Przedstawione przeze mnie wyniki badań wskazują na niezwykle ważną rolę regionów terminalnych 5′ mRNA w procesie translacji. Przeprowadzone analizy efektywności syntezy białek p53 i Δ40p53, zarówno w warunkach in vitro jak i w liniach komórkowych, wykazały, że zaburzenie struktury drugorzędowej regionu terminalnego 5′ mRNA p53 obniża efektywność syntezy tych białek, w szczególności w warunkach stresowych. Dodatkowo analizy wykazują, że ustrukturyzowanie tego regionu mRNA wpływa bardzo istotnie na wydajność inicjacji translacji. Zaburzenie struktury drugorzędowej w obrębie regionu niekodującego 5′ mRNA może zmieniać sposób skanowania tego regionu przez rybosomalny kompleks inicjacyjny. Rearanżacje strukturalne wprowadzone w elementach typu spinki do włosów, obecnych w tym regionie, mają duży wpływ także na inicjację translacji zachodzącą z udziałem elementu IRES. Co więcej, można przypuszczać, że mogą również zmieniać powinowactwo wiążących się białek, w tym czynników ITAF. Przeprowadzone przeze mnie badania potwierdziły, że określenie struktury drugorzędowej regionu niekodującego 5′ mRNA p53 jest niezbędne dla bliższego poznania mechanizmu inicjacji translacji i efektywności syntezy białka p53 i jego izoform, co w dalszym etapie pozwoli na bliższe poznanie ich funkcji w komórce.
Rola elementów strukturalnych regionu terminalnego 5′ mRNA p53 w procesie translacji analizowana za pomocą oligonukleotydów antysensowych
Przeprowadzona została analiza efektywności syntezy białek p53 oraz Δ40p53 w liniach komórkowych MFC-7, HT-29 i HepG2 w warunkach stresu komórkowego. Wykorzystane zostały oligonukleotydy antysensowe przyłączające się do istotnych elementów strukturalnych regionu terminalnego 5′ mRNA p53 takich jak: spinka U180–A218 oraz fragment jednoniciowy A219–U228. Zastosowanie oligomerów spowodowało znaczne zmiany strukturalne tego regionu mRNA, co zostało potwierdzone eksperymentalnie za pomocą badań mapowania strukturalnego RNA (Rys. 18 i 19). W konsekwencji hybrydyzacji oligonukleotydów i zaburzenia struktury drugorzędowej
147 regionu terminalnego 5′ mRNA, efektywności syntezy p53 oraz Δ40p53 uległa istotnej zmianie, w szczególności w warunkach stresowych. Analizy Western blot wykazały, że zastosowanie oligonukleotydów antysensowych znacznie obniżyło efektywność translacji izoformy Δ40p53 w komórkach HT-29, w warunkach stresowych, co prawdopodobnie jest spowodowane zahamowaniem inicjacji translacji przebiegającej z udziałem elementu IRES (Rys. 22). Dodatkowo zastosowane oligomery wywołały obniżenie wydajności syntezy białka p53 w komórkach MCF-7, spowodowane przez zaburzenie struktury drugorzędowej w obrębie regionu U180–U228, co było obserwowane pod wpływem stresu komórkowego (Rys. 24). Co ciekawe, zastosowane oligomery w linii komórkowej HepG2 pod wpływem stresu spowodowały wzrost syntezy izoformy Δ40p53, co jest dowodem na rozplecene struktury drugorzędowej w obrębie spinki U180–A218 i ułatwienie przebiegu translacji według mechanizmu zależnego od elementu IRES (Rys. 26 i 27).
Badania z zastosowaniem oligonukleotydów antysensowych wykazały, że elementy strukturalne regionu terminalnego 5′ mRNA p53: spinka U180–A218 oraz fragment jednoniciowy A219–U228 pełnią istotną rolę w procesie syntezy białka p53 oraz izoformy Δ40p53, zwłaszcza w warunkach translacji przebiegającej z udziałem elementu IRES. Obydwa motywy strukturalne mogą pełnić rolę elementów cis, umożliwiających przyłączenie się białek pełniących funkcję czynników ITAF i przebieg translacji według mechanizmu niezależnego od kapu na końcu 5′ mRNA.
