Biomarkery ekspozycji

Biomarkery ekspozycji umożliwiają stwierdzenie obecności określonych czynni-ków chemicznych oraz ocenę wchłonięcia tych czynniczynni-ków przez poszczególne osoby albo populacje. Mogą one dostarczać informacji o zależności między dawką ze-wnętrzną a wchłoniętą ilością substancji toksycznej. Badania polegają na pomiarze stężenia w tkance lub płynach ustrojowych substancji będącej przedmiotem rozwa-żań, albo metabolitów lub produktów reakcji ze składnikami komórek. Najczęściej

9. Biomonitoring elementów środowiska naturalnego 167

oznaczane są we krwi, moczu, ślinie, ale także w powietrzu wydychanym. Biomarkery ekspozycji można podzielić na markery dawki wewnętrznej i markery dawki biolo-gicznie skutecznej. Te pierwsze są wskaźnikiem występowania i zakresu ekspozycji organizmu, drugie zaś informują o rozmiarze ekspozycji docelowej struktury komór-kowej.

Termin dawka wewnętrzna określa ilość substancji, która wnika do organizmu w wyniku pobierania pokarmu, inhalacji, wchłaniania przez skórę itp. Biomarkery dawki wewnętrznej wskazują przez pomiar stężenia substancji lub jej metabolitów w płynach ustrojowych, że nastąpiła ekspozycja na określoną substancję chemiczną. Mimo że ekspozycja organizmów na działanie jakiejś substancji może być oszacowana w rezultacie monitoringu chemicznego, występują gatunkowe i osobnicze różnice we wchłanianiu, dystrybucji i wydalaniu. Aby zatem określić rzeczywistą ekspozycję, istotny jest pomiar faktycznej ilości substancji lub jej metabolitów w tkance lub płynie ustrojowym. Obecnie są już dostępne precyzyjne techniki pomiaru stężeń substancji i ich metabolitów w małych stężeniach.

Najprostszymi biomarkerami ekspozycji są pomiary stężenia substancji, na którą badany osobnik był eksponowany. Przykładem jest pomiar stężenia ołowiu we krwi albo we włosach. Badania takie wykonuje się rutynowo u przedstawicieli populacji ssaków, w tym ludzi, narażonych na kontakt z danym związkiem chemicznym. Można w ten sposób badać również stan zanieczyszczenia środowiska na jakimś obszarze, pobierając od zwierząt zamieszkujących ten teren próbki na przykład sierści i analizu-jąc je pod względem stężenia wybranych metali ciężkich lub związków organicznych.

U bezkręgowców uszkodzenie elementów komórkowych jest dobrym wskaźni-kiem narażenia na metale ciężkie i pestycydy (Weeks i Svendsen, 1996). W tym celu prowadzi się obserwacje retencji czerwieni obojętnej przez celomocyty dżdżownic (Booth i O′Halloran, 2001; Svendsen i in., 2007; Asenio, 2007).

Tabela 35. Przykłady biomarkerów dawki wewnętrznej (Mielżyńska, 2000)

Substancja rakotwórcza Substancja oznaczana

Akrylonitryl ^{akrylonitryl w moczu} izotiocyjanina w moczu

Benzen

fenol w moczu benzen we krwi

benzen we wydychanym powietrzu Mieszaniny WWA 1-hydroksypiren w moczu

Różne związki

tioetery w moczu

kwas glukuronowy w moczu efekt mutagenny w moczu

Pomiary dawki wewnętrznej związku rakotwórczego oparte na badaniu stężenia w tkankach są prawidłowe tylko wtedy, gdy dany związek nie ulega transformacjom enzymatycznym. Niekiedy stosuje się tę metodę, jeżeli narażenie jest na bardzo małe i powstają niewielkie ilości metabolitów. Gdy natomiast prokancerogen wymaga me-tabolicznej aktywacji, należy badać stężenie jego metabolitów. Trzeba również pa-miętać, że procesy enzymatyczne prowadzące do detoksykacji i wydalania mogą ła-godzić lub odwracać efekt narażenia na czynniki rakotwórcze (Mielżyńska, 2000). W tabeli 35 przedstawiono kilka przykładów biomarkerów dawki wewnętrznej. Nie-które z nich są specyficzne, tzn. określają narażenie na konkretny związek. U ludzi biomarkerami niespecyficznymi, czyli wskaźnikami narażenia na związki rakotwórcze o zróżnicowanej strukturze chemicznej mogą być np. stężenie tioeteru i kwasu gluku-ronowego w moczu, które zwiększa się po narażeniu na związki szkodliwe. Innym niespecyficznym biomarkerem narażenia populacji na szkodliwe związki chemiczne obecne w środowisku jest badanie właściwości mutagennych wydalin ludzi (głównie moczu). Metoda ta służy również do wykazania, że wchłonięte substancje są akty-wowane do związków mutagennych, czyli potencjalnie rakotwórczych.

