sześciu zasadniczych grup:
1. oksydoreduktazy 2. transferazy 3. hydrolazy 4. liazy 5. izomerazy 6. ligazy (syntetazy)
Kolejna liczba określa podklasę w danej grupie enzymów. Liczba trzecia oznacza przynależność danego enzymu do podpodklasy. Czwarta, ostatnia, określa konkretny enzym. I tak w poszczególnych klasach liczby oznaczają (w nawiasach podano przykłady):
Tabela 15. Oznaczenie liczbowe enzymów
klasa druga liczba trzecia liczba
1. oksydoreduktazy - utleniana grupa w donorze (CHOH, CHNH2 itd.)
akceptor (NAD, NADP, cytochromy itd.) 2. transferazy - przenoszona grupa (jednowęglowa;
acyl, glikozyl, reszta kwasu fosforowego)
- dla fosfotransferaz: akceptor reszty kwasu fosforowego (alkohol, kwas karboksylowy, amina itd.)
- dla pozostałych transferaz: bliższa informacja o przenoszonej grupie (formyl, metyl itd.) 3. hydrolazy - hydrolizowane wiązanie (peptydowe,
estrowe itd.)
- bliższe informacje o hydrolizowanym wiązaniu (estrowe w estrach kwasów karboksylowych, w estrach fosforanowych itd.) 4. liazy - rozszczepiane wiązanie (C-C, C-O, C-N
itd.)
- odszczepiana od substratu grupa (CO2, H2S, H2O itd.)
5. izomerazy - typ izomeryzacji (oksydoredukcja wewnątrzcząsteczkowa, izomeryzacja cis-trans itd.)
- forma przekształcenia lub atakowany substrat lub grupa (zmiana konfiguracji, aminokwas, aldozy, grupa enolowa itd.)
6. ligazy - powstające wiązanie (C-O, C-C itd.) - substraty syntezy (kwas : tiol, kwas : amoniak itd.)
16.1.3 Charakterystyka poszczególnych klas enzymów
• oksydoreduktazy - katalizują reakcje utleniania-redukcji, polegające na przenoszeniu elektronów i atomów wodoru lub przyłączaniu atomów tlenu do substratu. Gdy nazwa enzymu pochodzi od donora atomów wodoru mówimy o dehydrogenazach (np.: oksydoreduktaza alkohol : NAD zwana dehydrogenazą alkoholową; katalizuje redukcję alkoholu do aldehydu z NAD jako akceptorem protonów). Jeśli nazwa enzymu pochodzi od akceptora atomów wodoru a donorem jest NADH2 mówimy o reduktazach (np.: oksydoreduktaza zredukowany NAD : L-cystyna zwana reduktazą cystynową; katalizuje redukcje cystyny do cysteiny przy udziale NADH2 jako donora protonów). Gdy jony wodorkowe przenoszone są z jednego układu nikotynoamidowego na drugi enzymy takie nazywamy transhydrogenazami (np.: oksydoreduktaza zredukowany NADP : NAD, nazywana transhydrogenazą NADP; katalizuje przemianę NADPH2 w NADP przy jednoczesnej redukcji NAD do NADH2). Jeśli akceptorem wodoru podczas utleniania substratu jest tlen enzymy katalizujące tą reakcję nazywamy oksydazami, jeśli jest nim nadtlenek wodoru – peroksydazami (np.: oksydoreduktaza L-askorbinian : tlen, inaczej oksydaza askorbinianowa, katalizuje dehydrogenacje witaminy C przy udziale tlenu i z wytworzeniem wody). Przyłączanie tlenu do substratu umożliwiają oksygenazy (np.: oksydoreduktaza tlen : tryptofan, nazywana oksygenazą tryptofanową, umożliwia utlenienie tryptofanu tlenem cząsteczkowym). Jednoczesne przyłączenie tlenu do dwóch substratów (dokładniej przyłączenie do jednego z substratów grupy hydroksylowej z jednoczesną dehydrogenacją drugiego substratu i wytworzeniem częsteczki wody) umożliwiają hydroksylazy (np.: oksydoreduktaza 3,4-dwuhydroksyfenyloetyloamina, askorbinian : tlen (hydroksylująca), inaczej hydroksylaza DOPA-aminy, utlenia DOPA-aminę do noradrenaliny za pomocą tlenu cząsteczkowego z jednoczesną dehydrogenacją cząsteczki witaminy C). Grupami prostetycznymi są najczęściej mono- lub dinukleotydy flawinowe – FAD, FMN (pochodne witaminy B2); dinukleotydy nikotynoamidoadeninowe – NAD, NADP (pochodne witaminy PP); witamina B2; hem; jony miedzi żelaza i cynku.
