Opis stosowanych w badaniach technik spektroskopii NMR

Widma NMR dupleksów RNA wykonane zostały na spektrometrze Bruker Avance 600 w Środowiskowym Laboratorium Unikalnej Aparatury Chemicznej Wydziału Chemii Uniwersytetu im. Adama Mickiewicza. Spektrometr ten posiada trzy kanały częstotliwości i wyposażony jest w aktywnie ekranowany magnes nadprzewodzący UltraShield^TM, wytwarzający stałe pole magnetyczne o indukcji 14.095 T. Wszystkie pomiary NMR wykonywane były na sondzie z odwrotnym układem cewek i Z-gradientem (TBI - inverse triple ¹H/{³¹P}/BB, ²H lock). Kontrolowane warunki pomiarowe uzyskiwano dzięki przystosowanemu do pomiarów dla biomolekuł układowi długoterminowej stabilizacji temperatury (BCU-5). Dodatkowo były wykonane widma na spektrometrze Bruker Avance II

400 w Instytucie Chemii Bioorganicznej PAN. Źródłem stabilnego, jednorodnego pola magnetycznego tego spektrometru jest ekranowany magnes nadprzewodzący (UltraShield Plus^TM) o indukcji pola magnetycznego 9.397 T. Do pomiarów NMR wykorzystano sondę z detekcją odwrotną (Inverse Broadband Probehead H-BB-D) wyposażoną w cewkę 1H oraz szerokopasmową (o zakresie częstotliwości 31P – 109Ag). System pozwalał na generowanie impulsów kształtowanych na obu kanałach częstości radiowej oraz posiadał generator gradientów w kierunku osi Z. Ponadto spektrometr wyposażony był w jednostkę kontroli temperatury oraz urządzenie BCU-5, umożliwiające prowadzenie długoterminowych pomiarów w zakresie od -5C do temperatury pokojowej. Układ ten pozwalał na stabilizację temperatury pomiaru z dokładnością do 0.5C. Otrzymane dane eksperymentalne przetwarzałem za pomocą programu Topspin 2.0 (Bruker), a następnie analizowałem w programie Felix 2002 (Accelrys).

Jednowymiarowe widma ¹H NMR (600 MHz, D2O) wykonane zostały w temperaturach 20, 25 i 30C. Szerokość spektralna widma (sw – ang. spectral width) wynosiła 5.4 kHz, czas akwizycji (at – ang. acquisition time) – 6 s, natomiast czas d1, potrzebny na relaksację układu (ang. relaxation delay) około 2 s. Resztkowy sygnał wody tłumiony był przyłożonym w tzw. czasie oczekiwania, pojedynczym impulsem o małej mocy (ang. presaturation). W celu poprawy stosunku sygnału do szumu, w każdym eksperymencie akumulowano średnio 64 przebiegi (ang. scans, transitions) składające się z 64K (1K = 1024) zespolonych punktów pomiarowych (ang. complex points). Podczas obróbki danych przeprowadziłem apodyzację sygnałów funkcją wykładniczą ze stałą poszerzenia linii (lb – ang. line

broadening) równą 0.3 Hz.

W przypadku widm 1D 1H NMR otrzymanych w D2O przy częstotliwości rezonansowej 400 MHz, szerokość spektralna wynosiła sw = 4 kHz, czas akwizycji at = 8.2 s, a czas oczekiwania d1 = 1 s. Pomiary przeprowadzono w temperaturach 25 oraz 30C, przy czym w każdym eksperymencie rejestrowano średnio 32 sygnały precesji swobodnej zawierające 64K zespolonych punktów pomiarowych.

Jednowymiarowe różnicowe widma 1H NMR NOE (600 MHz, 90% H2O/10% D2O) zostały zarejestrowane przy selektywnym naświetlaniu pojedynczą częstotliwością rezonansową w temperaturach 2 i 10C. Widma zebrane były przy szerokości spektralnej sw = 14 kHz, czasie akwizycji at = 0.5 s i czasie oczekiwania d1 = 2 s. Każdy sygnał swobodnej precesji (FID – ang. Free Induction Decay) był sumą 512 spójnych rejestracji i składał się z 16K zespolonych punktów pomiarowych. Przed transformacją Fouriera (FT,

ang. Fourier transformation) dokonałem apodyzacji sygnałów funkcją wykładniczą, dla której wartość parametru lb = 3 Hz.

