Analiza strukturalna w oparciu o widma NMR (III)

Uzyskana przeze mnie struktura dupleksu z jedną wybrzuszoną resztą adenozyny opisana w poprzednim rozdziale pokazała, że niesparowana reszta chowa się do wnętrza helisy, nie zaburzając znacząco struktury dupleksu. Interesujące wydawało mi się sprawdzenie, jaki efekt wywoła zarówno na konformację regionu wybrzuszenia, jak i na strukturę całej cząsteczki wprowadzenie dodatkowej reszty adeniny. Sekwencja zasad badanego przeze mnie dupleksu

III, z trzema kolejnymi resztami adeniny umieszczonymi naprzeciw jednej reszty urydyny

pokazana jest na rysunku 51. Wszystkie widma NMR (1D ¹H oraz ³¹P, 2D NOESY, TOCSY, DQF-COSY a także ¹H-¹³C i ¹H-³¹P HSQC) wykonane zostały na spektrometrze Bruker 600 MHz. Przypisania sygnałów rezonansowych ¹H (Tabela 12), ¹³C i ³¹P (Tabela 13) otrzymałem drogą kompleksowego wykorzystania metod dwuwymiarowej homo- i heterojądrowej spektroskopii NMR (rozdział IV.2.1.1).

Rys. 51. Struktura drugorzędowa dupleksu III.

Informacji zarówno o wartościach przesunięć chemicznych sygnałów NMR poszczególnych protonów, jak i o konformacji cząsteczki dostarcza eksperyment 2D NOESY (D2O). Struktura sygnałów 1H NMR dupleksu III w widmie wykazuje cechy oddziaływań typowych dla prawoskrętnej formy A-RNA. Fragment widma obejmujący region występowania sygnałów aromatyczno-anomerycznych przedstawiony został na rysunku 52. Na podstawie analizy zarejestrowanych w tym regionie oddziaływań wyznaczyłem ścieżkę przekazywania magnetyzacji H6/H8(i)-H1'(i)-H6/H8(i+1). Z uwagi na nakładanie się sygnałów

U18:H5-H6 i C17:H1'-U18:H6 nie można jednak z całą pewnością stwierdzić, czy ścieżka

pomiędzy resztami C17 i U18 została zachowana. Dodatkowo, przy tych samych wartościach przesunięć chemicznych powinien znajdować się sygnał korelacyjny H6-H1' reszty C2. Sygnał ten udało mi się zidentyfikować w widmie 2D NOESY wykonanym w 20°C. Sygnał pochodzący od protonu H1' nieznacznie przesuwa się w kierunku niższych częstotliwości, dzięki czemu jednoznacznie mogłem stwierdzić obecność oddziaływania NOE pomiędzy protonem H6 i H1' dla reszty C2. Jest to informacja niezwykle istotna dla określenia

konformacji wokół wiązania glikozydowego. Wyznaczona nieprzerwana ścieżka NOE dla nici zawierającej niesparowane reszty adeniny wskazuje na zachowanie dosyć bliskiego kontaktu pomiędzy kolejnymi resztami -G4-A5-A6-A7-G8- w strukturze cząsteczki. Obserwowane w nici intra- i internukleotydowe korelacje protonów H2 adenozyn A5, A6 i A7 wykazują podobieństwo do tych rejestrowanych dla regularnych struktur helikalnych. Kontakty NOE protonu C19:H1' do protonów H2 każdej z tych reszt sugerują, że reszty adeniny zorientowane są w kierunku osi helisy. Obserwacja ścieżek H8(i)-H2'(i)-H8(i+1) oraz H8(i)-H3'(i)-H8(i+1) dodatkowo potwierdza ten fakt. Również w przypadku komplementarnej nici obecność sekwencyjnych kontaktów H2'(i)-H5/H6(i+1) oraz H3'(i)-H5/H6(i+1) pomiędzy resztami -C17-U18-C19-, jak i sygnałów korelacyjnych między protonami zasad heterocyklicznych, wyraźnie wskazuje na zachowanie silnych oddziaływań warstwowych dla tych reszt.

Rys. 52. Region sygnałów H2/H6/H8-H5/H1' w widmie 2D NOESY (m = 400 ms) dupleksu III w D2O (600 MHz, 25C). W widmie zaznaczona została sekwencyjna ścieżka H6/H8(i)-H1'(i)-H6/H8(i+1)

– kolorem zielonym dla górnej nici, natomiast niebieskim – dla dolnej nici. Przerywane linie wskazują położenie sygnałów H2 reszt adenozyny.

