Doświadczenia wykonywane w lizacie z króliczych retikulocytów (RRL)

168 Wszystkie reakcje translacji in vitro prowadzono w RRL według zaleceń producenta (Promega). Produkty reakcji analizowano z wykorzystaniem elektroforezy w żelu poliakryloamidowym w warunkach denaturujących. Przed reakcją, mRNA inkubowano 3 minuty w temperaturze 65˚C i przenoszono na lód. Mieszanina reakcyjna zawierała 2,5 pmola modelowego konstruktu mRNA, 17,5 µl RRL, 20 µM mieszaninę aminokwasów (bez metioniny), 1 µl L-[S35

] metioniny (1000 Ci/mmol), 40 U inhibitora rybonukleaz i wodę do końcowej objętości 25 µl. Reakcję prowadzono 90 minut w temperaturze 30˚C, po czym przenoszono do lodu. W celu degradacji mRNA, do 5 µl mieszaniny reakcyjnej dodawano rybonukleazę A do końcowego stężenia 0,2 mg/ml i inkubowano przez 5 minut w temperaturze 25˚C. Następnie, dodawano 20 µl roztworu SSB. Produkty reakcji analizowano elektroforetycznie w 15% żelu poliakryloamidowym. Bezpośrednio przed elektroforezą, próby denaturowano przez 2 minuty w temperaturze 80˚C. Wizualizacja produktów odbywała się na drodze autoradiografii, z wykorzystaniem analizatora obrazu FLA 5100W.

W przypadku reakcji translacji in vitro z wolnym analogiem kapu końcowe stężenie m7G(5′)ppp(5′)G w reakcji wynosiło 5–750 µM. Przed dodaniem mRNA mieszaninę reakcyjną inkubowano w obecności analogu kapu i równomolowych ilości octanu magnezu przez 15 minut w temperaturze 30˚C.

5.4.3.2. Analiza kompleksów rybosomalnych 48S i 80S w RRL, tzw. metodą „odcisk palca”

Tworzenie kompleksów rybosomalnych 48S i 80S na mRNA P1-Δ40p53(S), P1-Δ40p53(L), P1-Δ40p53(ΔHDM2) oraz P1-Δ40p53(Δ57) analizowano przeprowadzając reakcję inhibicji odwrotnej transkrypcji w RRL tzw. metodą „odcisku palca”. W celu otrzymania „odcisku palca” dla kodonów AUG1 oraz AUG2 wykorzystano starter DNA Rluc330 (Tab. 7) hybrydyzujący do sekwencji kodującej lucyferazę Renilla oraz procedurę opisaną przez Dmitriev i wsp. (Dmitriev et al., 2003). Mieszanina reakcyjna zawierała 7, 14 µl RRL, 10 U inhibitora rybonukleaz oraz 13 mM octan magnezu. W reakcji kontrolnej lizat zastąpiono równą objętością wody. Aby zatrzymać kompleksy rybosomalne 48S i 80S, RRL traktowano cykloheksimidem o końcowym stężeniu 1mg/ml lub równą objętość wody dla reakcji kontrolnej.

169 Wszystkie próby inkubowano przez 5 minut w temperaturze 30˚C. Następnie do mieszaniny dodawany był 1 pmol mRNA zawierający kap na końcu 5′. Po 20 minutowej inkubacji w temperaturze 30˚C, do każdej reakcji dodawano około 5 µl startera DNA znakowanego izotopem ³²P na końcu 5′ i 8 µl mieszaniny do odwrotnej transkrypcji RT-MIX zawierającej 0,6 µl 320 mM MgOAc2, 1 µl 10 mM dNTP, 1 µl 10x buforu

Reconstitution, 4,9 µl wody i 5 U odwrotnej transkryptazy Super Script III. Reakcja

odwrotnej transkrypcji przebiegała przez 10 minut w temperaturze 30˚C.

