IV-1. Charaterystyka preparatu ludzkiej rekombinowanej rybonukleazy Dicer otrzymywanej w systemie bakulowirusowym
Do produkcji ludzkiej rekombinowanej Dicer wykorzystano system ekspresji białek heterogenicznych w liniach komórek owadzich Sf9. Otrzymywaną w ten sposób rybonukleazę oczyszczano metodą chromatografii powinowactwa, wykorzystując znacznik histydynowy na końcu aminowym Dicer, a następnie metodą chromatografii jonowymiennej. Aktywność rybonukleazową Dicer oceniano w standardowych
reakcjach hydrolizy wybranych ludzkich pre-miRNA: pre-mir-16-1, pre-mir-21, pre-mir-33a i pre-mir-210; RNA znakowany radioizotopowo na końcu 5′ inkubowano z testowanym preparatem przez 30 min w temperaturze 37°C w buforze zawierającym
jony Mg2+. Następnie mieszaniny reakcyjne poddawano rozdziałowi elektroforetycznemu w denaturujących żelach PAA. Na podstawie analizy autoradiogramów określano ilość miRNA powstałego w poszczególnych próbach. Uzyskane dane pozwoliły wyznaczyć stężenie Dicer (~150 nM), w którym wydajność
Wyniki
73 hydrolizy pre-miRNA jest najwyższa (Rys. 4.1.). Ponadto, zgodnie ze schematem zaprezentowanym na Rys. 4.2., porównano aktywność katalityczną testowanego białka i enzymu dostępnego komercyjnie. Uzyskane wyniki potwierdziły jednakowy wzór cięcia pre-miRNA generowany przez oba preparaty Dicer.
Rysunek 4.1. Określenie wydajności hydrolizy pre-miRNA przez preparat Dicer otrzymany w systemie bakulowirusowym
Wynik analizy reakcji cięcia pre-mir-21 przez Dicer. Wyznakowany radioizotopowo pre-mir-21 inkubowano w samym buforze reakcyjnym (K-) lub z dodatkiem Dicer (w kolejnych reakcjach stężenie enzymu zmieniało się od 20 do 650 nM). Wykres przedstawia zależność wydajności powstawania miRNA (oznaczona jako stopień przereagowania substratu) od stężenia Dicer. Słupki błędów odpowiadają odchyleniu standardowemu wyznaczonemu na podstawie trzech powtórzeń technicznych. Na podstawie [449].
Zdolność Dicer do wiązania RNA badano, wykorzystując test EMSA. Wybrany pre-miRNA (pre-mir-21) wyznakowany radioizotopowo na końcu 5′ inkubowano z Dicer w warunkach inhibujących aktywność katalityczną enzymu, ale pozwalających na tworzenie się kompleksów rybonukleoproteinowych (4°C) [257], a następnie poddawano rozdziałowi elektroforetycznemu w żelach PAA w warunkach natywnych (Rys. 4.3.). Uzyskane wyniki pozwoliły na wyznaczenie stałej dysocjacji (Kd) kompleksu pre-mir-21• Dicer, która wynosi 80±5.6 nM i jest porównywalna do wartości Kd kompleksów pre-miRNA• Dicer opisywanych w innych pracach [258, 302]. Ze względu na brak danych na temat oddziaływan Dicer z ssRNA o długości innej od typowych substratów (~60-70 nt) lub produktów (~21-24 nt) enzymu, stosując test EMSA zweryfikowano zdolność uzyskanego preparatu do wiązania szeregu ssRNA:
Wyniki
74
RNA12, RNA14, RNA22, RNA32, RNA42, RNA52, RNA62, o długości wskazanej w nazwie, tj. od 12 nt do 62 nt (Rys. 4.4.). Na podstawie uzyskanych wyników
stwierdzono, że Dicer nie tworzy wydajnie kompleksów z oligomerami krótszymi niż ~20nt. W przypadku ssRNA ≥ ~20 nt zaobserwowano pozytywną korelację pomiędzy długością oligomeru a wydajnością wiązania przez Dicer i trwałością tworzonych kompleksów rybonukleoproteinowych.
Rysunek 4.2. Porównanie aktywności rybonukleazowej preparatów rekombinowanej Dicer wykorzystanych w badaniach
Wynik analizy mieszanin reakcyjnych, w których wskazane pre-miRNA (znakowane
radioizotopowo) były trawione przez preparat otrzymany w systemie bakulowirusowym (150 nM Dicer) lub preparat komercyjny (1U Dicer*). Reakcje kontrolne prowadzono
w obecności 5 mM EDTA lub bez dodatku enzymu. Wskazano pozycję prążków odpowiadających pre-miRNA i miRNA. Na podstawie [449].
