Analiza mechanizmu inicjacji translacji zachodzącej z kodonu AUG3

Kolejnym celem moich badań była analiza mechanizmu procesu inicjacji translacji zachodzącej z kodonu AUG3 dla izoformy Δ133p53. Wcześniejsze analizy, a także doniesienia literaturowe wykazały, że inicjacja translacji innego transkryptu mRNA p53 zachodząca z kodonu AUG2, może przebiegać w sposób kap-zależny, jak i IRES-zależny (Gorska et al., 2013a). Jak dotąd, sposób przebiegu inicjacji translacji z kodonu AUG3 nie został określony. W celu określenia, czy inicjacja translacji z kodonu AUG3 zachodzi w sposób zależny od struktury 5′ kap, przeprowadziłam badanie przebiegu translacji

in vitro w obecności wzrastającego stężenia analogu kapu m⁷GpppG.

Badanie przeprowadziłam z wykorzystaniem mRNA Δ133p53 w RRL wraz z metioniną znakowaną izotopem siarki [35

S]-Met. Do próbek dodany został analog kapu w stężeniach od 5 do 750 µM. Próbę kontrolną stanowiła reakcja, do której nie dodano analogu kapu (szczegółowy opis metody znajduje się w rozdziale 5.4.3.1.). Produkty po reakcji były rozdzielane elektroforetycznie w 15% warstwie rozdzielającej żelu poliakryloamidowego z dodatkiem 0,1% SDS, natomiast identyfikacja produktów translacji odbyła się na drodze autoradiografii.

141

Rysunek 57. Analiza efektywności translacji mRNA Δ133p53 zachodzącej z kodonu AUG3 w obecności wzrastającego stężenia analogu kapu m⁷GpppG. Autoradiogram przedstawia rozdział elektroforetyczny produktów po reakcji translacji in vitro, przeprowadzony w warunkach denaturujących, w 15% warstwie rozdzielającej żelu poliakryloamidowego z dodatkiem 0,1% SDS (szczegółowy opis metody znajduje się w rozdziale. 5.3.3.). Wykres prezentuje średnią efektywność translacji wyliczoną wraz z odchyleniem standardowym, z trzech niezależnych eksperymentów.

Analiza otrzymanych wyników wykazała, że efektywność translacji in vitro zachodzącej z kodonu AUG3 wzrasta wraz ze wzrostem stężenia analogu kapu w zakresie od 5 do 300 µM (Rys. 57). Natomiast przy wyższych stężeniach analogu intensywność prążka obecnego na autoradiogramie ulega zmniejszeniu.

Przebieg translacji in vitro zobrazowany jest na wykresie wygenerowanym w oparciu o dane uzyskane z trzech niezależnych powtórzeń eksperymentu. Przy stężeniu analogu kapu 50 µM obserwowana jest maksymalna wydajność translacji, która przekracza 160% wartości początkowej. Najniższą wydajność translacji obserwowano przy stężeniu analogu 750 µM i wynosi ona około 50% (Rys. 57). Powyższe obserwacje sugerują kap-niezależny charakter inicjacji translacji in vitro zachodzącej z kodonu AUG3, przebiegającej prawdopodobnie z udziałem elementu IRES.

142

3.3.5. Dyskusja

Celem przeprowadzonych przeze mnie badań było określenie struktury drugorzędowej regionu terminalnego 5′ mRNA Δ133p53. Model struktury tego regionu otrzymany został na podstawie badań mapowania strukturalnego metodą SHAPE oraz z wykorzystaniem metody cięcia RNA w obecności jonów Pb2+

. Poprzez wprowadzenie otrzymanych rezultatów do oprogramowania RNAstructure 5.6 wygenerowany został model struktury drugorzędowej. Badania te są niezwykle istotne, ponieważ struktura drugorzędowa regionu terminalnego 5′ mRNA Δ133p53 nie została wcześniej określona.