Otrzymane cDNA oczyszczano poprzez ekstrakcję fenolem i mieszaniną chloroformu z alkoholem izoamylowym oraz strącano za pomocą etanolu. Produkty reakcji analizowano w 8% żelu poliakryloamidowym, w warunkach denaturujących. Przed nałożeniem na żel próbki denaturowano przez 2 minuty w temperaturze 95˚C w 7 M moczniku z barwnikami elektroforetycznymi.

5.4.3.3. Pomiar aktywności lucyferazy z wykorzystaniem systemu genu reporterowego lucyferazy Renilla

Translacja w czasie rzeczywistym została przeprowadzona w mieszaninie zawierającej 17,5 μl RRL (Promega), 20 μM mieszaniny aminokwasów bez metioniny, 20 μM mieszaniny aminokwasów bez leucyny, 10 U inhibitor rybonukleaz RNasin (Thermo Scientific) i 25 μM koelenterazyny (Promega) w końcowej objętości 25 μl. Do roztworu dodano 1,25 pmol mRNA zawierającego 5′ kap, uprzednio poddanego denaturacji przez 5 minut w 65°C. Próbki umieszczono w spektrofotometrze Victor 4 (Perkin Elmer), który utrzymywał temperaturę 30°C. Intensywność luminescencji mierzono co 8 sekund przez 1 s i 140 takich pomiarów zostało wykonanych.

Wyznaczenie całkowitego czasu translacji wykonano z pomocą dr Łukasza Popendy stosując program komputerowy Mathematica 8.0 (Wolfram Research, Inc., Champaign, II, USA) metodą analizy maksimum drugiej pochodnej w sposób zbliżony do metody opisanej przez Vassilenko i współpracowników (Vassilenko et al., 2011). W celu zmniejszenia efektu wzmocnienia sygnału szumu zarejestrowane w eksperymencie kinetyczne profile sygnału luminescencyjnego zostały w pierwszej kolejności dopasowane

170 funkcją wielomianową, a następnie obliczono dla niej pierwszą i drugą pochodną w celu wyznaczenia jej maksimum odpowiadającemu całkowitemu czasowi translacji.

Przykładowe dane otrzymane w trakcie pomiarów aktywności luminescencji lucyferazy w czasie rzeczywistym, uzyskane przy użyciu metody translacji in vitro w RRL z wykorzystaniem genu reporterowego lucyferazy Renilla dla konstruktu P0-Δ40p53 pokazano na rysunku 58.

Rysunek 58. Dane aktywności luminescencyjnej uzyskane przy użyciu metody translacji in vitro w RRL z wykorzystaniem genu reporterowego lucyferazy Renilla w funkcji czasu reakcji. Intensywność sygnału odzwierciedla wydajność translacji z konstruktu P0-Δ40p53. Nagły wzrost intensywności sygnału luminescencji pomiędzy 6-tą a 8-mą minutą czasu reakcji odpowiada pojawieniu się aktywności lucyferazy, wskutek zakończenia syntezy białka, która ma miejsce po wszystkich etapach syntezy, tj. inicjacji, elongacji i terminacji. Czas ten definiowany jest mianem średniego czasu translacji.

W przypadku danych uzyskiwanych bezpośrednio w pomiarach można obserwować szum, który może być spowodowany zarówno czynnikami aparaturowymi jak i czynnikami związanymi z przebiegiem samego eksperymentu. Konwencjonalne techniki numerycznego obliczania drugiej pochodnej powodują znaczne wzmocnienie wszelkich szumów i zniekształceń obecnych w danych pomiarowych, co powoduje, że wyniki są często nieczytelne. Zastosowanie technik redukcji szumów na danych przed różniczkowaniem lub po nim może z kolei prowadzić do niezadowalających wyników, a zatem w przypadku danych obarczonych błędem ich wcześniejsze przybliżenie funkcją analityczną wydaje się znacznie bardziej efektywne. Dla przykładu podanego na rysunku

171 58 stosunek sygnału do szumu jest akceptowalny. Jednak intensywność sygnału luminescencji nie jest tak duża w przypadku wszystkich zarejestrowanych danych co skutkuje w takich sytuacjach znacznie wyższym poziomem szumów.

