MLPA P036 i P070

Analizę regionów subtelomerowych metodą MLPA dwoma zestawami P036 i P070 podjęto w przypadku 77 kosmówek. Do badania zakwalifikowano 74 kosmówki, w przypadku których nie zidentyfikowano nieprawidłowości chromosomowych metodami FISH, QF-PCR oraz MLPA z zestawem P095. Dodatkowo do badania włączono także 3 dodatkowe kosmówki nr: 21, 42, 94. W przypadku kosmówki nr 21 analizę regionów subtelomerowych wykonano, aby ocenić sposób dziedziczenia chromosomów w gametach, ze względu na nosicielstwo u matki translokacji wzajemnej zrównoważonej pomiędzy chromosomami pary 14 i 18 (wyniki badan metodą FISH, QF-PCR i MLPA P095 wskazywały na występowanie u płodu trisomii chromosomu pary 18).

W drugim przypadku (kosmówka nr 42) zidentyfikowano występowanie dodatkowego materiału genetycznego pochodzącego od matki, która jest nosicielką chromosomu markerowego utworzonego z krótkich ramion chromosomów akrocentrycznych pary 14 lub 22. Ze względu na to, iż w krótkich ramionach chromosomów akrocentrycznych nie występują sekwencje kodujące białka, podjęto analizę regionów subtelomerowych w celu wykluczenia innych, dodatkowych aberracji chromosomowych.

W trzecim przypadku, kosmówki nr 94, analiza FISH wykryła obecność w 84% jąder interfazowych chromosomów płci XX, a w 16% chromosomów X i Y. Badania molekularne metodą QF-PCR oraz MLPA P095 nie wykazały natomiast występowania chromosomu Y w badanym DNA. W obu przypadkach wyniki badań były prawidłowe i wskazywały na występowanie płci żeńskiej.

Spośród 77 kosmówek zakwalifikowanych do badań informacyjne wyniki udało się uzyskać w 62 przypadkach (81% badanych kosmówek). W przypadku pozostałych 15 kosmówek wyniki rozdziału elektroforezy kapilarnej były nieinformacyjne i nie pozwoliły na prawidłową analizę produktów amplifikacji.

Badania regionów subtelomerowych z zestawami MLPA P036 i P070 pozwoliły na zidentyfikowanie nieprawidłowości w 7 kosmówkach. W 4 przypadkach wyniki badań wskazywały na obecność dodatkowej kopii chromosomu pary: 7 (kosmówka nr 91), 8 (kosmówka nr 57), 14 (kosmówka nr 56) i 20 (kosmówka nr 48), czyli występowanie trisomii chromosomów autosomalnych. W 2 kosmówkach stwierdzono występowanie delecji i duplikacji w regionach subtelomerowych: kosmówka nr 11 –

92

delecja w regionie 6q i duplikacja w regionie 9q oraz kosmówka nr 122 – delecja w regionie 6q i duplikacja w regionie 2p. W przypadku kosmówki nr 21 stwierdzono występowanie duplikacji w regionie 18q.

W pozostałych 55 kosmówkach nie stwierdzono nieprawidłowości świadczących o występowaniu trisomii lub innej aberracji strukturalnej o charakterze delecji lub duplikacji. Średnie wartości fluorescencji dla sond w zestawie P036 w przypadku prawidłowych kosmówek znajdowały się w granicach od 0,96 do 1,02, a wartości odchylenia standardowego w przedziale od 0,07 do 0,17. Dla zestawu P070 średnie wartości fluorescencji prawidłowych kosmówek wynosiły od 0,95 do 1,02, a wartości odchylenia standardowego od 0,05 do 0,17. Średnie wartości fluorescencji oraz wartości odchylenia standardowego dla każdej sondy w zestawie P036 i P070 przedstawiono na Rycinach 27 i 28.

93 0 0,5 1 1,5 1p 2p 3p 4p 5p 6p 7p 8p 9p 10p 11p 12p 13p 14p 15p 16p 17p 18p 19p 20p 21p 22p X-Yp 1q 2q 3q 4q 5q 6q 7q 8q 9q 10q 11q 12q 13q 14q 15q 16q 17q 18q 19q 20q 21q 22q X-Yq

Ryc. 27 Fragment analizy MLPA P036 (Microsoft Excel 2007). Wyniki prawidłowe 55 kosmówek. Na wykresie przedstawiono średnie wartości fluorescencji pików dla wszystkich sond w zestawie P036 oraz wartości odchylenia standardowego dla poszczególnych sond. Średnie wartości są bliskie 1,0, natomiast wartość odchylenia standardowego dla poszczególnych sond wyniosła od 0,07 do 0,17.