• transferazy – są to enzymy umożliwiające przenoszenie rodnika lub grupy z jednego związku na drugi albo wymianę rodnika lub grupy z atomem wodoru lub tlenu innego związki. Z ważniejszych enzymów z tej grupy wymienić należy: metylotransfetazy, hydroksymetylotransferazy, formylotransferazy, karboksylotransferazy, transketolazy, aransaldolazy, acylotransferazy (np.: acetylotransferazy), aminoacylotransferazy (np.: alaninylotransferazy), glikozylotransferazy (np.: galaktozylotransferazy), kinazy (fosforylotransferazy), nukleotydotransferazy i inne. Koenzymami są: witamina B1 i jej fosforan; fosforan witaminy B6; kwas liponowy; kwas pangamowy; koenzym A; kwas foliowy i inne.
• hydrolazy – katalizują rozbicie wiązań przy udziale wody. W zależności od charakteru hydrolizowanych wiązań rozróżniamy hydrolazy: działająca na wiązania estrowe (estrazy, lipazy, hydrolazy tioestrów), wiązania monoestrów fosforanowych (fosfatazy, nukleotydazy), działające na związki glikozydowe, peptydy (aminopeptydazy, karboksypeptydazy, dipeptydazy), działające na di- i trifosforany (ATPaza, pirofosfataza nieorganiczna) i inne
• liazy – są enzymami które katalizują rozbicie różnych wiązań nie na drodze hydrolitycznej, przy czym z substratu na który działa enzym uwalniane są związki małocząsteczkowe. Ze względu na rodzaj odszczepianych grup wyróżniamy między innymi: dekarboksylazy (uwalniają CO2), aldolazy (uwalniają małocząsteczkowe aldehydy), dehydratazy (uwalniają wodę), amoniakoliazy (uwalniają amoniak).
• izomerazy – umożliwiają wewnątrzcząsteczkową izomeryzację substratu. Proces może obejmować zmianę konfiguracji przy węglu asymetrycznym (racemazy i epimerazy), przeniesienie atomu wodoru (izomerazy) lub grupy funkcyjnej (mutazy).
• ligazy – są odpowiedzialne za syntezę (powstawanie nowych wiązań), związaną z pobraniem energii z fosforanów wysokoenergetycznych.
16.1.4 Kinetyka reakcji enzymatycznych.
W odróżnieniu od reakcji niekatalizowanych, szybkość reakcji enzymatycznej nie jest prostoliniową funkcją stężenia substratu, lecz graficznie przedstawia krzywą przypominającą hiperbolę.
s z y b k o s c r e a i , , j c k stezenie substratu,. [S] [V] v v1/2 Km
Reakcje enzymatyczne przebiegają etapowo, z wytworzeniem kompleksów enzym-substrat (ES) a następnie enzym-produkt (EP). E + S ES EP E + P k k+2 -3 k+1 k-1 k+3 k-2
Maksymalną szybkość reakcji, vmax osiągamy w przypadku całkowitego wysycenia miejsc aktywnych enzymu substratem. Dla scharakteryzowania własności katalitycznych enzymów wprowadzono pojęcie stałej Michaelisa-Menten, zdefiniowanej jako stężenie substratu (wyrażone w mol*dm-3) przy którym szybkość reakcji jest równa połowie szybkości maksymalnej.
16.1.5 Wpływ inhibitorów i aktywatorów na szybkość reakcji
enzymatycznych. Enzymy allosteryczne.