Procesy fizyczne i chemiczne reprezentowane przez zbiory danych eksperymentalnych mogą być wyrażane lub przybliżone za pomocą funkcji matematycznej. Jeśli istnieje teoretyczny model danego zjawiska to do reprezentowania danych pomiarowych można użyć odpowiedniej funkcji matematycznej. W sytuacji braku zależności wyrażonej wzorem można próbować zastosować przybliżenie numeryczne w postaci założeń funkcji trygonometrycznych, logarytmicznych, wykładniczych lub wielomianowych, tak aby osiągnąć najbardziej maksymalne przybliżenie. Spośród wielu funkcji, testowanych w omawianym zagadnieniu przed właściwą analizą, najlepiej przybliżała dane eksperymentalne funkcja wielomianowa. Wielomiany są jedną z ważniejszych a jednocześnie należą do najprostszych klas funkcji analitycznych, będących najodpowiedniejszym wyborem w wielu zastosowaniach.

Równanie opisujące ogólną postać funkcji wielomianowej można przedstawić w sposób następujący:

𝑓(𝑥) = 𝑎₀𝑥0+ 𝑎₁𝑥1+ 𝑎₂𝑥2+ ⋯ + 𝑎_𝑛𝑥𝑛 = ∑ 𝑎_𝑖𝑥𝑖 𝑛

𝑖=0

(1)

gdzie a0, a1, a2, … an są współczynnikami wielomianu, a współczynnik n zwany jest stopniem wielomianu. W pierwszym etapie analizy eksperymentalnych profili kinetycznych sygnału luminescencyjnego do ich aproksymacji użyto funkcji L(t) w postaci funkcji wielomianowej f(x) (1), ze stopniem wielomianu n = 17 (Rys. 59). Stopień n funkcji wielomianowej został tak dobrany, aby uzyskać najlepszą zbieżność z danymi eksperymentalnymi, zaś czynnikiem decydującym o jakości dopasowania był współczynnik determinacji R².

172

Rysunek 59. Aproksymacja danych eksperymentalnych (czerwone punkty) sygnału luminescencyjnego zmierzonego dla konstruktu P0-Δ40p53 funkcją wielomianową L(t) (niebieska linia).

Rysunek 60. Pierwsza pochodna L′(t) funkcji wielomianowej L(t) przedstawionej na rysunku 59.

W kolejnych dwóch etapach funkcja wielomianowa L(t) wcześniej aproksymowana do krzywej luminescencji była różniczkowana, a jej pierwsza pochodna L′(t) została przedstawiona na rysunku 60, natomiast druga pochodna L′′(t) - na rysunku 61

Pozycja odciętej dla której wartość drugiej pochodnej przyjmuje wartość maksymalną, określa średni czas całkowitej translacji lub średni czas syntezy lucyferazy pełnej długości w danej rundzie translacji. W przedstawionym przykładzie (Rys. 58–61)średni czas pełnej translacji dla translacji konstruktu P0-Δ40p53 wynosił 7 min 36 s. Poprawność dopasowania, R² w tym przykładzie wynosiła 0,999664. Aby zweryfikować powtarzalność danych (uzyskanych jak wyżej), zebrano trzy niezależne

173 zbiory danych dla każdego konstruktu. Po tych pomiarach określono również standardowe odchylenia danych.

Rysunek 61. Druga pochodna L′′(t) funkcji wielomianowej L(t) z rysunku 59. Pozycja odciętej dla której wartość drugiej pochodnej funkcji L(t) osiąga maksimum odpowiada średniemu całkowitemu czasowi translacji.