W zaproponowanym modelu struktury drugorzędowej regionu niekodującego 5′ mRNA Δ133p53 można wyróżnić kilka potencjalnie istotnych elementów strukturalnych (Rys. 54). Są to motywy: typu spinki obejmującej pozycje nukleotydowe G19–C49, odcinek jednoniciowy pomiędzy pozycjami A83 i A100, rozwidlony motyw struktury drugorzędowej typu ramię-pętla, obejmujący pozycje nukleotydowe od A103 do U204. Przeprowadzona analiza stopnia zdeterminowania strukturalnego wykazała, iż powyższe motywy cechują się wysoką zachowawczością (Rys. 55). Można zatem wnioskować, iż jest duże prawdopodobieństwo występowania powyższych motywów strukturalnych w takiej aranżacji w warunkach in vitro, co może przekładać się także na warunki komórkowe (Gorska et al., 2013a).

Dodatkowo, motywy strukturalne występujące w regionach jednoniciowych zaproponowanej struktury drugorzędowej mogą stanowić miejsca oddziaływania z białkami RBP (Wilkie et al., 2003; Ray et al., 2013). Białka te mogłyby wiązać się do mRNA oraz uczestniczyć w regulacji syntezy białek Δ133p53 oraz Δ160p53. Jednym z ciekawszych motywów sekwencyjnych zlokalizowanych w regionie terminalnym 5′ mRNA Δ133p53 jest odcinek bogaty w reszty pirymidynowe C oraz U. Reszty te, w pozycjach: C74–U77, C226–C230, oraz U243–C246, zlokalizowane są w niesparowanych regionach struktury drugorzędowej (Rys. 53). Mogą one być rozpoznawane przez białko PTB (ang. polypyrimidine tract binding protein) (Ray et al., 2013). Białko to uczestniczy w regulacji procesu obróbki posttranskrypcyjnej – wycinania intronów, jak również może stymulować translację

143 zależną od IRES (Brunel et al., 1996; Sawicka et al., 2008). Co niezwykle interesujące, odkrycia Grover i współpracowników wykazały, że białko PTB wiąże się do regionu terminalnego 5′ mRNA p53, zarówno w warunkach in vitro jak i in vivo. Szczególnie duże powinowactwo PTB wykazuje względem sekwencji nukleotydowej poniżej kodonu AUG1 (Grover et al., 2008). To sugeruje, iż białko PTB może wiązać się też do regionu terminalnego 5′ mRNA kolejnych izoform białka p53 – Δ133p53 i Δ160p53.

W regionie terminalnym 5′ mRNA Δ133p53 znajdują się także odcinki jednoniciowe bogate w reszty cytydyny (Rys. 53). Zlokalizowane są w pozycjach C262–C264, C268–C270 oraz C333–C336. Mogą one stanowić potencjalne miejsce wiązania białka PCBP (ang. poly(C)-binding protein). Białko to jest odpowiedzialne za stabilizację mRNA oraz regulację translacji (Choi et al., 2009). Dodatkowo w regionie niekodującym mRNA znajduje się też odcinek wielokrotnego powtórzenia reszty adenozyny, w pozycjach A83–A100, co może być potencjalnym miejscem oddziaływania z białkiem PABP (ang. poly(A)-binding protein), uczestniczącym w procesie poliadenylacji mRNA (Kuhn & Wahle 2004). Pomimo, iż PABP wiąże się głównie do regionu terminalnego 3′, wykazano, że może także wiązać się do elementów występujących w regionie 5′UTR (Wu & Bag 1998; Kulkarni et al., 2011). Przykładem jest wiązanie się PABP do 5′UTR mRNA insuliny (Kulkarni et al., 2011). Ponadto, PABP1 reguluje swoją własną syntezę poprzez wiązanie się do odcinka bogatego w reszty adenozyny w 5′UTR mRNA (Wu & Bag 1998). To potwierdza, że białko PABP potencjalnie może oddziaływać z 5′UTR mRNA Δ133p53.

