Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) oraz jej odmiany

Techniki molekularne oparte na metodzie PCR znalazły wszechstronne zastosowanie w diagnostyce chorób genetycznych: począwszy od identyfikacji mutacji na podstawie analizy produktu po reakcji, przez analizę ekspresji genów, po możliwość dokładnej analizy sekwencji (Słomski, Szalata, Wielgus, 2008). Modyfikacje metody PCR, a także łączenie jej z innymi technikami badawczymi, na przykład z hybrydyzacją, poszerzyło możliwości diagnostyczne, pozwalając niejednokrotnie na kompleksowe badanie wybranych regionów chromosomów. Również w diagnostyce prenatalnej oraz w badaniach nad genetycznymi przyczynami niepowodzeń ciąży techniki molekularne zyskują coraz większe zainteresowanie. Możliwość automatyzacji metod, uzyskania wyniku w bardzo krótkim czasie oraz ich mniejsza czaso- i pracochłonność w porównaniu do klasycznych technik cytogenetycznych sprawia, iż coraz częściej są rutynowo wykorzystywane w laboratoriach diagnostycznych.

Ilościowa fluorescencyjna PCR (QF-PCR)

Metoda QF-PCR polega na amplifikacji specyficznych tandemowych sekwencji mikrosatelitarnych typu STR, usytuowanych w genomie w sposób rozproszony (Adinolfi, Sherlock, Pertl, 1995). Sekwencje mikrosatelitarne wykazują wysoki stopień polimorfizmu genetycznego, najczęściej występując w układzie heterozygotycznym. Sekwencje te wykorzystywane są jako markery do identyfikacji liczby kopii danej sekwencji.

W QF-PCR startery wyznakowane są fluorochromem a reakcja ma najczęściej charakter złożony. W jednej reakcji wykorzystuje się kilka par starterów z różnymi znacznikami fluorescencyjnymi. Jest to odmiana metody PCR multipleks z kombinacją różnych par starterów. Wynik badania opiera się na analizie otrzymanych fragmentów,

34

które muszą zostać rozdzielone na drodze elektroforezy kapilarnej. Tego typu elektroforeza przeprowadzana jest na sekwenatorze kapilarnym, w którym przetworzony sygnał fluorescencyjny, pochodzących z analizowanych produktów PCR, pozwala na rozmieszczenie fragmentów zgodnie z ich wielkością. Otrzymany po przetworzeniu komputerowym piktogram, dzięki kompatybilnym programom komputerowym pozwala na analizę produktów PCR. Dzięki temu możliwa jest ocena liczby alleli dla każdego markera, co odpowiada liczbie kopii danego chromosomu (Mann i wsp., 2004).

QF-PCR jest metodą stosowaną do tak zwanej „szybkiej diagnostyki” najczęstszych aberracji liczbowych (Mann i wsp., 2004). Pozwala zarówno na identyfikację niezrównoważonych aberracji typu aneuploidia i triploidia, ale także pozwala na wykrycie przypadków mozaikowości komórkowej, kontaminacji materiału komórkami matczynymi oraz odróżnienia izochromosomów od chromosomów powstałych w wyniku fuzji centrycznej. Czułość tej metody wynosi 83-100%, a specyficzność prawie 100% (Shaffer, Bui, 2007).

PCR w czasie rzeczywistym (Real-Time PCR)

W przeciwieństwie do konwencjonalnej techniki PCR, w której zasadnicze znaczenie ma jakość produktu, Real-Time PCR jest techniką oceniającą przyrost ilości produktu w tak zwanym czasie rzeczywistym. Dzięki takiej technice możliwe jest określenie ilości badanego DNA, czyli liczby kopii sekwencji, co pozwala na identyfikację różnego typu zmian, w tym o charakterze ploidii. W przeciwieństwie do innych technik bazujących na PCR, jest metodą bardzo czułą, specyficzną i powtarzalną (Dudarewicz i współ., 2005). PCR w czasie rzeczywistym jest wykorzystywana szczególnie w badaniach ekspresji genów, delecji/duplikacji genów w chorobach nowotworowych, badaniu metylacji, identyfikacji patogenów, a nawet skuteczności działania leków. Próby wykorzystania tej techniki podejmowano także w przypadku badań prenatalnych (Zimmermann i Dudarewicz, 2008).

Technika wymaga specjalnie skonstruowanego termocyklera, wyposażonego w urządzenie optyczne do wzbudzania fluorochromów oraz detektora pomiaru poziomu fluorescencji. W przeciwieństwie do tradycyjnej metody PCR, w tej metodzie monitorowana jest ilość amplifikowanego w każdym cyklu produktu, w taki sposób, żeby można było ocenić różnice ilościowe między próbka badaną a kontrolną

(Traeger-35

Synodinos, 2006). Monitorowanie ilości produktu można osiągną przy pomocą różnych systemów znakowania barwnikami fluorescencyjnymi lub interkalującymi, takimi jak na przykład bromek etydyny. W metodzie tej można również wykorzystywać różnego typy sondy, na przykład: TaqMan™, Molecular Beacons, Scorpions, czy HybProbes, co rozwiązuje problem detekcji niespecyficznych produktów amplifikacji (Lipiński, Zeyland, Słomski, 2008). Bez względu na zastosowaną metodę detekcji, po każdym cyklu reakcji zbierane są dane, które pozwalają na konstrukcje wykresu zależności wielkości sygnału od liczby cykli lub czasu (Lipiński, Zeyland, Słomski, 2008).