94 0 0,5 1 1,5 1q 2q 3q 4q 5q 6q 7q 8q 9q 10q 11q 12q 13q 14q 15q 16q 17q 18q 19q 20q 21q 22q X-Yq 1p 2p 3p 4p 5p 6p 7p 8p 9p 10p 11p 12p 13p 14p 15p 16p 17p 18p 19p 20p 21p 22p X-Yp

Ryc. 28 Fragment analizy MLPA P070 (Microsoft Excel 2007). Wyniki prawidłowe 55 kosmówek. Na wykresie przedstawiono średnie wartości fluorescencji pików dla wszystkich sond w zestawie P070 oraz wartości odchylenia standardowego dla poszczególnych sond. Średnie wartości są bliskie 1,0, natomiast wartość odchylenia standardowego dla poszczególnych sond wyniosła od 0,05 do 0,17.

95

Trisomia 7

Trisomię chromosomu pary 7 zidentyfikowano w przypadku kosmówki nr 91. Analiza MLPA z zestawem P036 i P070 wykazała występowanie duplikacji w regionach subtelomerowych chromosomu pary 7 – 7p i 7q. Wartości pomiaru fluorescencji dla sond regionu 7p wynosiły dla zestawu P036 i P070 odpowiednio 1,52 i 1,35, a dla regionu 7q - 1,39 i 1,44. Analiza wyników w programie Peak Scanner Software v.1.0 przedstawia Rycina 29. Wyniki uzyskane metodą MLPA zostały potwierdzone metodą FISH z sondami subtelomerowymi do ramion p i q chromosomu pary 7 oraz z sondą kontrolną do ramienia q chromosomu pary 14 (Ryc. 30).

Ryc. 29 Fragment analizy MLPA z zestawem P036 i P070 (Peak Scanner Software v.1.0). Wynik nieprawidłowy wskazujący na występowanie dodatkowego chromosomu pary 7 (trisomia 7). Rycina A przedstawia rozdział pików w zestawie P036, rycina B w zestawie P070. Strzałkami oznaczono wzrost wysokości pików dla sondy 7p i 7q w obu zestawach. Duplikacja w obu regionach, w każdym zestawie oznacza trisomię chromosomu pary 7.

96

A B B

Ryc. 30 FISH do jąder interfazowych z sondami subtelomerowymi do ramion p i q chromosomu pary 7. Strzałkami zaznaczono sygnały hybrydyzacyjne. Czerwone sygnały pochodzą od sondy hybrydyzującej do ramienia 7q (7QTEL20), zielone od sondy 7p (G31341), a niebieskie od sondy hybrydyzującej do ramienia q chromosomu pary 14 (D14S1420). Na Rycinie A przedstawiono jądro interfazowe z trzema sygnałami pochodzącymi od sondy 7p i 7q oraz dwoma od sondy 14q. Rycina B przedstawia tylko sondy hybrydyzujące do ramion p i q chromosomu pary 7.

Trisomia 8

Obecność dodatkowej kopii chromosomu pary 8 zaobserwowano w przypadku kosmówki nr 57. Analiza MLPA z zestawem P036 i P070 wykazała występowanie duplikacji w regionach subtelomerowych chromosomu pary 8 – 8p i 8q. Wartości pomiaru fluorescencji dla sond regionu 8p wynosiły dla zestawu P036 i P070 odpowiednio 1,36 i 1,35, a dla regionu 8q - 1,41 i 1,35. Analizę wyników w programie Peak Scanner Software v.1.0 przedstawia Rycina 31. Wyniki uzyskane metodą MLPA zostały potwierdzone metodą FISH z sondami subtelomerowymi do ramion p i q chromosomu pary 8 oraz z sondą kontrolną do ramienia p chromosomu pary 17 (Ryc. 32).

97

Ryc. 31 Fragment analizy MLPA z zestawem P036 i P070 (Peak Scanner Software v.1.0). Wynik nieprawidłowy wskazujący na występowanie dodatkowego chromosomu pary 8. Rycina A przedstawia rozdział pików w zestawie P036, Rycina B w zestawie P070. Strzałkami oznaczono wzrost wysokości pików dla sondy 8p i 8q w obu zestawach. Duplikacja w obu regionach, w każdym zestawie oznacza trisomię chromosomu pary 8.

