Podsumowanie. Analiza kątów torsyjnych, parametrów pofałdowania

Wartości wszystkich kątów torsyjnych rodzin 10 struktur dupleksów I, II oraz dupleksu

III zestawione zostały za pomocą programu Nucheck²¹⁴ w postaci układających się koncentrycznie pierścieni przedstawionych na rysunku 63. Porównanie wykresów pozwala wychwycić pewne różnice strukturalne pomiędzy trzema badanymi cząsteczkami. Największe różnice obserwuje się dla kątów torsyjnych  i . W strukturach dupleksów II i III pojawiają się nietypowe dla formy A-RNA rotamery, które związane są z konformacjami nieobecnymi w strukturze odniesienia (I), przy czym w przypadku dupleksu III ich liczba jest największa. W strukturze cząsteczki III występują reszty nukleotydowe, w których pierścień cukrowy znajduje się w konformacji S (na co wskazują wartości kąta ). Wykresy te ukazują także większy rozrzut poszczególnych kątów torsyjnych w przypadku dupleksów II i III niż dla struktury I, choć dla dupleksu z pojedynczą niesparowaną resztą adenozyny różnice są

zdecydowanie mniejsze. Te obserwacje pokazują, iż wprowadzanie kolejnych niesparowanych reszt adenozyny powoduje większą różnorodność konformacyjną, co odzwierciedla również analiza wartości RMSD wyznaczonych dla ciężkich atomów niesparowanych reszt i par zasad bezpośrednio z nimi sąsiadujących. Dla dupleksu II wartość RMSD wynosi 0.69 ± 0.30 Å, przy wartości 0.31 ± 0.07 Å otrzymanej dla całej struktury I, natomiast dla dupleksu III jest jeszcze większa i wynosi 1.18 Å.

A) B)

C) D)

Kąt torsyjny ^Wartość _średnia Zakres  294 gauche^–  186 trans  49 gauche+  88 gauche+  202 trans  294 gauche^–  194 anti

Rys. 63. Porównanie wartości kątów torsyjnych struktur końcowych dupleksu I (A), II (B) i III (C). W tabeli (D) podano średnie wartości dla struktur A-RNA.

Przeprowadziłem szczegółową analizę porównując dla danych reszt otrzymane średnie wartości kątów torsyjnych ze wszystkich 10 struktur. Jak widać na rysunkach 64-68, wartości poszczególnych kątów dla cząsteczek I – III niewiele się różnią i w granicach błędu, odpowiadają wartościom typowym dla formy kanonicznej A-RNA. Wyjątek stanowią te wartości, które dotyczą niesparowanych reszt i par zasad z nimi sąsiadujących. W przypadku struktury z pojedynczym wybrzuszeniem (II) obserwowane zmiany mają jedynie charakter lokalny obejmujący resztę A5 i sąsiadującą z nią resztę adenozyny A6. Zmiany

konformacyjne wyrażone są, nieznacznie odbiegającymi od pozostałych, wartościami kątów  dla reszty A5 oraz kątów  i  dla reszty A6 (Rys. 64A i 65A). Powyższa analiza pokazuje, że wprowadzenie pojedynczej reszty adenozyny pomiędzy helikalne fragmenty dwuniciowe dupleksu II wywołuje jedynie niewielkie zaburzenie w stosunku do regularnej struktury dupleksu. Zdecydowanie większe zmiany konformacyjne zaobserwowałem po wprowadzeniu dwóch dodatkowych reszt adenozyny (III). Obecność dwóch niesparowanych reszt indukuje większą labilność konformacyjną nici, w której te reszty wprowadzono i dodatkowo wymusza zmiany w nici naprzeciwległej. Świadczy o tym większa niż w strukturze II liczba konformerów z nietypowymi wartościami kątów torsyjnych  oraz . Te nietypowe wartości kątów występują dla reszt A6, A7, G8 oraz dla reszty cytydyny C19, która znajduje się w drugiej nici (Rys. 64A i 65A). Dla reszty G4 w dupleksie III jedynie kąty  (268 ± 8°) odbiegają od typowych wartości (294°) (Rys. 66B). Również kąty  reszt A5 (260 ± 22°) i U18 (263 ± 21°) różnią się zarówno od tych obserwowanych dla dupleksów I i II, jak i od występujących w kanonicznej formie A-RNA. Jednak dla obu tych reszt obserwuje się większą zmienność kąta , co wynika zapewne z dynamicznego charakteru regionu. O dynamice regionu pętli świadczy także obecność konformerów, w których pierścień rybozy reszty A5 przyjmuje formę S, co wiąże się z dużą zmiennością parametru P i  (Rys. 68A i 65B). Takiej konformacji cukru nie obserwowałem natomiast w przypadku struktury II. Dynamika regionu pętli indukuje zmiany kątów  (Rys. 64B), na co wskazuje większe zróżnicowanie wartości tych kątów w przypadku reszt A6 (159 ± 22°), A7 (188 ± 19°) i C19 (160 ± 39°). Zauważyć można, że wprowadzenie dodatkowej reszty wywołuje nieznaczne zmiany kątów  reszt naprzeciwległej nici – średnio o 30° dla reszt C17 i U18 (Rys. 66A), oraz kątów  o około 17° w przypadku reszt C17, U18 i C19 (Rys. 67). Pozostałe kąty torsyjne niewiele się różnią i przyjmują charakterystyczne wartości dla kanonicznej formy A-RNA. Przeprowadzona analiza wskazuje, że wprowadzenie do sekwencji jednej, a nawet dwóch dodatkowych jednostek adenozynowych przyjmujących intrahelikalne konformacje, nie wywołuje globalnych zmian w strukturze dupleksu. Obserwowane zmiany obejmują wybrzuszone reszty oraz reszty z nimi sąsiadujące, a wielkość tych zmian zależy od liczby dodatkowych reszt.

