5. Badanie toksyczności gleby
5.3. Pedofauna w badaniach ekotoksykologicznych
Organizmy glebowe odgrywają kluczową rolę w ekosystemach lądowych. Z tego powodu w badaniach ekotoksykologicznych gleby wykorzystuje się przede wszystkim zwierzęta bezkręgowe, takie jak nicienie (np. Caneorhabditis elegant), skąposzczety (np. Eisenia fetida, Enchytraens albinus, E. cypricus), skoczogonki (np. Folsomia can-dida) czy roztocza (np. Hypoaspis aculeifer) (Jänisch i in., 2005; Sochova i in., 2007), oraz ślimaki lądowe Helicidae. Interesujące są również wyniki badań wpływu zanie-czyszczeń na koniki polne (Chorthippus brunneus) (Augustyniak i in., 2005, 2005, 2007; Sawczyn i Augustyniak, 2008; Sawczyn i in., 2009).
5. Badanie toksyczności gleby 89
Wyniki testów zależą w znacznym stopniu od parametrów ekologicznych gleby, takich jak pH, wilgotność, temperatura, jej cechy (tekstura, zdolność zatrzymywania wody, zawartość substancji organicznej) i pożywienia. Mimo że gatunki testowe mo-gą być stosowane do badań wielu rodzajów gleb, do warunków ekstremalnych (np. bardzo kwaśne gleby leśne) powinny być dobierane gatunki alternatywne. Podobnie do badania gleb pochodzących z różnych stref klimatycznych należy dobrać natywne gatunki, np. skąposzczety i stawonogy (tabela 13).
Tabela 13. Zestawienie gatunków organizmów zwierzęcych stosowanych w badaniach toksyczności gleby
Gatunek Badany parametr Metody standardowe Literatura
Dżdżownica Eisenia foetida przeżycie OECD 207 EPA 600/3-88-029 ISO 11268-1:1993 AFNOR X31-251 ASTM, E1676-97 PN-ISO 11268:1997 OECD, 1984a EPA, 1989 ISO, 1993 AFNOR, 1994 ASTM, 1997b 1997 reprodukcja PN-ISO 11268:2001 OECD 222 ISO 11268-2 2001a OECD, 2004d ISO 1998
bioakumulacja ASTM, E1676-97 ASTM, 1997b OECD (propozycje) Dżdżownica
Eisenia andrei reprodukcja OECD 222 OECD, 2004
Skąposzczet
Enchytraeus albidus reprodukcja OECD 220 OECD, 2004c
Nicień
Caenorhabditis elegans
przeżycie ASTM, E2172-01 ASTM, 2001b wzrost
płodność reprodukcja
ISO/DIS 10872 ISO 2009
Ślimak
Helix aspersa wzrost AFNOR NF X31-255 AFNOR, 2001
Skoczogonek
Folsomia candida
hamowanie rozmnażania PN-ISO 11267:2002 PKN, 2002a reprodukcja ISO 11267, 1999 ISO 1999 Łanocha
Oxythyrea funesta śmiertelność larw AFNOR NF X31-260 AFNOR, 1999
5.3.1. Toksyczność dla dżdżownic
Zastosowanie dżdżownic do oceny toksykologicznej gleby ma bardzo wiele zalet (Gareczyńska i in., 2009). Wynika to z roli, jaką odgrywają te skąposzczety w
środowi-sku glebowym, uczestnicząc w procesach humifikacji, odżywiając się szczątkami ro-ślin, odchodami zwierząt oraz mikroorganizmami pobieranymi wraz z cząstkami gleby.
Test OECD na dżdżownicach jest najlepiej opracowany metodycznie i w niektó-rych krajach prawo wymaga jego wykonania przed wprowadzeniem do środowiska nowych związków chemicznych (Walker i in., 2002).
