Analiza regionów subtelomerowych i regionów związanych z zespołami

Analiza regionów subtelomerowych metodą MLPA pozwoliła na identyfikację dodatkowych trisomi chromosomowych oraz aberracji strukturalnych, nie zidentyfikowała jednak submikroskopowych rearanżacji w tych regionach. Znaczenie rearanżacji subtelomerowych w poronieniach samoistnych, szczególnie tych nawracających, jest dyskusyjne, aczkolwiek istnieją prace przedstawiające pary z poronieniami nawracającymi, które są nosicielami zmian w tych regionach (Brackley i wsp., 1999; Monfort i wsp., 2006). Wydaje się jednak, iż tego typu aberracje można zidentyfikować u par, w rodowodzie których występowały nie tylko poronienia samoistne, ale także urodzenia dzieci z wadami wrodzonymi, cechami dysmorfii oraz/lub z niepełnosprawnością intelektualną. Badania wśród pacjentów tylko z poronieniami nawracającymi w większości nie potwierdziły zmian w tych regionach (Benzacken i wsp., 2002; Fan, Zhang, 2003; Jalal i wsp., 2003). Ponadto, wdrożenie do diagnostyki metod mikromacierzowych, takich jak array CGH pozwala na ocenę zmian submikroskopowych nie tylko w regionach subtelomerowych, ale także w pozostałych regionach chromosomowych, co wydaje się w przypadku par z niepowodzeniami ciąży dużo lepszym rozwiązaniem, niż analiza samych subtelomerów.

147

Metoda MLPA pozwoliła natomiast na identyfikację dodatkowych trisomii chromosomów autosomalnych oraz aberracji strukturalnych. Wykorzystanie testu subtelomerowego MLPA w poronieniach samoistnych zaproponował Bruno (Bruno i wsp., 2006). W pierwszym teście przebadali 78 kosmówek metodą MLPA oraz wykonali analizę kariotypu, natomiast w drugim teście wykonali badanie MLPA z zestawem P069 i P036 na 100 kosmówkach, dodatkowo stosując FISH z sondą 13/21 do analizy triploidii. W pierwszym badaniu udało im się uzyskać wyniki w 95% przypadków, w drugim, dzięki większej ilości kosmówki przeznaczonej do izolacji DNA (5-10 μg zamiast 1-5 µg) wyniki uzyskali w 97% przypadków (Bruno i wsp., 2006). W badaniu zidentyfikowali wszystkie trisomie autosomalne, monosomię X oraz aberracje strukturalne. W przypadku 100 kosmówek badanych tylko metodą MLPA nieprawidłowości zidentyfikowano w 18 (Bruno i wsp., 2006). Test nie zidentyfikował jedynie triploidii, jednak w pozostałych przypadkach okazał się skuteczny i efektywny.

Diego-Alvarez i wsp. (2007) badali wykorzystanie testu subtelomerowego MLPA P036 i P070 do analizy materiału z poronienia. W tym celu przebadali 221 kosmówek, dodatkowo wykonując w 178 przypadkach także analizę cytogenetyczną (Diego-Alvarez i wsp., 2007). Wyniki uzyskano dla wszystkich prób. Zidentyfikowali trisomie autosomalne (duplikacje sond w ramieniu p i q chromosomu w obu zestawach), aberracje strukturalne (delecję i duplikację w ramionach p lub q chromosomów), ale także trzy submikroskopowe zmiany o charakterze delecji/duplikacji, które nie zostały zidentyfikowane w badaniu kariotypu. Test nie zidentyfikował triploidi, zrównoważonych translokacji oraz interstycjalnych delecji/duplikacji, co według autorów może zmniejszyć odsetek identyfikowanych zmian o około 7% (Diego-Alvarez i wsp., 2007). Pomimo tego, uznali test subtelomerowy za skuteczny a w połączeniu z metodą QF-PCR oraz badaniami cytogenetycznymi pozwalający uzyskać wiarygodne wyniki badań.