W oparciu o analizę widma 2D-NOESY wykonanego w 90% H2O/10% D2O (10°C) przypisałem również sygnały protonów wymienialnych. W widmie obserwowałem jedynie

osiem sygnałów pochodzących od protonów iminowych – siedem wąskich oraz jeden wyraźnie poszerzony w stosunku do pozostałych. Przypisania wąskich sygnałów dokonałem w oparciu o obserwowane kontakty NOE, analogicznie jak w poprzednich przypadkach (rozdział IV.2.1.1.2 i IV.2.2.1). Przesunięcie chemiczne poszerzonego sygnału ma wartość 12.94 ppm i odpowiada zaangażowanej w tworzenie pary Watsona-Cricka reszcie guanozyny (Rys. 53). Obserwowane w widmie bardzo słabe korelacje dla tego sygnału wskazują, iż pochodzi on najprawdopodobniej od terminalnej reszty G1. Na żadnym z widm wykonanych w 90% H2O/10% D2O nie zaobserwowałem natomiast sygnału protonu iminowego reszty

U18, dlatego niewiele można powiedzieć o ewentualnym zaangażowaniu tej reszty

w tworzenie wiązań wodorowych. Nieobecność tego sygnału może być spowodowana dużą dynamiką regionu albo szybką wymianą protonu U18:H3 z wodą.

Rys. 53. Fragment widma 1H NMR (600 MHz, 90% H2O/10% D2O) obejmujący zakres sygnałów protonów iminowych dupleksu III. Nad widmem zaznaczone zostały przypisania sygnałów rezonansowych.

O dynamicznym charakterze wybrzuszenia informują także obserwowane w widmie DQF-COSY pośrednie między formą C2'-endo i C3'-endo sprzężenia ³JH1'-H2' reszt A5 i A6 (~4 Hz). Również terminalna guanozyna G12 znajduje się w stanie równowagi konformacyjnej C2'-endo/C3'-endo, o czym świadczy wielkość stałej sprzężenia ³JH1'H2'

wynosząca 4.7 Hz. W widmie nie były natomiast obecne inne sygnały H1'-H2', co jednoznacznie wskazywało na konformację N pozostałych jednostek nukleotydowych. Trudno jest powiedzieć coś więcej o ewentualnych zaburzeniach konformacji szkieletu fosforocukrowego na podstawie analizy sprzężeń 3JH4'H5' i 3JH4'H5'', gdyż w odpowiadającym regionie widma DQF-COSY sygnały rezonansowe silnie się nakładały.

Kolejnych, niezbędnych do ustalenia struktury tego dupleksu informacji dotyczących konformacji szkieletu fosfodiestrowego dostarczyły widma 1H-³¹P HSQC. Ich analiza skłoniła mnie do wniosku, iż nie należy oczekiwać nietypowych konformacji bezpośrednio wokół grup fosforanowych, czego potwierdzeniem jest silne zgrupowanie linii rezonansowych

oczekiwanych dla regularnych struktur A-RNA. Niestety, nie udało się przypisać sygnału ³¹P NMR dla reszty G8 (Rys. 54). Z tego względu nie byłem w stanie oszacować wielkości sprzężeń 3J, a tym samym określić konformacji szkieletu fosforocukrowego pomiędzy resztami A7-G8.

Rys. 54. Widmo korelacyjne 1H-31P NMR dupleksu III w D2O (25C) z zaznaczonymi sygnałami H3'(n)-P(n). Na osi F1 zaznaczona została skala przesunięć chemicznych jąder 31P, a na osi F2 – 1H.

Porównanie wartości przesunięć chemicznych sygnałów dupleksu III (Tabele 12 i 13), zarówno do przesunięć chemicznych dupleksu I, jak i II wykazuje znaczne podobieństwo. Obserwowane różnice mają charakter lokalny, obejmujący jedynie sygnały należące do atomów z regionu pętli wewnętrznej, oraz ewentualnie nieliczne sygnały pochodzące od terminalnych zasad. W przypadku większości sygnałów 1H NMR wartości przesunięć chemicznych różnią się mniej niż 0.1 ppm, natomiast różnice przesunięć chemicznych sygnałów 13C nie przekraczają zazwyczaj 0.4 ppm, a sygnałów 31P – 0.2 ppm. W stosunku do dupleksu referencyjnego nieznacznie większe różnice zaobserwować można dla pojedynczych sygnałów reszt G4, G8 i C19. W przypadku reszty G4 największe zmiany dotyczą protonu H3, który w porównaniu do dupleksu referencyjnego jest słabiej ekranowany o 0.30 ppm, oraz silniej przesłanianego (o 0.26 ppm) protonu H2'. W przypadku reszty C19,

proton H1' ulega przesunięciu w kierunku niższych wartości przesunięć chemicznych o 0.21 ppm w stosunku do dupleksu referencyjnego, natomiast protony G8:H8 i C19:H5 są słabiej ekranowane o odpowiednio 0.31 ppm i 0.21 ppm.

