Badanie mutagenności i rakotwórczości zanieczyszczeń środowiska

We wszystkich elementach środowiska znajduje się wiele czynników naturalnych i pochodzenia antropogenicznego, które charakteryzują się potencjalnym działaniem mutagennym i rakotwórczym, zaburzającym normalny rozwój komórek organizmów i ich potomstwa. Wykazano, że podstawowym mechanizmem tych zjawisk jest – oprócz zaburzeń regulacji hormonalnej u organizmów tkankowych – upośledzenie genetycznej transkrypcji. Uszkodzenia cząsteczek DNA skutkują nieprawidłowym wzrostem komórek somatycznych, a następnie neoplazją. Termin „mutacja” odnosi się do takich zmian ilościowych lub strukturalnych w materiale genetycznym, spowo-dowanych przez czynniki chemiczne lub fizyczne, które są względnie trwałe i dzie-dziczne.

W zależności od rodzaju uszkodzenia materiału genetycznego wyróżnia się trzy podstawowe typy mutacji:

z mutacje genowe, zachodzące w obrębie jednego genu, polegające na zmianie sekwencji nukleotydów na skutek wstawienia (insercji), wypadnięcia (delecji) jednego lub kilku nukleotydów oraz zamiany w obrębie nukleotydów zawierających zasady purynowe (tranzycja) lub pomiędzy nukleotydami purynowymi i pirymidynowymi (transwersja),

2. Metody stosowane w biologicznej kontroli jakości środowiska 39

z mutacje chromosomowe, dotyczące zmiany struktury chromosomu (klastroge-nezy) w rezultacie pęknięcia, utraty (delecji), lub przemieszczenia (translokacji) frag-mentu chromosomu, podwojenia (duplikacji) lub odwrócenia (inwersji),

z mutacje genomowe, powstające w wyniku zaburzenia procesu mitozy, prowa-dzące do zmiany liczby chromosomów (aneuploidia) lub zwielokrotnienia kariotypu (poliploidia).

Określenia „mutagenny” i „mutagen” stosuje się w odniesieniu do czynników powodujących zwiększone występowanie mutacji w populacjach komórek i/lub orga-nizmów.

Oddziaływanie różnych związków chemicznych na DNA nie ma charakteru jedno-rodnego. Część związków, które wchodzą w interakcję z DNA, powoduje indukcję pierwotnych jego uszkodzeń i zmiany te są nieodwracalne. Określa się je mianem inicjatorów. Inne związki wpływają na ekspresję i progresję istniejących już zmian w cząsteczkach DNA – są to induktory. Część związków pochodzenia zewnątrz- i we-wnątrzkomórkowego nie działa mutagennie, gdyż nie wchodzi bezpośrednio w reakcje z kwasem nukleinowym, a jedynie inicjuje komórki do proliferacji – są to promotory. Związki chemiczne, które są odpowiedzialne za działanie inicjujące i promocyjne, określa się natomiast mianem kompletnych kancerogenów. Wiele związków rako-twórczych wykazuje aktywność biologiczną, dopiero gdy zostaną przekształcone w rezultacie przemian metabolicznych do metabolitów, które wchodzą w interakcję z DNA. Związki tego typu nazywa się kancerogenami warunkowymi (prokanceroge-nami). W procesie przekształceń większości tych związków uczestniczą oksydazy mi-krosomalne, których największa aktywność występuje w wątrobie. Ponieważ u bakte-rii i większości hodowli komórek ssaków aktywność oksydaz o złożonym działaniu albo nie jest obserwowana, albo jest bardzo mała, w testach na tych modelach sto-sowany jest ekstrakt tkanek ssaków (wątroby) – post-mitochondrialny supernatant określany jako frakcja S-9.

Czynniki, które powodują szkodliwe efekty przez oddziaływanie z materiałem ge-netycznym i zmieniają strukturę, zawartość informacyjną lub ułożenie elementów DNA oraz powodują uszkodzenie DNA, zaburzając normalny proces replikacji, lub które w niefizjologiczny sposób (tymczasowo) zakłócają replikację, są zwane czynni-kami genotoksycznymi. Efekty genotoksyczności można zaobserwować jedynie w żywych komórkach, a więc tylko wtedy, gdy w wyniku działania związku chemicz-nego lub mieszaniny związków komórka nie zostanie uszkodzona w rezultacie poja-wienia się efektu cytotoksycznego. Zmienione genetycznie komórki somatyczne za-czynają proliferować, co w rezultacie prowadzi do rozwoju nowotworu.

Całkowicie odmienne skutki powodują mutacje komórek rozrodczych, których efektem jest nie tylko zmienność o podłożu genetycznym, lecz ciężkie schorzenia genetyczne bądź efekt letalny. Skutkiem mutacji komórek rozrodczych po zapłodnie-niu jest potomstwo obarczone defektem genetycznym lub całkowite uniemożliwienie rozwoju zarodka.

