Rysunek 4.5. Porównanie potencjału inhibitorowego oligomeru Y w reakcjach z preparatami rekombinowanej Dicer wykorzystywanymi w badaniach
Wynik analizy mieszanin reakcyjnych, w których pre-mir-16-1 był trawiony przez preparat otrzymany w systemie bakulowirusowym (Dicer) lub preparat komercyjny (Dicer*) w obecności oligomeru Y. Trójkątami oznaczono zmianę stężenia oligomeru Y (0,1 µM, 1 µM, 10 µM). (K-) reakcja kontrolna bez dodatku enzymu i oligomeru Y, (K+) reakcja ze wskazanym
preparatem rybonukleazy, bez oligomeru Y. Wykresy przedstwiają wydajność tworzenia miR-16-1 w reakcjach z oligomerem Y znormalizowane względem K+ (100%). Słupki błędów
odpowiadają odchyleniu standarowemu obliczonemu na podstawie wyników uzyskanych w trzech niezależnych powtórzeniach eksperymentu.
IV-2. Badanie mechanizmów inhibicji Dicer przez oligomery RNA
IV-2-1. Badanie mechanizmu inhibicji powstawania miR-210 w reakcjach z ATD_13.6
ATD_13.6 (56 nt), choć silnie wiązany przez Dicer (Kd = 600 nM), pozostaje niecięty przez ten enzym [436]. Co więcej, badania potencjału inhibitorowego tego aptameru wykazały, że w reakcjach z Dicer ATD_13.6 wydajnie hamował powstawanie miR-210, natomiast w niewielkim stopniu wpływał na wydajność tworzenia innych badanych miRNA [436]. By lepiej zrozumieć naturę oddziaływań pomiędzy ATD_13.6 i Dicer oraz wyjaśnić zaobserwowaną selektywność działania aptameru zbadano wpływ pre-mir-210 na wiązanie ATD_13.6 do enzymu. W tym celu do mieszaniny reakcyjnej zawierającej Dicer (Genlantis) oraz ATD_13.6 znakowany radioizotopowo na końcu 5′
Wyniki
78 dodawano pre-mir-210, a następnie próby inkubowano przez 1 h w 4°C. Bufor reakcyjny nie zawierał jonów Mg2+,przez co enzym mógł oddziaływać z RNA, jednak jego aktywność rybonukleazowa była zahamowana. Następnie mieszaniny reakcyjne nakładano na membranę nitrocelulozową i filtrowano pod ciśnieniem. Ze względu na właściwości fizyko-chemiczne membrany białka oraz cząsteczki z nimi związane ulegały zatrzymaniu na jej powierzchni, podczas gdy była ona przepuszczalna dla wolnych kwasów nukleinowych. Ilość ATD_13.6 związanego przez Dicer szacowano na podstawie intensywności sygału pochodzącego od 32P znajdującego się na końcu 5′
oligomeru. Na podstawie otrzymanych wyników stwierdzono, że zwiększenie ilości pre-miRNA w mieszaninie reakcyjnej powodowało wydajniejsze wiązanie ATD_13.6 z Dicer (Rys. 4.6.).
Rysunek 4.6. Badanie wpływu pre-mir-210 na wiązanie ATD_13.6 przez Dicer
Wykres obrazujący korelację pomiędzy stężniem pre-mir-210 a wydajnością wiązania ATD_13.6 przez Dicer. Na rysunku umieszczono radiogram błony nitrocelulozowej wiążącej kompleksy Dicer i wyznakowanego radioizotopowo ATD_13.6; trójkątem oznaczono zmianę stężenia pre-mir-210.
Powyższa obserwacja zrodziła przypuszczenie, że ATD_13.6 może oddziaływać nie tylko z Dicer, ale także z pre-mir-210, tworząc trójskładnikowy kompleks. By sprawdzić, czy obie cząsteczki RNA mogą ze sobą odziaływać, przeprowadzono test
EMSA, w którym wyznakowany radioizotopowo ATD_13.6 inkubowano z pre-mir-210 w stosunku molowym 1:100, a następnie mieszaninę reakcyjną
rozdzielono w żelu PAA w warunkach natywnych. Otrzymane wyniki jednoznacznie potwierdziły tworzenie się dupleksu ATD_13.6 • pre-mir-210 (Rys. 4.7. A).