Gleba jest środowiskiem zmiennym i dlatego do celów badawczych używa się okre-ślonej sztucznej gleby piaszczysto-gliniastej. Materiał biologiczny do badań stanowią dorosłe, co najmniej dwumiesięczne dżdżownice z gatunku Eisenia foetida (rodzina Lumbricidae) – kompostowca różowego, tzw. dżdżownicy kalifornijskiej z siodełkiem. Są one przetrzymywane w sztucznej glebie, do której dodaje się badaną substancję w różnych stężeniach. Po 7 lub 14 dniach od początku badania zawartość pojemników wysypuje się na tacę i dla każdego stężenia oblicza się liczbę żywych dżdżownic (OECD, 1984a; ISO, 1993). W stosunku do E. foetida określa się toksyczność ostrą związków pobieranych przez skórę i przewód pokarmowy tych pierścienic. Śmiertelność doro-słych zwierząt po 7 i 14 dniach od umieszczenia ich w określonym podłożu zawierają-cym różne stężenia badanej substancji podaje się w procentach. Substancja oceniana pod względem toksyczności jest dodawana do gleby na początku badań jednorazowo i test prowadzi się bez ponownego uzupełniania testowanych związków. Wyniki odnosi się do próbek kontrolnych i na tej podstawie oblicza się stężenie substancji, dla którego występuje pięćdziesięcioprocentowa śmiertelność dżdżownic (LC50, 14 dni). Wadą standardowego testu OECD jest to, że podczas doświadczenia zwierzęta nie otrzymują pokarmu i mają tendencję do zmniejszania masy ciała. W nowszych wersjach tego testu podaje się małe granulki krowiego lub końskiego łajna na powierzchnię sztucznej gleby, umożliwiając dżdżownicom odżywianie i przyrost masy ciała.
W teście do oznaczania wpływu związków toksycznych, w tym pestycydów oraz zanieczyszczonej gleby pobieranych przez wór powłokowo-mięśniowy i przewód po-karmowy Eisenia foetida, na rozmnażanie, śmiertelność i wzrost tych zwierząt z zasto-sowaniem sztucznego podłoża glebowego (ISO 11268) materiał biologiczny stanowią dorosłe dżdżownice Eisenia foetida, których wiek mieści się w granicach od dwóch mie-sięcy do jednego roku. Metoda ta polega na określeniu zdolności do rozmnażania, wzrostu i wyrażonej w procentach śmiertelności dorosłych dżdżownic umieszczonych w sztucznym podłożu glebowym zawierającym różne stężenia badanej substancji. Sub-stancję dodaje się jednorazowo, śmiertelność zaś i biomasa są określane po czterech tygodniach. Wpływ na rozmnażanie ocenia się licząc potomstwo wylęgłe z kokonów po okresie dodatkowych czterech tygodni. Wyniki wyraża się jako LOEC i NOEC.
ASTM (1997b) opracowało metodę standardową badania toksyczności gleby lub bioakumulacji z użyciem dżdżownicy Eisenia foetida. W fazie opracowywania jest test oparty na pomiarze stanu błon lizosomowych w celomocytach dżdżownic (Weeks i Svendsen, 1996).
Eisenia foetida jest gatunkiem rodzimym dla południowej części strefy śródziem-nomorskiej. W północnych szerokościach geograficznych przeżywa on zimę tylko
5. Badanie toksyczności gleby 91
w kompoście, w kopcach nawozu lub w ogrzewanych szklarniach. Należy zatem za-chować ostrożność, ekstrapolując wyniki testów z Eisenia foetida na inne rodzime gatunki dżdżownic. Znacznie więcej informacji można uzyskać na podstawie obser-wacji w układach złożonych, takich choćby jak mikrozespół (Ernest i Frey, 2007).
