Analiza termodynamiczna rodnikowej inhibicji reduktazy rybonukleotydowej przez TR, PC oraz hydroksymocznik

Deoksyrybonukleotydy są prekursorami syntezy DNA, a ich synteza z rybonukleoty-dów zachodzi z udziałem kompleksu enzymatycznego reduktazy rybonukleotydowej (RR) [199]. Enzym ten u wielu organizmów różni się budową, lecz szczegółowe badania wykazały, że wszystkie formy tego enzymu realizują podobny szlak enzymatyczny, a ich struktura trze-ciorzędowa wskazuje na to, że są one homologami. Badania strukturalne wykazały, że składa się ona z dwóch podjednostek dimerycznych R1 oraz R2 [199].

Rys. 4.14.1. Rodnik tyrozylowy

Na podstawie analizy szczegółowego mechanizmu działania RR możemy stwierdzić, że cykl katalityczny zaczyna się od transferu elektronu z reszty cysteinowej na rodnik tyrozylo-wy (Rys. 4.14.1.), w tyrozylo-wyniku czego powstaje w podjednostce R1 bardzo reaktywny rodnik cysteinotiolowy, charakteryzujący się obecnością niesparowanego elektronu na atomie siarki [199]. Jego wyjątkowo duża reaktywność wynika z braku możliwości stabilizacji rezonanso-wej. Rodnik ten następnie odrywa atom wodoru z węgla C3` rybozy – powstaje rodnik wę-glowy, który indukuje usunięcie anionu hydroksylowego z atomu wegla C2` rybozy. Mecha-nizm działania tego enzymu ujawnia, że rodnik tyrozylowy odgrywa rolę inicjatora cyklu ka-talitycznego. Zatem, jego zmiatanie przez antyoksydanty może prowadzić do efektywnej in-hibicji enzymu [216]. Wobec tego enzym ten stanowi cel działania czyników przeciwnowo-tworowych oraz leków, wytwarzanych w celu selektywnej inhibicji enzymu w chorej tkance nowotworowej. Badania ostatnich lat pokazały, że TR, PC, hydroksymocznik (forma amido-wa) (Rys. 4.14.2.) oraz p-hydroksyanizol, to bardzo aktywne inhibitory tego enzymu

[202,203], których aktywność inhibicyjna jest spowodowana zdolnością do zmiatania rodnika tyrozylowego.

Rys 4.14.2. Hydroksymocznik

W celu wykazania rodnikowego mechanizmu inhibicji RR przez TR, wykonano obli-czenia, stosując metodę DFT. Równowagowe geometrie wszystkich reagentów (TR,

hydrok-symocznik, rodnik tlenowy hydroksymocznika, rodnik tyrozylowy, tyrozynę, anion tyrozyny, anionorodnik tyrozyny, rodniki fenoksylowe TR, rodnik cysteinotiolowy, cysteina) wyzna-czonych za pomocą B3LYP/6-311++G(3df,2p). Zbadano termodynamikę reakcji przeniesie-nia atomu wodoru oraz elektronu z TR na rodnik tyrozylowy. Dla badanych reakcji, przed-stawionych na (Rys. 14.4.3.), obliczono zmianę entalpii swobodnej w celu zbadania ich samo-rzutności termodynamicznej. Analizowano także reakcje hydroksymocznika z rodnikiem ty-rozylowym, w celu porównania aktywności inhibicyjnej TR i hydroksymocznika. Bazując na fakcie, że hydroksymocznik może tworzyć kilka form tautomerycznych, zoptymalizowano ich geometrie i do rozważanych reakcji stosowano tylko formę najtrwalszą energetycznie. Ponie-waż w trakcie cyklu katalitycznego tworzy się reaktywny rodnik cysteinotiolowy, zbadano również reakcje TR oraz hydroksymocznika z tym rodnikiem. Zbadano również reakcje TR z anionorodnikiem tyrozynowym, gdyż w środowisku o pH zbliżonym do obojętnego, tyrozyna posiadająca punkt izoelektryczny równy pI = 5,64, występuje głównie w formie anionowej (zdeprotonowana grupa karboksylowa).

a

b

d

e

f

g

i j k + CH2 CH COOH H2N O CH₂ CH COOH H₂N O + NH C NH2 O OH NH C NH2 O O H l m + CH2 CH COOH H2N O + CH2 CH COOH H2N OH SH CH2 CH COOH H2N S CH₂ CH COOH H2N n

o

Rys. 4.14.3. Reakcje dla inhibicji rodnikowej reduktazy rybonukleotydowej: a) – h) reakcje z

udziałem TR, i) – m) reakcje z udziałem hydroksymocznika, n) reakcja rodnika tyrozynowego z cysteiną i o) reakcja rodnika hydroksymocznikowego z cysteiną