A) B)

Rys. 64. Graficzna prezentacja średnich wartości kątów torsyjnych  (A) i  (B) wraz z naniesionymi odchyleniami standardowymi dla dupleksów I (linia niebieska), II (linia zielona) oraz III (linia czerwona). Na osi odciętych zachowana została numeracja reszt jak w dupleksie III.

A) B)

Rys. 65. Graficzna prezentacja średnich wartości kątów torsyjnych  (A) i  (B) wraz z naniesionymi odchyleniami standardowymi dla dupleksów I (linia niebieska), II (linia zielona) oraz III (linia czerwona). Na osi odciętych zachowana została numeracja reszt jak w dupleksie III.

A) B)

Rys. 66. Graficzna prezentacja średnich wartości kątów torsyjnych  (A) i  (B) wraz z naniesionymi odchyleniami standardowymi dla dupleksów I (linia niebieska), II (linia zielona) oraz III (linia czerwona). Na osi odciętych zachowana została numeracja reszt jak w dupleksie III.

Rys. 67. Graficzna prezentacja średnich wartości kąta glikozydowego  wraz z naniesionymi odchyleniami standardowymi dla dupleksów I (linia niebieska), II (linia zielona) oraz III (linia czerwona). Na osi odciętych zachowana została numeracja reszt jak w dupleksie III.

A) B)

Rys. 68. Graficzna prezentacja średnich wartości kąta fazowego pseudorotacji P (A) i amplitudy pofałdowania max (B) wraz z naniesionymi odchyleniami standardowymi dla dupleksów I (linia niebieska), II (linia zielona) oraz III (linia czerwona). Na osi odciętych zachowana została numeracja reszt jak w dupleksie III.

Porównałem również parametry helikalne dupleksów I, II, III, z których najważniejsze zamieściłem na rysunkach 69-72. Zauważyć można, że parametry wyznaczone zarówno dla dupleksu z pojedynczym wybrzuszeniem adenozynowym (dupleks II) jak i dla dupleksu, w którym trzy kolejne adenozyny jedej nici wraz z urydyną w nici naprzeciwległej tworzą pętlę wewnętrzną (III) są bardzo podobne do tych otrzymanych dla dupleksu referencyjnego (I). Wykazują one analogiczną zależność zmian wartości od położenia danej reszty w sekwencji łańcucha. Pomimo, że analiza kątów torsyjnych nie wykazała większych zmian strukturalnych w dupleksach II i III, jednakże szczegółowe porównanie parametrów helikalnych ukazuje pewne różnice pomiędzy analizowanymi strukturami. Akomodacja niesparowanej reszty adenozynowej A6 w dupleksie II powoduje obniżenie parametru  (Inclination) średnio o 4° dla wszystkich par zasad (Rys. 70A). Nachylenie par zasad względem głównej osi helisy w przypadku dupleksu III jest jeszcze mniejsze i wynosi

średnio 10 ± 4° (przy 19° ± 2 dla dupleksu referencyjnego), przy czym zależność ta bardziej się uwidacznia w przypadku analizy parametru  dla dwuniciowych fragmentów znajdujących się po stronie 5' niesparowanych reszt adenozyn. Ponadto w stosunku do dupleksu referencyjnego obserwowałem niewielkie, lecz systematyczne zredukowanie bezwzględnej wartości parametru x-Displacement (Rys. 69A), średnio o 0.3 Å (dla dupleksu

II) i aż o 0.6 Å dla struktury III. Jednak w tym przypadku znaczące zmiany dotyczyły tylko

fragmentów dwuniciowych z końców 5' dupleksów. Te dwa parametry ilustrują, w jaki sposób zaburzenie wywołane wprowadzeniem niesparowanych reszt propaguje się na całą strukturę dupleksu, minimalizując zaburzenia w strukturze.

Analiza pozostałych parametrów wskazuje na bardzo dobrą zbieżność między strukturą dupleksu referencyjnego a pozostałymi strukturami II i III.

A) B)

Rys. 69. Graficzna prezentacja średnich wartości parametrów x-Displacement, dx (A) i y-Displacement, dy (B) wraz z naniesionymi odchyleniami standardowymi dla dupleksów I (linia niebieska), II (linia zielona) i III (linia czerwona). Na osi odciętych zachowana została numeracja reszt jak w dupleksie referencyjnym.

A) B)

Rys. 70. Graficzna prezentacja średnich wartości parametrów Inclination,  (A) i Propeller twist,  (B) wraz z naniesionymi odchyleniami standardowymi dla dupleksów I (linia niebieska), II (linia zielona) i III (linia czerwona). Na osi odciętych zachowana została numeracja reszt jak w dupleksie referencyjnym.

A) B)

Rys. 71. Graficzna prezentacja średnich wartości parametrów Shift, Dx (A) i Rise, Dz (B) wraz z naniesionymi odchyleniami standardowymi dla dupleksów I (linia niebieska), II (linia zielona) i III (linia czerwona). Na osi odciętych zachowana została numeracja reszt jak w dupleksie referencyjnym.

A) B)

Rys. 72. Graficzna prezentacja średnich wartości parametrów Twist,  (A) i Roll,  (B) wraz z naniesionymi odchyleniami standardowymi dla dupleksów I (linia niebieska), II (linia zielona) i III (linia czerwona). Na osi odciętych zachowana została numeracja reszt jak w dupleksie referencyjnym.