5.3.2. Metoda z użyciem wazonkowców
Metoda standardowa OECD jest przeznaczona do badania wpływu substancji chemicznych na reprodukcję skąposzczetów – wazonkowców białych (Enchytraeus albidus). Pierścienice te zasiedlają wierzchnie, próchnicze i mineralne warstwy gleby, ściółkę, kompost itp. Żywią się głównie szczątkami organicznymi pochodzenia roślin-nego i zwierzęcego oraz mikroorganizmami (bakteriami i grzybami) pobieranymi wraz z glebą. W ekosystemie odgrywają podobną rolę do dżdżownic. Stanowią niezwykle ważny czynnik w procesie powstawania próchnicy.
Wazonkowce mogą być wykorzystywane zarówno do testów prowadzonych w warunkach laboratoryjnych, jak i w warunkach polowych. Z praktycznego punktu widzenia wiele gatunków z tego rodzaju jest łatwych w hodowli, a ich czas generacji jest krótszy niż u dżdżownic. Dorosłe wazonkowce są eksponowane na działanie ba-danej substancji w różnych stężeniach zmieszanej ze sztuczną glebą. Test trwa sześć tygodni. Po pierwszych trzech tygodniach zwierzęta wyjmuje się i obserwuje zmiany morfologiczne. Po kolejnych trzech tygodniach liczy się potomstwo wyklute z kokonów i porównuje z próbką kontrolną w celu określenia NOEC. Niekiedy można również za pomocą modelu regresji określić EC10 lub EC50 (ISO 16387:2004; PN-ISO 16387 2010).
5.3.3. Toksyczność dla stonóg
Testy na stonogach (Isopoda, Oniscidea) znajdują się nadal we wczesnym etapie opracowywania. Wadą takich gatunków, jak Oniscus asellus lub Porcellio scaber jest ich wolne tempo wzrostu i długi cykl rozrodu w porównaniu z Eisenia foetida czy Folsomia
candida. Nawet w temperaturze 25 °C świeżo wylęgłe stonogi wymagają co najmniej
6 miesięcy zanim osiągną wiek rozrodczy. Stonogi należą jednak do ważnych gatunków testowych, gdyż są pospolite, powszechnie rozprzestrzenione i odgrywają istotną rolę w fizycznej dekompozycji materiału liściowego na drobniejsze cząstki (Drobne, 1997).
Stonogi są wyjątkowo wytrzymałe na głodzenie i mogą przeżywać bez pokarmu przez wiele tygodni. Jednak tempo pobierania pokarmu jest jednym z parametrów, które można łatwo zmierzyć. Stonogi zjadają ściółkę liściową i zamieniają ją w grudki kału o bardzo stałym kształcie i masie. Licząc zatem grudki kału w określonym prze-dziale czasu, można określić, czy obecność substancji chemicznej w liściach odstrasza
stonogi od jedzenia. Zmniejszenie tempa konsumpcji spowoduje wolniejszy wzrost i wydłużenie okresu rozrodu (Walker i in., 2002).
5.3.4. Skoczogonki w badaniach ekotoksykologicznych
Skoczogonki (Collembola) są jedną z najliczniej reprezentowanych grup bezkrę-gowców glebowych (Hopkin, 1997). Mimo że test na skoczogonkach nie osiągnął jesz-cze takiego zaawansowania legislacyjnego jak metoda z użyciem dżdżownic, wiele laboratoriów na świecie wykorzystuje te bezkręgowce do badania skutków działania substancji chemicznych (Wiles i Frampton, 1996; Crouau i in., 1999).