Analiza porównawcza wartości przesunięć chemicznych obu dupleksów pokazuje, że zmiany przesunięć chemicznych wywołane wprowadzeniem dodatkowych jednostek nukleotydowych są niewielkie. Te małe różnice przesunięć chemicznych sygnałów rezonansowych wskazują niewątpliwie na duże podobieństwo strukturalne odpowiadających sobie fragmentów helikalnych obu dupleksów. Warto zwrócić uwagę na stosunkowo niewielkie, jednak większe niż w przypadku dupleksu II, różnice przesunięć chemicznych jąder 31P. Jest to prawdopodobnie wynikiem próby rozładowania naprężęń występujących w szkielecie fosforocukrowym, wywołanych akomodacją niesparowanych reszt do helikalnej struktury dupleksu.

Tabela 12. Wartości przesunięć chemicznych 1H (ppm) sygnałów dupleksu III [D2O, 25C].

Res. H6/H8 H2/H5 H1 H2 H3 H4 H5/H5 amino imino

G1 8.00 – 5.65 4.70 4.55 4.31 4.01/3.88 * / * 12.94 C2 7.88 5.30 5.60 4.61 4.62 4.47 * /4.19 6.78/8.45 – A3 7.99 7.00 5.94 4.65 4.69 4.52 4.56/4.18 * / * – G4 7.12 – 5.43 4.25 4.48 4.40 * /4.07 * / * 12.77 A5 7.99 7.71 6.03 4.44 4.73 4.50 * /4.13 * / * – A6 8.30 7.84 6.02 4.68 4.81 4.56 4.43/4.23 * / * – A7 8.10 7.79 5.93 4.69 4.70 4.59 4.46/4.23 * / * – G8 7.43 – 5.66 4.65 4.47 4.51 * /4.17 * / * 12.47 A9 7.80 7.51 5.98 4.68 4.66 4.54 * /4.17 * / * – G10 7.25 – 5.67 4.43 4.43 4.45 4.50/4.07 * / * 13.45 C11 7.45 5.18 5.50 4.34 4.39 4.43 4.50/4.05 6.75/8.37 – G12 7.61 – 5.85 4.09 4.28 4.22 4.43/4.04 * / * * C13 8.01 5.93 5.59 4.54 4.55 4.33 4.02/3.92 * / * – G14 7.87 – 5.80 4.63 4.70 4.52 4.53/4.18 * / * 13.16 C15 7.80 5.28 5.57 4.40 4.49 4.48 4.59/4.14 6.82/8.62 – U16 7.97 5.44 5.59 4.57 4.54 4.47 * /4.14 – 14.13 C17 7.84 5.68 5.61 4.47 4.41 * * /4.14 7.05/8.31 – U18 7.88 5.61 5.57 4.41 4.48 * * /4.14 – * C19 7.99 5.87 5.33 4.26 4.51 4.37 * /4.12 7.21/8.31 – U20 7.88 5.43 5.31 4.52 4.58 4.31 4.47/4.08 – 13.59 G21 7.68 – 5.77 4.36 4.58 4.43 4.48/4.09 * / * 12.59 C22 7.49 5.24 5.66 3.95 4.10 4.15 4.49/4.01 6.84/8.21 –

Tabela 13. Wartości przesunięć chemicznych  (ppm) sygnałów 13C oraz 31P NMR dupleksu III [D2O, 25C]. Res. C6/C8 C2/C5 C1 C2 C3 C4 C5 31P G1 138.71 – * * * 84.65 * – C2 141.73 97.14 * 75.47 * * * -4.27 A3 * 152.46 92.81 * 72.86 * * -3.95 G4 136.23 – 92.59 75.63 * * * -4.18 A5 * 153.85 91.07 76.49 * * * -4.53 A6 141.71 154.37 90.69 * 75.68 84.35 * -3.68 A7 140.80 154.03 91.79 * * 83.35 * -3.99 G8 136.84 – 92.66 * * * * * A9 139.66 153.39 92.79 * * * * -4.00 G10 135.65 – * 75.48 * * * -4.18 C11 140.09 97.57 93.77 75.51 * * * -4.39 G12 137.40 – 91.43 77.82 70.42 83.91 * -3.99 C13 142.97 98.78 * 75.50 * 84.48 62.20 – G14 ** – 92.68 75.32 72.98 * * -3.92 C15 141.43 97.14 93.85 75.47 * * * -4.50 U16 * 103.31 * 75.32 * * * -4.47 C17 141.74 97.66 * 75.58 * * * -4.44 U18 ** 103.87 93.93 75.32 * * * -4.36 C19 * 98.22 94.35 75.17 * * * -4.54 U20 141.73 103.31 93.40 75.19 * * * -4.57 G21 136.24 – 92.70 75.51 * * * -4.10 C22 141.25 97.44 * 77.44 69.53 83.21 65.19 -4.33

* Sygnały, które nie zostały przypisane.