Wyniki
79 Dodatkowo, analiza bioinformatyczna wykazała, że pomiędzy ATD_13.6 i pre-mir-210 istnieje komplementarność sekwencji pozwalająca na stabilne wiązanie się obu cząsteczek (Rys. 4.7. B). Przewidywana struktura drugorzędowa tego dupleksu jest znacznie trwalsza pod względem termodynamicznym niż struktury zaproponowane dla ATD_13.6 i pre-mir-210 osobno. W celu weryfikacji uzyskanych modeli struktury drugorzędowej kompleksu ATD_13.6 • pre-mir-210 przeprowadzono mapowanie enzymatyczne struktury drugorzędowej pre-mir-210 oraz jego dupleksu z ATD_13.6. W badaniach wykorzystano RNAzę T1, endorybonukleazę specyficzną wobec ssRNA, która hydrolizuje wiązanie fosfodiestrowe po stronie 3′ G. Wyniki rozdziału elektroforetycznego produktów trawienia enzymatycznego RNA potwierdziły prawdziwość, przewidzianych in silico, modeli struktury drugorzędowej pre-mir-210 oraz jego dupleksu z ATD_13.6 (Rys. 4.7. B-C).
Wyniki
80
Rysunek 4.7. Badanie oddziaływania pomiędzy ATD_13.6 i pre-mir-210
A – Wynik testu EMSA z udziałem ATD_13.6 i pre-mir-210. Wyznakowany radioizotopowo
ATD_13.6 poddano denaturacji termicznej oraz powolnej renaturacji i inkubowano w samym buforze reakcyjnym (-) lub z dodatkiem pre-mir-210 (+). Wskazano pozycję prążków odpowiadających ATD_13.6 oraz dupleksowi ATD_13.6 • pre-mir-210. Na podstawie [450];
B –Struktury o najniższej energii swobodnej (ΔG0) przewidziane dla ATD_13.6, pre-mir-210 i dupleksu obu cząsteczek. Na niebiesko zaznaczono rejon pre-mir-210, którego rearanżacja po związaniu ATD_13.6 została potwierdzona w mapowaniu enzymatycznym. Autoradiogram przedstawia wynik rozdziału elektroforetycznego produktów trawienia przez RNazę T1 znakowanego radioizotopowo pre-mir-210, inubowanego bez (-) lub z ATD_13.6 (+). Wskazanym na zdjęciu prążkom przypisano odpowiadające im miejsca hydrolizy w obrębie pre-miRNA (G7-G48). Trójkąt symbolizuje zmianę stężenia ATD_13.6 (1 µM, 10 µM).
Wyniki
81 Aby zweryfikować tezę, że za wykazane wcześniej selektywne hamowanie powstawania mir-210 w reakcjach z ATD_13.6 odpowiada oddziaływanie tego aptameru z pre-mir-210, wykonano serię dodatkowych eksperymentów z udziałem trzech innych prekursorów, tj.: pre-mir-16-1, pre-mir-21 i pre-mir-33a. Potencjalne oddziaływanie pomiędzy cząsteczkami RNA badano analogicznie jak poprzednio, tj.:
ATD_13.6 wyznakowany radioizotopowo na końcu 5′ inkubowano z odpowiednim pre-miRNA, a następnie mieszaniny reakcyjne poddawano rozdziałowi
elektroforetycznemu w żelach PAA w warunkach natywnych. Dla każdego pre-miRNA przygotowano trzy mieszaniny reakcyjne, w których stosunek molowy pre-miRNA do ATD_13.6 wynosił odpowiednio: 1:1, 1:10, 1:100. Na podstawie uzyskanych wyników stwierdzono, że ATD_13.6 oddziaływał jedynie z pre-mir-210. Nie zaobserwowano tworzenia się dupleksów ATD_13.6 z pre-mir-16-1, pre-mir-21 i pre-mir-33a, nawet przy najwyższym zastosowanym stężeniu prekursora (10 µM), (Rys. 4.8.). Otrzymane wyniki potwierdziły selektywność oddziaływania ATD_13.6 i pre-mir-210 wynikającą z komplementarności ich sekwencji.
Rysunek 4.8. Badanie selektywności oddziaływania ATD_13.6 z pre-mir-210
Wynik testu EMSA z udziałem ATD_13.6 i wybranych ludzkich pre-miRNA. Wyznakowany radioizotopowo ATD_13.6 poddano denaturacji termicznej oraz powolnej renaturacji w samym buforze reakcyjnym (K-) lub ze wskazanym prekursorem. Trójkątami oznaczono zmianę stężenia pre-miRNA (0,1-10 µM). Wskazano pozycję prążków odpowiadających ATD_13.6 oraz dupleksowi ATD_13.6 • pre-mir-210. Na podstawie [450].