Równowagowa geometria rodnika tyrozylowego posiada wyraźną strukturę semichino-nową, która powoduje jego stabilizację. Analiza rozkładu gęstości spinowej w tym rodniku ujawniła, że największa gęstość spinowa jest zlokalizowana na atomie tlenu grupy hydroksy-lowej oraz atomach węgla pierścienia fenylowego. Spośród wszystkich optymalizowanych form tautomerycznych hydroksymocznika, najbardziej stabilna energetycznie jest forma ami-dowa.

Wszystkie badane reakcje, w których uczestniczy obojętna forma rodnika tyrozylowego są dozwolone termodynamicznie w badanych środowiskach (Tabela 4.14.1.), przy czym, w medium wodnym są zdecydowanie bardziej preferowane termodynamicznie niż w próżni. Zatem, w realnych układach biologicznych, gdzie dominuje środowisko wodne, inhibicja oparta na mechanizmie rodnikowym jest termodynamicznie dozwolona. Reakcja TR z anio-norodnikiem tyrozylowym w próżni nie jest preferowana termodynamicznie, podczas gdy w medium wodnym jest dozwolona. Najprawdopodobniej silne oddziaływanie medium polarne-go z ujemnie naładowanymi anionorodnikami powoduje zmniejszenie zmiany entalpii swo-bodnej reakcji. Reakcja grupy 4`-OH TR z rodnikiem tyrozylowym jest bardziej preferowana termodynamicznie niż ta, w której bierze udział grupa 3-OH. Jest to wynikiem większej stabi-lizacji rezonansowej 4`-O-rodnika niż 3-O-rodnika. Ponadto, reakcja hydroksymocznika w formie amidowej z rodnikiem tyrozylowym jest bardziej uprzywilejowana termodynamicznie, niż reakcja TR z tym rodnikiem. Stosunkowo mała wielkość cząsteczki hydroksymocznika i obecność w niej grupy hydroksyamidowej wydaje się być głównym czynnikiem, zmniejszają-cym wartość zmiany entalpii swobodnej reakcji hydroksymocznika z rodnikiem tyrozylo-wym.

W pracy [202] porównano szybkość zaniku rodnika tyrozylowego w obecności TR oraz hydroksymocznika. Badania kinetyczne pokazały, że w obecności TR szybkość zaniku jest zdecydowanie większa niż w przypadku hydroksymocznika. Należy podkreślić, że otrzymane wyniki obliczeń nie stoją w sprzeczności z wynikami otrzymanymi w niniejszej pracy, gdyż

pokazują aspekt temodynamiczny procesu inhibicji, a wyniki eksperymentalne – kinetyczny. W związku z tym problemem, konieczne będzie zbadanie kinetyki tych reakcji i wyznaczenie geometrii kompleksów aktywnych.

Reakcje TR z rodnikiem tyrozylowym oraz rodnikiem cysteinotiolowym charakteryzują się zbliżoną wartością zmiany entalpii swobodnej (Tabela 4.14.1.). Wyniki te sugerują, że TR może efektywnie zmiatać zarówno rodnik tyrozylowy, jak i cysteinotiolowy. Taka dwukie-runkowość może być przyczyną niezwykle dużego stopnia hamowania aktywności badanego enzymu przez TR. Wyniki pokazują, że TR może być potencjalnym chemoterapeutykiem, który efektywnie hamuje proces powstawania deoksyrybonukletydów w komórkach nowo-tworowych oraz wirusach zawierających DNA.

Analiza budowy rodników fenoksylowych TR oraz 4`-O-rodnika tyrozyny uwidacznia ich duże podobieństwo strukturalne. To z kolei sugeruje, że powstały rodnik TR może zastą-pić rodnik tyrozylowy w centrum aktywnym RR, co prowadziłoby do inhibicji kompetycyjnej enzymu. Na podstawie obliczonej wartości zmiany entalpii swobodnej reakcji 4`-O-rodnika TR z cysteiną wynika, że jest ona preferowana termodynamicznie w medium wodnym. Wy-nik ten sugeruje, że inhibicja reduktazy rybonukleotydowej może być kompetycyjna.

4.15. Zależność struktura – aktywność antyoksydacyjna TR w próżni, medium