Rysunek 4.22. Badanie oddziaływania 12-nt oligomerów z serii 2′-O-metylo z Dicer
Wynik rozdziału elektroforetycznego prób, w których znakowane radioizotopowo 12-mery z serii 2′-O-metylo (2OMeAL) inkubowano bez (K-) lub z Dicer (trójkątem oznaczono zmianę
stężenia Dicer: 250 nM, 300 nM, 450 nM). Wskazano pozycję prążków odpowiadających poszczególnym oligomerom oraz kompleksom 2OMeAL-210 z Dicer. Na podstawie [450].
IV-2-4-4. Badanie mechanizmu działania AL-210
Zgromadzone wyniki wykazały, że 2OMeAL-210 hamował powstawanie wszystkich testowanych miRNA z co najmniej 50% wydajnością. Wbrew wcześniejszym wynikom wskazującym, że Dicer nie tworzy kompleksów z tak krótkimi
cząsteczkami RNA jak 12-mery (Rys. 4.4.), analiza przeprowadzona w żelach PAA w warunkach natywnych wykazała, że 2OMeAL-210 jest wiązany przez Dicer (Rys.
4.22). Zastosowane podejście badawcze nie pozwalało jednak stwierdzić, w jakiej formie 2OMeAL-210 był wiązany przez Dicer.
Oddziaływanie 2OMeAL-210 z Dicer może, przynajmniej częściowo, tłumaczyć hamowanie przez ten 12-mer powstawania wszystkich czterech analizowanych miRNA, szczególnie w eksperymentach z pre-mir-16-1, pre-mir-21 i pre-mir-33a. Nie można jednak wykluczyć, że inhibicja cięcia wymienionych pre-miRNA wynika również,
podobnie jak w przypadku pre-mir-210, z oddziaływania tych prekursorów z 2OMeAL-210. W kolejnym etapie sprawdzono zatem, czy 2OMeAL-210 może
tworzyć dupleks nie tylko z pre-mir-210, wobec którego był projektowany, ale także z pozostałymi testowanymi pre-miRNA, czyli: pre-mir-16-1, pre-mir-21, pre-mir-33a.
Analizy in silico wykazały, że z uwagi na częściową komplementarność sekwencji, AL-210 może oddziaływać z ramieniem 3′ zarówno pre-mir-16-1, jak i pre-mir-21
Wyniki
103 hybrydyzacji tych cząsteczek, 2OMeAL-210 oraz odpowiedni pre-miRNA wyznakowany radioizotopowo na końcu 5′ inkubowano przez 15 min w 37°C w buforze zawierającym Mg2+, a następnie rozdzielano w żelach PAA w warunkach natywnych. Wyniki tych analiz wykazały, że 2OMeAL-210 może tworzyć stabilny dupleks jedynie z pre-mir-210 (Rys. 4.23.). Nie stwierdzono natomiast, by w zastosowanych warunkach reakcyjnych oligomer ten oddziaływał z którymkolwiek z pozostałych trzech testowanych pre-miRNA, tj.: pre-mir-16-1, pre-mir-21, pre-mir-33a (Rys. 4.23.).
W świetle zebranych wyników (Rys. 4.21.-4.23.) wydaje się, że prawdopodobny
mechanizm działania AL-210 w reakcjach z prekursorami: miR-16-1, miR-21 i miR-33a oparty jest na potencjale tego oligomeru do oddziaływania z Dicer, nie
wynika natomiast z bezpośredniego oddziaływania tego 12-meru z pre-miRNA. W tym kontekście pojawia się pytanie, w jakiej formie AL-210/2OMeAL-210 jest wiązany przez Dicer. Koncepcja hamowania dojrzewania miRNA przez oligomery odziałujące z rejonem apikalnym określonych pre-miRNA zakłada, że 12-mery występują w środowisku reakcyjnym w postaci jednoniciowej. Analiza bioinformatyczna wykazała, że testowane 12-mery, z uwagi na częściową samokomplementarnośc sekwencji, posiadają potencjał do tworzenia dimerów, przy czym najniższą energią swobodną charakteryzują się struktury przewidziane dla AL-33a i AL-210 (Załącznik 8.). Możnaby zatem założyć, że w wyższych stężeniach, wspomniane oligomery występują w formie dimerów i w takiej postaci AL-210 oddziałuje z Dicer.
Rysunek 4.23. Badanie oddziaływania 2OMeAL-210 z pre-mir-16-1, pre-mir-21, pre-mir-33a i pre-mir-210
Wynik testu EMSA dla 2OMeAL-210 i wskazanych pre-miRNA. Wyznakowane radioizotopowo pre-miRNA inkubowano w samym buforze reakcyjnym (-) lub z 100-krotnym molowym nadmiarem 2OMeAL-210 (+). Zaznaczono pozycję prążków odpowiadających wolnym prekursorom oraz kompleksom 12-meru z pre-mir-210.