Uniwersalność (jednorodność) materiału genetycznego wszystkich organizmów umożliwia zastosowanie różnych modeli badawczych: bakterii, grzybów, roślin, owa-dów, zwierząt oraz linii komórkowych. Wyniki testów oceniających genotoksyczność są z reguły traktowane jako wskaźniki mutagenności i wykorzystywane do prognozy rakotwórczości. Potrzeba opracowywania szybszych, tańszych i bardziej czułych te-stów oceny mutagenności jest coraz większa.

W celu identyfikacji substancji mutagennych i genotoksycznych opracowano wie-le testów i procedur przesiewowych (skriningowych). Genotoksyczne właściwości substancji chemicznej można badać, obserwując różnorodne genetyczne efekty koń-cowe zarówno in vitro jak i in vivo. Uważa się, że za indukcję somatycznych (włączając kancerogenezę) oraz dziedzicznych defektów są odpowiedzialne mutacje genowe albo aberracje chromosomowe. Uszkodzenia spowodowane przez substancję che-miczną mogą być specyficzne lub preferencyjne dla jakiegoś mierzalnego efektu koń-cowego. Związki mutagenne mogą indukować więcej niż jedną zmianę w materiale genetycznym. Ocena potencjalnej genotoksyczności powinna zatem opierać się na zestawie testów obejmujących obserwację zmian na poziomie genowym i chromo-somowym. Z tego względu uważa się, że jest niezbędny rozwój strategii badań, która obejmuje testy zarówno na mutacje genowe, jak i na aberracje chromosomowe.

Do oceny rakotwórczości chemicznych i fizycznych czynników środowiska obok badań laboratoryjnych wykorzystuje się również analizę epidemiologiczną. Dzięki niej można porównać ilość zachorowań i umieralność na nowotwory złośliwe w populacji ludzi żyjących w podobnych warunkach, ale odmiennie reagujących na czynniki wpływające na rozwój choroby nowotworowej. Podjęcie badań epidemiologicznych jest związane z problemami natury metodycznej. Jest to proces długotrwały, ponie-waż okres latencji nowotworów (czas od początku narażenia do pojawienia się guza) może wynosić aż 20 do 30 lat. Trudnością jest także dobór odpowiednio licznej grupy kontrolnej, w której czynniki zakłócające (np. palenie papierosów, różnice w diecie żywieniowej) powinny być minimalne.

Wyniki badań epidemiologicznych powinny być uzupełnione krótkoterminowymi testami na mutagenność i genotoksyczność, a następnie długoterminowymi testami na zwierzętach doświadczalnych (Sadowska i in., 2000).

z Testy cytogenetyczne. Celem testów cytogenetycznych jest wykrywanie

anoma-lii chromosomowych, wiele czynników powoduje bowiem powstawanie uszkodzeń struktury chromosomów. W badaniach takich znajdują zastosowanie różne rodzaje komórek. Najczęściej są to komórki zdolne do proliferacji w układzie in vivo lub ko-mórki zdolne do namnażania się i dzielenia poza organizmem (szpik kostny, koko-mórki nabłonka, komórki płciowe, limfocyty krwi obwodowej itp.).

z Badanie rakotwórczości. Badania rakotwórczości związków chemicznych

2. Metody stosowane w biologicznej kontroli jakości środowiska 41

bada się przeżywalność gryzoni (myszy, szczurów, chomików syryjskich) eksponowa-nych na substancje chemiczne. Ilość badaeksponowa-nych substancji podawaeksponowa-nych zwierzętom podczas tych badań utrzymuje się na poziomie mniejszym lub równym maksymalnej dawce, która nie zmniejsza przeżywalności (z wyjątkiem spowodowanej rozwojem nowotworu) ani nie powoduje powstania klinicznych symptomów zatrucia, określanej jako maksymalna tolerowana dawka (MTD). Stosowanie dawek MTD lub większych umożliwia zwiększenie prawdopodobieństwa indukcji nowotworu w czasie przezna-czonym na badania.

Do wad badań tego rodzaju należą:

z ograniczenia statystyczne, wynikające z niewystarczającej zwykle liczebności ba-danych zwierząt,

z trudności w ocenie podatności ludzi na pewne typy nowotworów na podstawie rezultatów badań na zwierzętach,

z niepewność dotycząca ekstrapolacji wyników dla małych dawek.

Wiadomo, że substancje chemiczne znane ze zdolności do inicjacji nowotworu, powodują również mutację u bakterii i innych krótko żyjących organizmów doświad-czalnych. Ponieważ wszystkie organizmy mają taką samą strukturę DNA, testy takie mogą być podstawą przewidywania rakotwórczości. Jednak dość dobre korelacje między mutagennością a rakotwórczością stwierdzono tylko dla inicjatorów i samo-istnych kancerogenów, nie wykazano natomiast korelacji dla substancji o działaniu promotorów.

Badania rakotwórczości nie znajdują bezpośredniego zastosowania w ocenie ja-kości środowiska. Jednak rezultaty wielu z nich, mimo braku danych epidemiologicz-nych, stały się podstawą do umieszczenia wielu związków, zwłaszcza mikrozanie-czyszczeń wody, na listach parametrów obligatoryjnie kontrolowanych w wodzie przeznaczonej do spożycia przez ludzi.