W kolejnym etapie określono wpływ poszczególnych pre-miRNA na stabilność
kompleksu ATD_13.6 • Dicer. Do badań wykorzystano cztery pre-miRNA
(pre-mir-16-1, pre-mir-21, pre-mir-33a, pre-mir-210), które były obecne w mieszaninach reakcyjnych w stężeniach 1-30 µM. W pierwszej fazie reakcji,
Wyniki
82 (preparat otrzymany w systemie baulowirusowym) w 4°C, pozwalając na utworzenie się
kompleksu ATD_13.6 • Dicer. Następnie do mieszaniny dodawano pre-miRNA w stężeniu zapewniającym stosunek molowy ATD_13.6 do pre-miRNA, odpowiednio,
1:10, 1:100 lub 1:300, po czym prowadzono dalszą inkubację, po zakończeniu której następował rozdział prób w żelu PAA w warunkach natywnych. W przypadku inhibicji kompetycyjnej, tj., gdy dochodzi do współzawodnictwa substratu i inhibitora o miejsce
aktywne enzymu, należałoby spodziewać się wypierania inhibitora (ATD_13.6) z kompleksu z Dicer, szczególnie w warunkach, w których do mieszaniny reakcyjnej
dodawany jest nadmiar substratu (pre-miRNA). Natomiast w przypadku inhibicji allosterycznej, gdy obniżenie aktywności katalitycznej enzymu wynika ze zmiany konformacji białka spowodowanej przyłączeniem się inhibitora do innego miejsca niż miejsce aktywne, podanie pre-miRNA nie powinno powodować dysocjacji kompleksu ATD_13.6 • Dicer. Zaobserwowano, że w przypadku trzech spośród testowanych prekursorów, tj.: pre-mir-16-1, pre-mir-21 i pre-mir-33a wzrostowi stężenia pre-miRNA towarzyszył wzrost ilości ATD_13.6 niezwiązanego z Dicer (Rys. 4.9.). Innymi słowy, pre-miRNA powodowały wyparcie aptameru z kompleksu z Dicer. Efekt ten był najlepiej widoczny dla pre-mir-16-1, który indukował dysocjację kompleksu ATD_13.6 • Dicer już w najniższym zastosowanym stężeniu – 1 µM (stosunek molowy
ATD_13.6 do pre-mir-16-1 wynosił 1:10). W przeciwieństwie do wymienionych pre-miRNA, w próbach z pre-mir-210 na radiogramach obserwowano zanik prążka
odpowiadającego kompleksowi ATD_13.6 • Dicer i pojawienie się migrującego wolniej prążka odpowiadającego najprawdopodobniej trójskładnikowemu kompleksowi ATD_13.6 • pre-mir-210 • Dicer.
Uzyskane dane pozwaliły zaproponować dwa mechanizmy, według których ATD_13.6 może hamować proces powstawania miRNA. Pierwszy z nich zakłada współzawodniczenie ATD_13.6 i pre-miRNA o wiązanie z Dicer. Drugi z nich wymaga bezpośredniego oddziaływania ATD_13.6 z komplementarnym pre-miRNA. Hybrydyzacja ATD_13.6 do pre-miRNA idukuje zmiany struktury prekursora uniemożliwiające jego cięcie przez Dicer. Ilustracją tego mechanizmu jest przypadek pre-mir-210; ATD_13.6 tworzy z pre-mir-210 dupleks, który jest wiązany, ale niecięty przez Dicer, najprawdopodobniej ze względu na strukturę końców dsRNA.
Wyniki
83
Rysunek 4.9. Badanie wpływu pre-miRNA na trwałość kompleksów ATD_13.6 • Dicer
Wynik testu EMSA z udziałem ATD_13.6, wybranych ludzkich pre-miRNA i Dicer. Kompleksy wyznakowanego radioizotopowo ATD_13.6 i Dicer inkubowano ze wskazanym pre-miRNA. Trójkątami oznaczono zmianę stężenia pre-miRNA (1, 10, 30 µM). (K-) ATD_13.6 inkubowany w buforze bez dodatku białka i pre-miRNA, (K+) ATD_13.6 inkubowany z białkiem, bez dodatku pre-miRNA. Wskazano pozycję prążków odpowiadających ATD_13.6 oraz jego kompleksom z pre-mir-210 i/lub Dicer. Na podstawie [450].