Wiele uwagi poświęcono metabolitom otrzymanym z połączeń glutationu jako potencjalnym markerom ekspozycji. Glutation bierze udział w detoksykacji substancji reaktywnych (Van Welie i in., 1992). Wynikiem tego połączenia jest wydalanie róż-nych metabolitów zawierających siarkę. Może to być dowodem aktywacji metabo-licznej zachodzącej w organizmie. Pomiar stężenia specyficznych metabolitów, takich jak niektóre kwasy merkaptanowe – końcowe produkty połączeń glutationu, jest lepszym biomarkerem dawki wewnętrznej, ale wymaga wiadomości na temat struk-tury badanej substancji i często wyrafinowanych technik analitycznych.

Terminem dawka biologicznie skuteczna określa się tę ilość wchłoniętego kseno-biotyku, która faktycznie reaguje z takimi składnikami komórki, jak białka albo kwasy nukleinowe. Biomarkery dawki efektywnej wskazują, że ekspozycja na określoną sub-stancję zaowocowała osiągnięciem przez tę subsub-stancję lub jej metabolity toksykolo-gicznie znaczącego celu. Ponieważ może wystąpić wiele różnych indywidualnych róż-nic w szybkości i drogach metabolizmu substancji chemicznych, więc pomiar dawki efektywnej w miejscu docelowym jest przedkładany nad pomiarem dawki wewnętrz-nej. Często jest to osiągane przez pomiar specyficznych adduktów w tkankach lub płynach ustrojowych. Substancje, które są reaktywne lub metabolizowane do reak-tywnych produktów pośrednich, które reagują z DNA, są przedmiotem szczególnego zainteresowania z powodu genotoksyczności i możliwej rakotwórczości. Addukty takie pojawiają się bezpośrednio po ekspozycji. Uszkodzenia DNA spowodowane przez powstanie adduktu mają charakter przedmutacyjny i przeważnie są rozpoznane oraz naprawione przez systemy reperacyjne. Jeżeli jednak addukty nie są usunięte z DNA, to mogą zapoczątkować powstanie mutacji. Dlatego addukty białek i DNA we krwi są często używanymi biomarkerami ekspozycji na reaktywne czynniki alkilujące, takie jak styren. Miernikiem dawki docierającej do docelowych tkanek (np. wątroby)

9. Biomonitoring elementów środowiska naturalnego 169

lub komórek (np. hepatocytów) może być też oznaczenie liczby wiązań kowalencyj-nych aktywnej postaci czynnika toksycznego. Pomiar całkowitej liczby adduktów jest wskaźnikiem dawki, która dotarła do docelowych organelli (mitochondria, chloropla-sty) lub makrocząsteczek (DNA, białka). Liczba specyficznych adduktów DNA (charak-terystycznych dla danego typu związku genotoksycznego) może być natomiast wskaźnikiem dawki biologicznie skutecznej, która inicjuje proces nowotworowy (In-dulski, 1995).

Techniki immunochemiczne również mogą być bardzo specyficzne i czułe. Przy-datne jest wykrywanie adduktów w albuminach z surowicy krwi. Są one syntetyzo-wane w wątrobie, gdzie wiele związków rakotwórczych ulega przemianie w aktywne metabolity. Charakteryzują się długim okresem półtrwania, dlatego służą jako bio-markery opóźnionej ekspozycji. Również addukty DNA ze względu na stosunkowo dużą trwałość cząstki hemoglobiny i jej nośnika, czyli krwinek czerwonych (około 120 dni) oraz brak systemów naprawczych są wykorzystywane w monitorowaniu narażonych populacji, głównie jako biomarker narażenia skumulowanego. Większość adduktów DNA, hemoglobiny i albumin stanowi selektywne biomarkery dawki efektywnej.

Istnieją również nieselektywne biomarkery wskazujące, że reakcja przebiegła, ale nie informują o strukturze adduktu. Dotyczy to między innymi testu „32P post-labelling”, który jest nieselektywnym biomarkerem dla adduktów DNA. Technika ta wykrywa 1 addukt na 109–1010 zasad. Test jest stosowany zarówno w badaniach na ssakach (włączając człowieka), jak i na innych zwierzętach, takich jak ryby. Technika jest inwazyjna, gdyż wymaga preparatu DNA z tkanki (np. białych ciałek krwi), ale nie trzeba opracowywać specyficznych testów dla znanych adduktów, można ich używać jako markerów, co stanowi jej zaletę. Na podstawie obecności adduktów można oce-niać skutki narażenia w populacji ludzkiej, gdy ekspozycja w warunkach środowisko-wych jest mniejsza niż w badaniach eksperymentalnych, ponadto mogą służyć do wykrywania ekspozycji na różne potencjalne substancje toksyczne, z których kilka może tworzyć addukty z DNA.