Jednowymiarowe widma ¹H NMR (600 MHz, 90% H2O/10% D2O) wykonane zostały w temperaturze 10C z zastosowaniem sekwencji 3-9-19 WATERGATE¹⁷³ do wytłumienia sygnału wody. Eksperymenty wykonane były przy szerokości spektralnej sw = 13 kHz z czasem akwizycji at = 2.48 s oraz czasem oczekiwania d1 wynoszącym 2 s. Za każdym razem w trakcie pomiaru dokonano akumulacji 64 przebiegów czasowych, które zawierały 64K zespolonych punktów pomiarowych. Podobnie, jak w przypadku widm wykonanych w D2O, podczas obróbki danych przeprowadziłem apodyzację sygnałów precesji swobodnej funkcją wykładniczą.

Dwuwymiarowe, fazoczułe widma NOESY174 (600 MHz, D2O) wykonane były przy trzech różnych czasach mieszania m = 50, 150 i 400 ms. Czułość fazową w kierunku t1 otrzymano stosując metodę States-TPPI175. W eksperymencie zebranych zostało 2K zespolonych punktów pomiarowych w kierunku t2 oraz 512 inkrementów w kierunku t1, przy czym każdy składał się przeważnie z 96 spójnych rejestracji sygnałów precesji swobodnej. Widma wykonane były przy szerokości spektralnej sw = 5.4 kHz, z interwałem czasowym d1 = 1.5 s. Czas akwizycji wynosił 2 s. Podobnie jak w przypadku widm jednowymiarowych, do wygaszenia resztkowego sygnału HOD zastosowano metodę nasyceniową176,177

(ang. presaturation). Aby ułatwić przypisanie sygnałów rezonansowych, oraz wyciągnięcie informacji strukturalnych, pomiary efektu NOE zostały przeprowadzone w trzech różnych temperaturach: 20, 25 i 30C. Podczas przetwarzania danych w obu kierunkach zastosowano sinusoidalną funkcję ważącą przesuniętą w fazie o 30. W celu poprawy rozdzielczości widm dokonałem ekstrapolacji sygnału swobodnej precesji metodą liniowej predykcji178 (LP, ang. linear prediction). Korektę linii bazowej przetransformowanej macierzy przeprowadzono w kierunku F2 za pomocą funkcji wielomianowej.

Wykonane zostały także eksperymenty 2D NOESY w D2O przy częstotliwości 400 MHz. Widma zarejestrowane zostały z czasem mieszania 150 i 400 ms w temperaturze 25C. Szerokość spektralna wynosiła 3.4 kHz a czas akwizycji at = 0.4 s. Pozostałe parametry akwizycyjne, a także stosowane metody cyfrowej obróbki były takie same, jak w przypadku widm wykonanych na spektrometrze Bruker AVANCE 600.

Dwuwymiarowe, fazoczułe widma NOESY173,179 (600 MHz, 90% H2O/10% D2O) wykonane zostały w temperaturze 10C metodą TPPI180 z czasem mieszania m = 150 ms. W celu wygaszenia silnego sygnału wody, podczas eksperymentu stosowano sekwencję

(3-9-19) gradientowych impulsów w metodzie WATERGATE. W eksperymencie rejestrowanych było 512 sygnałów FID, z których każdy był sumą 128 spójnych przebiegów i zawierał 2K punktów zespolonych. Szerokość spektralna w obu kierunkach wynosiła 13.8 kHz, czas akwizycji 0.07 s, natomiast czas oczekiwania d1 = 2 s. W czasie obróbki danych, w obu kierunkach, dokonano apodyzacji sygnałów funkcją sinusoidalną przesuniętą w fazie o 60.