Inhibicja enzymów przez małe cząsteczki organiczne oraz jony ma zasadnicze znaczenia dla regulacji i kontroli procesów enzymatycznych w żywym organizmie. Inhibicja może być procesem odwracalnym bądź nieodwracalnym. W inhibicji nieodwracalnej inhibitor łączy się kowalencyjnie z enzymem lub wiąże się z nim w sposób na tyle silny, że rozdysocjowanie kompleksu jest praktycznie niemożliwe. W przeciwieństwie do inhibicji nieodwracalnej, inhibicję odwracalną cechuje szybki rozpad kompleksu enzym – inhibitor. Najprostszym typem odwracalnego hamowanie funkcji enzymu jest inhibicja kompetencyjna. W tym przypadku cząsteczka inhibitora wiąże się z enzymem w miejscu wiązania substratu, zmniejszając w ten sposób liczbę molekuł enzymu zdolnych do katalizowania reakcji, zmniejszając zatem szybkość katalizy. Inhibitory kompetencyjne są geometrycznie i stereoelektronowo podobne do substratu. Inhibitory niekompetencyjne wiążą się z enzymem jednocześnie z wiązaniem substratu. Spowalniacz tego typy zmienia własności enzymu, uniemożliwiając tym samym katalizowanie przez niego reakcji.
enzym substrat enzym inhibitor kompetencyjny enzym substrat inhibitor niekompetencyjny
Grupą enzymów charakteryzującą się odmiennymi właściwościami kinetycznymi oraz cechami procesów inhibicji i aktywacji są enzymy allosteryczne. W przypadku biokatalizatorów z tej grupy w każdej molekule występuje kilka (przynajmniej dwa) miejsca wiązania substratu, przy czym związanie substratu w jednym z tych miejsc zmienia powinowactwo (zmniejsza lub zwiększa) pozostałych centrów aktywnych do kolejnych cząsteczek substratu. Takie wiązanie substratu nazywamy wiązaniem kooperatywnym. Aktywność enzymu allosterycznego zależy ponadto od obecności cząsteczek regulujących, wiążących się podobnie jak inhibitory niekompetencyjne, poza centrum katalitycznym lecz zmieniających własności katalityczne cząsteczki enzymu. Mogą one mieć zarówno wpływ aktywujący jak i dezaktywujący na biokatalizator.
16.1.6 Wpływ pH i temperatury na aktywność enzymów.
Dla każdego enzymu istnieje optymalne pH, w którym wykazuje on maksymalną aktywność. Ponieważ pH wpływa na ładunek cząsteczki enzymu jak i częsteczki substratu, największą szybkość reakcji zaobserwujemy przy stężeniu jonów wodorowych gwarantującym największą różnicę pomiędzy ładunkiem substratu i enzymu (w szczególności zaś miejsca katalitycznego). Dodatkowo zmiany pH wpływają, na skutek jonizacji pewnych grup funkcyjnych białka, na zmianę struktury trzeciorzędowej a zatem i geometrii, cząsteczki enzymu, co pociąga za sobą zmiany aktywności katalitycznej. Poszczególne enzymy różnią się pH optymalnym. Pepsyna, karboksylaza drożdżowa czy też amylaza słodowa wykazują maksimum własności katalitycznych w
środowisku o odczynie kwaśnym (odpowiednio 1,7; 4,8 i 4,5 jednostki pH). Z kolei większość enzymów
trawiennych (lipaza trzustkowa, trypsyna, arginaza wątrobowa) najefektywniej działa w warunkach zasadowych (odpowiednio 7,8; 9 i 9,8 jednostki pH).
Podwyższenie reakcji o 100C powoduje wzrost szybkości reakcji 2-3 krotnie. W przypadku żywych organizmów prawo to dotyczy niewielkiego zakresu temperatur, w którym nie zachodzą zmiany strukturalne w białkach. Na ogół powyżej 450C zaczynają zachodzić zmiany w geometrii białek, prowadzące w ok. 700C do całkowitej inaktywacji enzymów. Wyjątek stanowią biokatalizatory izolowane z bakterii żyjących w pobliżu gorących źródeł, przystosowanych do życia w temperaturach bliskich punktowi wrzenia wody.