Wpływ wariantów regionu terminalnego 5′ mRNA p53 na proces skanowania mRNA przez rybosom i efektywność translacji
Celem kolejnych badań realizowanych w ramach mojej pracy doktorskiej było określenie zależności między szybkością skanowania mRNA przez kompleks rybosomalny a strukturą drugorzędową regionu terminalnego 5′, długością tego regionu oraz kontekstem strukturalnym w obrębie kodonu inicjacyjnego AUG. Przeprowadzone zostały pomiary szybkości inicjacji translacji, a także efektywności translacji z wykorzystaniem systemu genu reporterowego lucyferazy Renilla. Analizom zostały poddane warianty sekwencyjne mRNA p53 posiadające istotne różnice w obrębie regionu
148 terminalnego 5′ mRNA (Rys. 32, 33, 34, 35). Wyniki przeprowadzonych pomiarów czasu skanowania mRNA przez rybosomalny kompleks inicjacyjny potwierdziły, iż dla niektórych wariantów czas skanowania regionu terminalnego 5′ mRNA jest proporcjonalny do długości tego regionu (Rys. 41). Co ważne, dobranie w pary wariantów różniących się jedynie obecnością 113-nukleotydowego regionu P0-P1, umożliwiło zilustrowanie wpływu wydłużenia regionu terminalnego 5’ na opóźnienie skanowania mRNA przez kompleks rybosomalny (Rys. 50). Jednakże, co niezwykle istotne, wykazano także, że skanowanie regionu terminalnego 5′ mRNA zależy również od struktury drugorzędowej w jego obrębie. Wykazałam bowiem, iż ta sama 113-nukleotydowa sekwencja, lecz zwijająca się w odmienną strukturę drugorzędową, może być skanowana z różną szybkością: 1,4 nt/s, 3 nt/s lub 6,6 nt/s (Rys. 41, 42, Tab. 3, 4). Co więcej, kolejne analizy ujawniły, że czas skanowania mRNA przez rybosom silnie zależy od kontekstu strukturalnego, w jakim znajduje sie kodon inicjacyjny AUG. Czas skanowania dla konstruktu mRNA, w którym kodon AUG znajduje się w regionie jednoniciowym był istotnie krótszy i wynosił 7 min i 35 s, natomiast dla konstruktu z kodonem umiejscowionym w strukturze dwuniciowej wynosił on 8 min (Rys. 42, Tab. 4). Jednoniciowa struktura w obrębie kodonu inicjacyjnego AUG sprawia, że region jest bardziej dostępny dla rybosomu i także efektywność translacji ulega znacznemu zwiększeniu.
Dodatkowo przeprowadzone zostały analizy efektywności translacji in vitro przygotowanych wariantów. Zaobserwowano, iż efektywność translacji znacznie różni się pomiędzy poszczególnymi wariantami i silnie zależy od regionu terminalnego 5′ mRNA (Rys. 36, 37 i 38). Dla wariantu o regionie najkrótszym efektywność translacji była około 10-krotnie wyższa niż dla wariantu z najdłuższym regionem niekodującym 5′ (Rys. 37 i 38). Dla wariantu, którego kodon inicjacyjny AUG znajduje się w jednoniciowej strukturze efektywność była znacznie wyższa i wynosiła ponad 210% efektywności wyznaczonej dla wariantu wyjściowego, natomiast dla konstruktu z kodonem AUG w dwuniciowej strukturze wynosiła ona zaledwie 20% (Rys. 36).
Ponadto usunięcie istotnych elementów strukturalnych regionu terminalnego 5′ mRNA p53, spinek G56–C169 oraz U180–A218, istotnie wpłynęło nie tylko na efektywność translacji oraz czas skanowania, lecz także na przebieg inicjacji translacji.
149 Obydwie zmiany spowodowały zahamowanie IRES zależnej inicjacji translacji (Rys. 46). To oznacza, iż obydwa elementy strukturalne są niezbędne do prawidłowego przebiegu translacji według mechanizmu niezależnego od kapu.
Badania szybkości skanowania mRNA przez rybosom przeprowadzone z wykorzystaniem modelowych wariantów regionu terminalnego 5′ mRNA potwierdziły jak ważną rolę w procesie inicjacji translacji pełni struktura drugorzędowa. Wszelkie zmiany strukturalne wprowadzone w tym regionie skutkowały znaczną różnicą czasu skanowania mRNA przez rybosomalny kompleks inicjacyjny (Rys. 50) oraz zmianami w efektywności translacji.
Badanie struktury drugorzędowej regionu terminalnego 5′ mRNA Δ133p53 oraz efektywności translacji zachodzącej z kodonów AUG3 i AUG4
W kolejnym etapie moich badań, określiłam strukturę drugorzędową regionu terminalnego 5′ mRNA Δ133p53. Przeprowadzone zostały analizy mapowania struktury drugorzędowej tego regionu z wykorzystaniem metody SHAPE oraz cięcia mRNA w obecności jonów ołowiu (II) (Rys. 52 i 53). Wyniki badań eksperymentalnych zostały wprowadzone do programu komputerowego RNAstructure 5.6 i wygenerowany został prawdopodobny model struktury drugorzędowej regionu terminalnego 5′ mRNA Δ133p53 (Rys. 54).
Przeprowadzona została także translacja mRNA Δ133p53 w warunkach in vitro w lizacie z retikulocytów króliczych. Nieoczekiwanie po przeprowadzonej reakcji obserwowany był jeden produkt białkowy, pomimo występowania w mRNA dwóch kodonów inicjacyjnych – AUG3 oraz AUG4 (Rys. 56). W celu określenia, który kodon bierze udział w translacji, kodon AUG3 dla Δ133p53 oraz AUG4 dla Δ160p53 zostały kolejno poddane ukierunkowanej mutagenezie. Eksperyment pokazał, że wiodącym kodonem start, z którego zachodzi translacja w warunkach in vitro jest kodon inicjacyjny AUG3 dla izoformy Δ133p53.
Wykonano również analizę przebiegu inicjacji translacji in vitro izoformy Δ133p53 w obecności wzrastającego stężenia analogu kapu m7
GpppG. Co interesujące, wyniki sugerują, iż synteza Δ133p53 nie ulega silnej inhibicji po dodaniu analogu kapu (Rys. 57).
150 Spadek efektywności translacji następował dopiero w wysokich stężeniach analogu kapu, powyżej 500 µM. Sugeruje to, że w regionie terminalnym 5′ mRNA Δ133p53 może znajdować się element IRES, dzięki któremu inicjacja translacji z kodonu AUG3 może zachodzić w sposób niezależny od struktury kapu na końcu 5′ mRNA.
151