Dwuwymiarowe, fazoczułe widma DQF-COSY181 (600 MHz, D2O) o wysokiej rozdzielczości wykonane były z szerokopasmowym odsprzęganiem sekwencją GARP182 od częstotliwości 31P w temperaturach 25 oraz 30C. Czułość fazową w kierunku t1 uzyskano stosując metodę TPPI. Resztkowy sygnał wody tłumiono metodą nasyceniową podczas interwału czasowego d1 = 1.5 s. Dużą rozdzielczość widma uzyskano poprzez zawężenie zakresu szerokości spektralnej do przedziału występowania sygnałów rezonansowych protonów H1'/H5 oraz H2'/H3'/H4'/H5'/H5'' (szerokość spektralna, sw = 2.2 kHz). Czas akwizycji wynosił 1 s. W eksperymencie rejestrowanych było 4K zespolonych punktów pomiarowych w kierunku t2 dla 512 inkrementów w kierunku t1. Każdy sygnał był zazwyczaj sumą 48 spójnych rejestracji. Podczas obróbki cyfrowej stosowano potęgową, sinusoidalną funkcję ważącą w kierunku t1 i t2, natomiast ekstrapolacji sygnałów dokonano metodą LP. Po transformacji Fouriera przeprowadzono korekcję linii bazowej przez aproksymację funkcją wielomianową.

Analogiczne pomiary wykonane zostały na spektrometrze Bruker AVANCE II 400. W przypadku dwuwymiarowych, fazoczułych widm TOCSY183,184 (600 MHz, D2O) okres mieszania, podczas którego zastosowano sekwencję impulsów MLEV-17, trwał 60 ms. Widma zarejestrowane zostały przy szerokości spektralnej, która w obu kierunkach wynosiła około 6 kHz, z czasem akwizycji 0.2 s w kierunku t1 i interwale czasowym między kolejnymi repetycjami d1 = 2 s. Akumulowane z 32 przebiegów sygnały FID zawierały 2K zespolonych punktów pomiarowych. W każdym eksperymencie zebranych zostało 512 sygnałów w kierunku t1. W czasie obróbki danych w obu kierunkach t1 i t2 zastosowałem apodyzację funkcją sinusoidalną. Doświadczenia przeprowadzone zostały w temperaturze 25C.

Dwuwymiarowe eksperymenty korelacyjne ¹H-¹³C HSQC^185-187 (D2O) przeprowadzone zostały na próbkach o naturalnej zawartości izotopu 13C w temperaturze 25 i 30C metodą odwrotnej detekcji. Aby zniwelować wpływ sprzężeń proton-węgiel, podczas akwizycji danych na kanale ¹³C przykładano sekwencję impulsów GARP. Pomiary wykonane były przy częstotliwości rezonansowej, która wynosiła 600 MHz dla jąder 1H i 150.9 MHz dla jąder

13C. Doświadczenia wykonano dla dwóch zakresów przesunięć chemicznych. Widma dla pełnego zakresu zebrane zostały przy szerokości spektralnej sw = 19.6 kHz w kierunku t1 oraz przy sw = 3.6 kHz w kierunku t2. W drugim przypadku szerokość spektralna została zawężona (sw = 8.5 kHz w kierunku t1 i 3 kHz w kierunku t2) do zakresu występowania sygnałów korelacyjnych pomiędzy atomami węgla i związanymi kowalencyjnie protonami H1', H5 oraz H2', H3', H4', H5', H5''. Widma przetwarzałem stosując metodę LP i ważenie funkcją sinusoidalną.

Zarejestrowane zostały również widma korelacyjne 1H-13C HSQC (D2O) dla zawężonego zakresu przesunięć chemicznych na spektrometrze Bruker AVANCE 400. Temperatura pomiaru wynosiła 25C.

Jednowymiarowe widma ³¹P (D2O) zarejestrowane zostały przy częstotliwości rezonansowej 243 MHz na spektrometrze Bruker AVANCE 600. Badania przeprowadzono w zakresie temperatur od 10C do 35C, co 5C.

Dwuwymiarowe, fazoczułe widma korelacyjne ¹H-³¹P HSQC^188,189 (D2O) zostały wykonane na spektrometrze Bruker AVANCE 600 dla szerokości spektralnej sw = 2.4 kHz w kierunku ³¹P oraz 1.5 kHz w kierunku ¹H. Końcowe widma zawierały 256 sygnałów FID, akumulowanych na ogół z 96 przebiegów, przy czym każdy sygnał zawierał 2K punktów zespolonych. Przed transformacją Fouriera przeprowadzono apodyzację sinusoidalną funkcją kwadratową. Eksperymenty przeprowadzono w temperaturach: 20, 25 i 30C.

Kalibracja przesunięć chemicznych 1H, 13C NMR względem DSS oraz sygnałów 31P NMR względem TMP wykonana została w oparciu o zależność przesunięcia chemicznego sygnału wody od temperatury pomiaru, stężenia soli i pH próbki metodą opisaną w pracy Wisharta190.