Wyniki
75
Rysunek 4.3. Określenie wydajności wiązania pre-miRNA przez preparat Dicer otrzymany w systemie bakulowirusowym
Wynik testu EMSA z udziałem pre-mir-21 i Dicer. Wyznakowany radioizotopowo pre-mir-21 inkubowano w samym buforze reakcyjnym (K-) lub z dodatkiem Dicer (stężenie enzymu
zmieniało się od 20 do 650 nM) . Wykres przedstawia zależność pomiędzy stężeniem Dicer a ilością pre-miRNA z nią związanego. Przerywaną linią zaznaczono stężenie enzymu, przy
którym 50% RNA pozostaje w kompleksie z Dicer (Kd). Słupki błędów odpowiadają odchyleniu standardowemu wyznaczonemu w oparciu o wyniki trzech powtórzeń eksperymentu. Na podstawie [449].
Rysunek 4.4. Badanie wpływu długości ssRNA na wydajność jego wiązania przez preparat Dicer otrzymany w systemie bakulowirusowym
Wynik testu EMSA z udziałem Dicer i szeregu ssRNA o długości od 12 do 62 nt. Wyznakowany radioizotopowo oligomer o wskazanej długości inkubowano w samym buforze
reakcyjnym (-) lub z dodatkiem Dicer (500 nM), (+). Mieszaniny reakcyjne rozdzielano w żelach PAA w warunkach natywnych. Na radiogramie wskazano pozycję prążków
odpowiadających niezwiązanemu RNA oraz RNA w kompleksie z Dicer. Na podstawie [449].
Reakcje trawienia pre-miRNA przez Dicer stanowiły układ modelowy, w którym testowany był potencjał inhibitorowy wybranych oligomerów (Załącznik 3.).
Wyniki
76 komercyjnie. Po uzyskaniu bardziej homogennego preparatu Dicer w systemie
bakulowirusowym wszystkie uzyskane uprzednio wyniki zostały zweryfikowane. W tym celu przeprowadzono serię eksperymentów, w których każdorazowo
przygotowywano trzy mieszaniny reakcyjne zawierające odpowiedni preparat Dicer, pre-miRNA znakowany radioizotopowo na końcu 5′ oraz wybrany oligomer w stężeniu zapewniającym stosunek pre-miRNA:oligomer odpowiednio: 1:1, 1:10 lub 1:100. Dodakowo przygotowywano dwie mieszaniny, w których prowadzono reakcje
kontrolne: kontrolę negatywną (K-), pozwalającą na monitorowanie integralności pre-miRNA w trakcie inkubacji w samym buforze reacyjnym oraz kontrolę pozytywną
(K+), na podstawie której szacowano ilość miRNA powstającego w reakcji z Dicer, bez testowanego oligomeru. Próby inkubowano w 37°C przez 30 min, a następnie poddawano rozdziałowi w denaturujących żelach PAA. Na podstawie uzyskanych autoradiogramów szacowano ilości miRNA powstającego w reakcjach z danym oligomerem i porównywano je do ilości miRNA powstających w reakcji kontrolnej (K+). Na Rys. 4.5. przedstawiono przykładowe wyniki badań przeprowadzonych dla
preparatu bakulowirusowego (Dicer) oraz komercyjnej Dicer (Dicer*) z udziałem pre-mir-16-1 i oligomeru Y. Wyniki otrzymane dla obu enzymów są spójne, tzn.
oligomer Y w reakcjach z preparatem otrzymanym w systemie bakulowirusowym hamował cięcie pre-mir-16-1 z podobną wydajnością, jak w reakcjach z komercyjną Dicer. Na podstawie zgromadzonych danych stwierdzono, że w doświadczeniach, w których badana jest aktywność rybonukleazowa Dicer, oba preparaty rekombinowanego białka, tj. komercyjny oraz uzyskany w systemie owadzim, mogą być stosowane zamiennie.
Wyniki
77
Rysunek 4.5. Porównanie potencjału inhibitorowego oligomeru Y w reakcjach z preparatami rekombinowanej Dicer wykorzystywanymi w badaniach
Wynik analizy mieszanin reakcyjnych, w których pre-mir-16-1 był trawiony przez preparat otrzymany w systemie bakulowirusowym (Dicer) lub preparat komercyjny (Dicer*) w obecności oligomeru Y. Trójkątami oznaczono zmianę stężenia oligomeru Y (0,1 µM, 1 µM, 10 µM). (K-) reakcja kontrolna bez dodatku enzymu i oligomeru Y, (K+) reakcja ze wskazanym
preparatem rybonukleazy, bez oligomeru Y. Wykresy przedstwiają wydajność tworzenia miR-16-1 w reakcjach z oligomerem Y znormalizowane względem K+ (100%). Słupki błędów
odpowiadają odchyleniu standarowemu obliczonemu na podstawie wyników uzyskanych w trzech niezależnych powtórzeniach eksperymentu.