Metoda Real-Time PCR może być wykorzystywana w reakcjach typu multipleks, gdzie amplifikowanych może być do czterech rożnych sekwencji (Dudarewicz i wsp., 2005, Zimmermann i Dudarewicz, 2008). Zaletą tej metody jest także niskie prawdopodobieństwo kontaminacji próby, ze względu na zamknięty system reakcji. Reakcja nie wymaga stosowania dodatkowych systemów oceny produktów po amplifikacji, wysokoplimorficznych sekwencji, a przebieg całej reakcji jest obserwowany na bieżąco.

Metoda Real-Time PCR była wykorzystana do detekcji najczęstszych aneuploidii w badaniach prenatalnych, szczególnie trisomii 21 (Zimmermann, Dudarewicz, 2008). Próby jej wykorzystywania podejmowano także przypadku diagnostyki preimplantacyjnej chorób o charakterze jednogenowym, w genotypowaniu mutacji typu insercji lub delecji oraz mutacji punktowych (Traeger-Synodinos, 2006).

Multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)

MLPA – technika wprowadzona przez Schoutena w 2002 podobnie jak Real-Time PCR oraz QF-PCR należy do metod ilościowych, opierających się na detekcji liczby kopii określonej sekwencji DNA (Shouten i wsp., 2002). MLPA łączy metodę hybrydyzacji sekwencji DNA badanego z sondą molekularną oraz amplifikację starterów podczas reakcji PCR. Metoda obejmuje trzy etapy: denaturację sekwencji oraz sondy, co najmniej szesnastogodzinną hybrydyzację, ligację zhybrydyzowanych sond oraz PCR ze starterami znakowanymi fluorescencyjnie (Ryc. 1). Do każdej badanej sekwencji hybrydyzują dwie sondy o specyficznej budowie. Jedna sonda, z wolnym końcem 5’, składa się z sekwencji hybrydyzującej do określonego fragmentu DNA oraz z sekwencji komplementarnej do startera PCR, druga, z wolnym końcem 3’, posiada natomiast jeszcze sekwencję dodatkową, czyli tak zwaną wstawkę o różnej długości. Po

36

hybrydyzacji sondy ulegają ligacji, a wytworzony w ten sposób łańcuch DNA jest matrycą do reakcji PCR. Dzięki temu, że wszystkie sondy mają identyczne sekwencje na swoich końcach 5’ i 3’, reakcja PCR wymaga tylko jednej pary starterów, które jednocześnie ulegają amplifikacji. Podczas jednej analizy możemy równocześnie badać ponad czterdzieści różnych sekwencji. Wielkość produktów mieści się w przedziale pomiędzy około 130 a 480 nukleotydów (Shouten i wsp., 2002). Detekcja produktów oparta jest na pomiarze fluorescencji podczas rozdziału na sekwenatorze kapilarnym, pozwalając tym samym na ocenę ilościową produktów po amplifikacji. Ostateczna analiza wyniku odbywa się przy użyciu specjalnego oprogramowania, a następnie normalizacji uzyskanych wyników w programie typu Microsoft Excel.

Metoda MLPA znalazła szerokie zastosowanie w diagnostyce zmian typu delecja/duplikacja. Komercyjne zestawy do MLPA wykorzystywane są w diagnostyce prenatalnej i postnatalnej, w identyfikacji przyczyn niepełnosprawności intelektualnej oraz neurogenetyce, w diagnostyce aberracji chromosomowych, chorobach jednogenowych i wieloczynnikowych, chorobach nowotworowych, analizie metylacji, analizie mRNA, nawet farmakogenetyce. Istnieje możliwość także samodzielnego zaprojektowania sond dla badanej sekwencji.

W badaniach prenatalnych oraz w niepowodzeniach ciąży wykorzystuje się najczęściej komercyjne zestawy do identyfikacji najczęstszych aneuploidii: 13, 18, 21 oraz X, Y, a także zestaw do identyfikacji zmian w sekwencjach subtelomerowych (Diego-Alvarez i wsp., 2007, Kooper i wsp., 2009). Mimo wielu zalet, między innymi możliwości badania wielu próbek podczas jednego eksperymentu, niewielkiej ilości DNA (nawet 20 ng), dużej czułości i specyficzności (odpowiednio 100% i 98%), metoda wykrywa jedynie zmiany o charakterze niezrównoważonym, nie wykrywa natomiast poliploidii, mozaikowości oraz kontaminacji materiałem matczynym (Bocian, 2007).

37

38