Wyniki
104 Aby sprawdzić, czy w warunkach reakcyjnych stosowanych podczas oceny potencjału inhibitorowego 12-mery występują w formie jedno- czy dwuniciowej, oligomery z serii 2′-O-metylo-RNA inubowano w 37°C w buforze reakcyjnym dla Dicer, a następnie poddano rozdziałowi elektroforetycznemu w natywynych żelach PAA. Dla każdego oligomeru przeprowadzono serię reakcji, w których ilość znakowanego RNA była stała (10 000 cpm), natomiast zmieniało się stężenie RNA niewyznakowango (0,01 µM, 1 µM, 10 µM). Uzyskane wyniki pozwoliły stwierdzić, że 2OMeAL-16-1_2 i 2OMeAl-21 w zastosowanych warunkach siły jonowej oraz temperatury pozostają w formie jednoniciowej (Rys.4.24.). W przypadku 2OMeAL-33a zaobserwowano, że wraz ze wzrostem stężenia RNA dochodzi najprawdopodobniej do dimeryzacji oligomeru – na radiogramie widoczne jest stopniowe zanikanie prążka odpowiadającego formie jednoniciowej RNA oraz pojawienie się prążka migrującego wolniej, mogącego odpowiadać dimerom. Dla 2OMeAL-210 na radiogramie stwierdzono obecność prążka ulokowanego znacznie wyżej niż należałoby się spodziewać w sytuacji, gdy dochodzi do dimeryzacji 12-meru (Rys. 4.24., prążki oznaczone (*)). Pozycja tego prążka pozwala sądzić, że może on odpowiadać strukturom wyższego rzędu tworzonym przez 2OMeAL-210.
Rysunek 4.24. Wizualizacja 12-nt oligomerów z serii 2′-O-metylo w poddanych elektroforezie w żelach poliakryloamidowach w warunkach natywnych
Rozdzielane mieszaniny zawierały wskazany oligomer wyznakowany radioizotopowo na końcu 5′ oraz jego nieznakowaną formę w stężeniu: 0,01 µM, 0,1 µM, 1 µM, 10 µM (oznaczone trójkątem). Wskazano pozycję prążków odpowiadających formie jednoniciowej (ssRNA) i dwuniciowej (dsRNA) oligomerów oraz strukturze wyższego rzędu tworzonej przez 2OMeAL-210 (*).
Wyniki
105 Biorąc pod uwagę uzyskane wyniki, zadano pytanie o to, co wyróżnia AL-210 spośród pozostałych badanych 12-merów. Analiza sekwencji nukleotydowych poszczególnych AL wykazała, że AL-210 cechuje się wysoką zawartością guaniny, która stanowi aż 58% zasad azotowych wchodzących w skład tego oligomeru (7/12 reszt azotowych, Rys. 4.25.). Dla porównania w cząsteczce AL-33a guanina stanowi ~33% zasad azotowych (4/12), natomiast w cząsteczkach AL-16-1_2 i AL-21 jedynie ~17% (2/12). Co więcej, reszty guanozynowe nie są rozmieszczone równomiernie w sekwencji AL-210 – ponad połowa z nich znajduje się na końcu 5′ oligomeru, tworząc ciąg czterech guanozyn (GGGGCAGCCAG).
Rysunek 4.25. Wykresy obrazujące udział poszczególnych zasad azotowych w strukturze wskazanych 12-merów.
Powyższe cechy budowy AL-210 stanowiły przesłankę, by przypuszczać, że oligomer ten może przyjmować strukturę G-kwadrupleksu. W celu weryfikacji tej hipotezy wykorzystano barwnik – N-metylomezoporfirynę IX (NMM), tj. anionową pochodną porfiryny selektywnie oddziałującą z G-kwadrupleksami o topologii równoległej [457], charakteryzującej prawie wszystkie G-kwadrupleksy RNA [458]. Analizie poddano cztery 12-mery z serii RNA (AL-16-1_2, AL-21, AL-33a, AL-210) oraz 2OMe-AL-210. Kontrolę pozytywną stanowił oligomer QU14 – 14-nt cząsteczka
RNA, która, zgodnie z danymi literaturowymi, tworzy stabilny G-kwadrupleks o topologii równoległej [459]. 400 pmol każdego z oligomerów inkubowano w buforze
reakcyjnym dla Dicer, mieszaninę dzielono na pół i poddawano elektroforezie w osobnych ścieżkach w natywnym żelu PAA. Po zakończonej elektroforezie żel
dzielono na dwie części; jedną z nich barwiono w roztworze SybrGold w celu wizualizacji całkowitego RNA, podczas, gdy drugą, zawierającą takie same próby,
inkubowano w roztworze NMM w celu wizualizacji prążków odpowiadających 3 4 1 4 AL-33a 2 7 3 AL-210 A G U C 4 2 3 3 AL-16-1_2 5 2 3 1 AL-21
Wyniki
106 G-kwadrupleksom. Na Rys. 4.26. przedstawiono wyniki analizy przeprowadzonej dla wyżej wymienionych oligomerów. Na zdjęciu żelu barwionego NMM widoczne są prążki odpowiadające G-kwadrupleksom jedynie w ścieżkach, w których rozdzielano AL-210 i 2OMeAL-210 oraz kwadrupleks referencyjny – QU14.
Rysunek 4.26. Wizualizacja kwasów nukleinowych za pomocą barwnika specyficznego wobec G-kwadrupleksów
Wskazane oligomery inkubowano 15 min w 37°C w buforze zawierającym Na+ i Mg2+, a następnie poddawano elektroforezie w warunkach natywnych. W celu uwidocznienia kwasów
nukleinowych, żele barwiono w roztworze SybrGold (całkowity RNA) lub N-metylomezoprofiryny IX (NMM, barwnik specyficzny wobec kwadrupleksów o topologii
równoległej).
IV-2-5. Badanie wpływu oligomerów RNA zawierających sekwencje bodate w ciągi