Analiza efektywności syntezy białek Δ133p53 i Δ160p53 wykazała, że inicjacja translacji w warunkach in vitro zachodzi wyłącznie z kodonu AUG3 (Rys. 56). Przyczyną braku produktu białkowego syntetyzowanego z kodonu AUG4 mogą być ograniczenia związane z translacją in vitro przeprowadzaną w RRL. System ten ma uproszczony skład i pozbawiony jest wielu białek komórkowych. Możliwe, iż do syntezy izoformy Δ160p53 wymagane są dodatkowe czynniki białkowe ułatwiające zachodzenie tego procesu, nieobecne podczas syntezy w warunkach in vitro.

Co ciekawe, opublikowane niedawno wyniki doświadczeń przeprowadzonych w liniach komórkowych wykazały, iż translacja zachodzi zarówno z kodonu AUG3 jak i AUG4. Możliwa była identyfikacja obydwu białek za pomocą metody Western blot, choć

144 ich poziom jest bardzo niski (Marcel et al., 2013; Gadea et al., 2016). Jednakże, są to nieliczne badania, w których wykazano występowanie izoform na poziomie komórkowym. Głównym czynnikiem limitującym identyfikację endogennych izoform Δ133p53 oraz Δ160p53 jest ich niski poziom w komórce, a także brak handlowo dostępnych przeciwciał wykorzystywanych w metodzie Western blot. Co więcej, detekcja izoform dostępnymi przeciwciałami także może być zaburzona przez modyfikacje potranslacyjne w miejscu epitopu rozpoznawanego przez przeciwciało. Przykładem jest obniżenie wiązania przeciwciała DO-1 w wyniku fosforylacji reszty serynowej w pozycji 20 białka p53, co w konsekwencji uniemożliwia identyfikację białka p53 pełnej długości z wykorzystaniem tego przeciwciała (Webley et al., 2000).

W kolejnym etapie zbadano przebieg inicjacji translacji in vitro izoformy Δ133p53, w obecności wzrastającego stężenia analogu kapu m7

GpppG (Rys. 57). Spadek efektywności translacji nastąpił dopiero przy stężeniu analogu 500 µM. Biorąc pod uwagę to, że przy niższych stężeniach analogu obserwowana jest wzmożona synteza izoformy Δ133p53, sugeruje to inicjację translacji zależną od IRES. Podobną zależność pomiędzy stężeniem analogu kapu, a syntezą białka obserwowano dla izoformy Δ40p53 (Gorska et al., 2013a, Rys. 45). Przy niskim stężeniu analogu kapu translacja Δ40p53 była wzmożona, natomiast spadek nastąpił przy stężeniu powyżej 250 µM. Zarówno przedstawione w niniejszej pracy wyniki jak i dane literaturowe sugerują IRES-zależny mechanizm inicjacji translacji izoformy Δ40p53 (Candeias et al., 2008; Gorska et al., 2013a).

Co więcej, obserwowano, że wzmożona synteza białka Δ133p53 jest silnie zależna od obecności warunków stresowych w komórce (Arsic et al., 2015; Ji et al., 2015). Jest to zgodne z danymi literaturowymi na temat elementów IRES, gdyż translacja IRES-zależna aktywowana jest w komórkach głównie w warunkach stresowych (Leppek et al., 2018).

Aktywność komórkowych elementów IRES może także zależeć od białek, które służą jako czynniki ITAF. Ostatnie badania wykazały, że czynniki białkowe mogą odgrywać ważną rolę w ekspresji TP53, działając jako ITAF (Grover et al., 2008; Swiatkowska et al., 2015). Przykładami takich białek są PTB, HDM2 oraz RPL26 (Candeias et al., 2008; Grover et al., 2008; Khan et al., 2013). Aktywują one syntezę białka

145 p53 pełnej długości poprzez oddziaływanie z elementem IRES, szczególnie w warunkach stresowych. Przedstawione przeze mnie wyniki mapowania strukturalnego regionu terminalnego 5′ mRNA Δ133p53 umożliwiły wygenerowanie pierwszego modelu strukturalnego tego regionu. Model ten stanowi podstawę do dalszych badań nad poszukiwaniem czynników ITAF promujących IRES-zależną inicjację translacji izoform Δ133p53 i Δ160p53.

146