Donaghue zaproponowała połączenie dwóch testów molekularnych, które pozwoliłyby zastąpić klasyczną analizę kariotypu i wyeliminować ewentualne ograniczenia obu metod (Donaghue i wsp., 2010). Ocenili oni, iż w ciągu 10 lat przeprowadzania klasycznej analizy kariotypu w około 2,7% przypadków analiza cytogenetyczna nie pozwoliła na identyfikację subtelnych zmian typu delecji/duplikacji (Donaghue i wsp., 2010). Stąd próba zastosowania połączonych badań molekularnych. Badania przeprowadzili na 500 próbach pochodzących z materiału z poronienia

148

(Donaghue i wsp., 2010). W pierwszym etapie zastosowali analizę QF-PCR dla chromosomów pary 13, 18, 21, X i Y, a gdy wynik był prawidłowy stosowali test subtelomerowy MLPA P069. Jeśli wynik wskazywał na trisomię 14, 15 lub 16, potwierdzali to metodą QF-PCR, jeśli natomiast inne sondy wykazywały nieprawidłowe wartości przeprowadzali dodatkową analizę drugim testem MLPA P036. Takie same nieprawidłowości zidentyfikowane w obu testach traktowali, jako aberrację chromosomową, jeśli natomiast dotyczyły tylko jednego, uznawali za wynik prawidłowy. Skuteczność obu połączonych metod wynosiła 95%, przy czym 88% wyników uzyskiwano w okresie poniżej 28 dni (Donaghue i wsp., 2010). Nieprawidłowości wykryto w 23% przypadków, a odsetek ten był podobny, jaki uzyskiwano stosując jedynie metody cytogenetyki klasycznej (Donaghue i wsp., 2010).

Przedstawione powyżej badania pokazują kierunki współczesnej genetycznej diagnostyki niepowodzeń ciąży. W badaniach własnych zastosowano nieco odmienne podejście – rozszerzając pierwszy test o badanie chromosomów, których aneuploidie najczęściej są spotykane w materiale z poronienia (13, 15, 16, 18, 21, 22, X i Y), co wydaje się dużo lepszym podejściem i pozwala na wykrycie około 80% aberracji chromosomowych. W przypadku MLPA subtelomerowego skuteczność w badaniach własnych wynosiła mniej, bo 81%, na co wpływ mogła mieć zarówno technika izolacji DNA jak i jakość materiału wyjściowego - kosmówki. Ponieważ MLPA jest metodą niezwykle czułą na wszelkiego typu zanieczyszczenia, zdecydowanie lepszym rozwiązaniem jest izolacja DNA z użyciem gotowych zestawów do izolacji, pozwalających uzyskać DNA o wyższej jakości i czystości. Ponadto, niejednokrotnie dostarczany materiał uległ już częściowej degradacji, stąd po izolacji, DNA genomowy był częściowo zdegradowany, z małą ilością wysokocząsteczkowego DNA, co przekładało się na uzyskiwane w badaniu rezultaty. W pozostałych przypadkach test MLPA z zestawem P036 i P070 pozwolił na identyfikację dodatkowych trisomii oraz aberracji strukturalnych chromosomów. Mimo iż niektórzy podkreślają większą skuteczność zestawu P070 (wcześniejszy test P069) niż P036 (Donaghue i wsp., 2010) to badania własne nie potwierdziły tej zależności. W obu testach uzyskiwano podobne rezultaty, a ze względu na to, iż jeden zestaw ma zaprojektowaną tylko jedną sondę dla każdego ramienia, stosowanie dwóch zestawów jednocześnie wydaje się bardziej zasadne, ponieważ zmniejsza ryzyko niejednoznacznych wyników.

149

Badania z zastosowaniem zestawu MLPA do identyfikacji zespołów mikrodelecji/mikroduplikacji nie potwierdziły występowania zmian w analizowanych regionach w badanej grupie kosmówek. Może to wynikać z tego, iż zestaw ten przeznaczony jest do diagnostyki zespołów identyfikowanych u dzieci z cechami dysmorfii, wadami, opóźnieniem rozwojowym. Trudno ocenić, czy są one także przyczyną niepowodzeń ciąży, ponieważ często są to zmiany submikroskopowe, które nie są identyfikowane w klasycznym badaniu kariotypu. Wstępne rozpoznanie określonego zespołu jest ustalane na podstawie analizy dysmorfologicznej, co w przypadku niepowodzeń ciąży jest niemożliwie. Jednakże, z drugiej strony, w przypadku jednej z kosmówek (kosmówka nr 118), która została zakwalifikowana do badania metodą array CGH zidentyfikowano submikroskopową duplikację w regionie 4p16.3, co pokazuje, że tego typu zmiany także mogą zostać rozpoznane w przypadku materiału z poronienia.

5.7. Analiza badania materiału z poronienia przeprowadzona metodą