A B

Ryc. 32 FISH do jąder interfazowych z sondami subtelomerowymi do ramion p i q chromosomu pary 8. Strzałkami zaznaczono sygnały hybrydyzacyjne. Czerwone sygnały pochodzą od sondy hybrydyzującej

do ramienia 8q (VIJ²yRM2053), zielone od sondy 8p (D8S504), a niebieskie od sondy hybrydyzującej do

ramienia p chromosomu pary 17 (282M15/SP6). Na Rycinie A i B przedstawiono jądro interfazowe z trzema sygnałami pochodzącymi od sondy 8p i 8q oraz dwoma sygnałami od sondy 17p.

98

Trisomia 14

W przypadku kosmówki nr 56 zidentyfikowano trisomię chromosomu pary 14. Analiza MLPA z zestawem P036 i P070 wykazała występowanie duplikacji w regionach subtelomerowych chromosomu pary 14 – 14”p” i 14q (sonda 14p hybrydyzuje do sekwencji leżącej pod centromerem ramienia q, ze względu na to, iż chromosom pary 14 jest akrocentrykiem i nie posiada sekwencji kodujących w okolicach subtelomeru ramienia p). Wartości pomiaru fluorescencji dla sond regionu 14p wynosiły dla zestawu P036 i P070 odpowiednio 1,37 i 1,52, a dla regionu 14q - 1,45 i 1,38. Analizę wyników w programie Peak Scanner Software v.1.0 przedstawia Rycina 33. Wyniki uzyskane metodą MLPA zostały potwierdzone metodą FISH z sondami subtelomerowymi do ramienia q chromosomu pary 14 (Ryc. 34).

Ryc. 33 Fragment analizy MLPA z zestawem P036 i P070 (Peak Scanner Software v.1.0). Wynik nieprawidłowy wskazujący na występowanie dodatkowego chromosomu pary 14. Rycina A przedstawia rozdział pików w zestawie P036, Rycina B w zestawie P070. Strzałkami oznaczono wzrost wysokości pików dla sondy 14p i 14q w obu zestawach. Duplikacja w obu regionach, w każdym zestawie oznacza trisomię chromosomu pary 14.

99

Ryc. 34 FISH do jąder interfazowych z sondami subtelomerowymi do ramienia q chromosomu pary 14. Strzałkami zaznaczono sygnały hybrydyzacyjne. Niebieskie sygnały pochodzą od sondy hybrydyzującej do ramienia 14q (D14S1420). Na Rycinie przedstawiono jądro interfazowe z trzema sygnałami pochodzącymi od sondy 14q.

Trisomia 20

Obecność dodatkowej kopii chromosomu pary 20 zaobserwowano w przypadku kosmowki nr 48. Analiza MLPA z zestawem P036 i P070 wykazała występowanie duplikacji w regionach subtelomerowych chromosomu pary 20 – 20p i 20q. Wartości pomiaru fluorescencji dla sond regionu 20p wynosiły dla zestawu P036 i P070 odpowiednio 1,41 i 1,74, a dla regionu 20q - 1,43 i 1,55. Analizę wyników w programie Peak Scanner Software v.1.0 przedstawia Rycina 35. Wyniki uzyskane metodą MLPA zostały potwierdzone metodą FISH z sondami subtelomerowymi do ramion p i q chromosomu pary 20 (Ryc. 36).

100

Ryc. 35 Fragment analizy MLPA z zestawem P036 i P070 (Peak Scanner Software v.1.0). Wynik nieprawidłowy wskazujący na występowanie dodatkowego chromosomu pary 14. Rycina A przedstawia rozdział pików w zestawie P036, Rycina B w zestawie P070. Strzałkami oznaczono wzrost wysokości pików dla sondy 14p i 14q w obu zestawach. Duplikacja w obu regionach, w każdym zestawie oznacza trisomię chromosomu pary 14.

Ryc. 36 FISH do jąder interfazowych z sondami subtelomerowymi do ramienia q chromosomu pary 20. Strzałkami zaznaczono sygnały hybrydyzacyjne. Czerwone sygnały pochodzą od sondy hybrydyzującej do ramienia 20q (20QTEL14), zielone od sondy 20p (D20S1157). Na Rycinie przedstawiono jądro interfazowe z trzema sygnałami pochodzącymi od sondy 20p i 20q.

101