Najczęściej stosowanym gatunkiem jest partenogenetyczny szczep (Folsomia
candi-da), którego cykl reprodukcyjny w 20 °C trwa 3–4 tygodnie. Stosowany model
doświad-czenia jest podobny do testu na dżdżownicach z czterema powtórzeniami, w każdym bada się próbkę kontrolną i serię wzrastających stężeń testowanej substancji chemicznej. Substancję chemiczną miesza się ze sztuczną glebą przygotowywaną jak w teście na dżdżownicach. W małych pojemnikach (np. 10 cm wysokości, 6 cm średnicy) umieszcza się po 10 rówieśniczych, dorosłych skoczogonków i jako pokarm niewielką ilość suszo-nych drożdży. Pozostawia się je na co najmniej 3 tygodnie, po czym zalewa się glebę wo-dą. Wszystkie skoczogonki, także te urodzone w trakcie doświadczenia, wypływają na powierzchnię wody. Wykonuje się zdjęcie lub rejestruje cyfrowo każdy pojemnik i na obrazie rzucanym na duży ekran liczy się potomstwo. Postęp w programach analizy obra-zu umożliwia automatyczne zliczanie i mierzenie wszystkich zwierząt (Martikainen i Krogh, 1999). W przypadku większej liczby powtórzeń część pojemników można zata-piać w różnym czasie, uzyskując odpowiedź zależną od czasu (Walker i in., 2002).
Metoda badania skutków działania środków chemicznych na rozmnażanie sko-czogonków w sztucznym podłożu glebowym jest podana w PN-ISO 11267:2002. Moż-na ją zaadaptować m.in. do porównywania gleb, badania wpływu zabiegów rekulty-wacyjnych na glebę, oszacowania subletalnego działania pestycydów i innych środków chemicznych lub określenia stężeń niewywołujących efektów toksycznych. W badaniu tym ocenia się skutki działania danej substancji na rozmnażanie Folsomia candida przez kontaktowe i pokarmowe pobranie jej z określonego sztucznego pod-łoża glebowego. Oznacza się wpływ różnych stężeń badanej substancji na rozmnaża-nie 10–12-dniowych skoczogonków w sztucznym podłożu. Skoczogonki inkubuje się aż do uzyskania potomstwa F1 wylęgającego się z jaj złożonych przez dojrzałe postacie dorosłe i oznacza się liczbę potomstwa. W doświadczeniach kontrolnych potomstwo wylęga się zwykle po 28 dniach. Wyznacza się NOEC, EC10, EC50 oraz LOEC.
Można też oznaczać wpływ zanieczyszczonej gleby na śmiertelność w pełni doj-rzałych skoczogonków. Równocześnie prowadzi się badania w glebie kontrolnej. Jeże-li przedmiotem testu jest oszacowanie skutków przypuszczalnego zanieczyszczenia, to zaleca się stosowanie gleby kontrolnej.
5. Badanie toksyczności gleby 93
5.3.5. Ślimaki w badaniach ekotoksykologicznych gleby
Ślimaki Helix aspersa aspersa (Müller) pochodzą z Francji. Jak wszystkie ślimaki lądowe, odżywiają się pokarmem roślinnym oraz glebą. Materiał do badań pozyskuje się ze zsynchronizowanej hodowli w warunkach sztucznych. Badania toksyczności substancji lub zanieczyszczeń wykonuje się na formach młodocianych (3–5 tydzień po wylęgu z jaj) zgodnie z normą PN-ISO 15952:2010. Organizmy poddaje się przez 28 dni działaniu badanej zanieczyszczonej gleby lub gleby referencyjnej z dodatkiem związków toksycznych albo materiału pochodzącego z odpadów. Badaną mieszaninę przygotowuje się i odnawia co 7 dni. Wzrost (przyrost masy oraz średnicy muszli) i przeżywalność ocenia się po 28 dniach lub opcjonalnie co 7 dni.
W porównaniu z próbką kontrolną wyniki przedstawia się jako NOEC lub LOEC. W teście istnieje możliwość oszacowania stężenia, dla którego wzrost ślimaków się zmniejsza o 50% w odniesieniu do średnicy muszli EC50d. Jeżeli stężenia te wywołują skutek śmiertelny, to wyniki można wykorzystać do oszacowania LC50. W opisanym teście można alternatywnie stosować inne gatunki ślimaków lądowych, takie jak Helix aspersa maxima, H. lucorum, H. pomatia, H. engadensis, Arianta arbustorum, Cepa-cea memoralis, C. portensis.