CZUŁOŚĆ POMIARU

Jednym z podstawowych problemów eksperymentalnych spektroskopii NMR jest relatywnie niska czułość pomiaru. Wynika ona z małej różnicy energii pomię­

dzy jądrowymi stanami spinowymi, a co zalym idzie, wyrównanych obsadzeń po­ ziomów spinowych w stanie równowagi termicznej. Dlatego też wielkie znaczenie mają sposoby poprawy czułości eksperymentów NMR, zarówno przez konstrukcje nowych generacji sprzętu jak i wykorzystanie nowych sekwencji impulsów.

Z technicznego punktu widzenia, wielki postęp został ostatnio osiągnięty w konstrukcji sond pomiarowych nowej generacji. Czułość nowych sond z nadprze­ wodzącymi cewkami i przedwzmacniaczami jest nawet kilkakrotnie wyższa od tra­ dycyjnych. Jednak sondy te mają zwykle obniżoną tolerancję na wodne roztwory jonowe, a ich dostępność jest limitowana bardzo wysoką ceną.

1 1 2 W KOŹMIŃSKI

Istniejąjednak możliwości poprawienia czułości pomiaru poprzez dobór odpo­ wiedniej techniki eksperymentalnej do konkretnego układu. W ogólnym przypad­ ku, pomijając ściśle związaną z szerokością sygnału prędkość relaksacji poprzecz­ nej, czułość eksperymentu NMR, a w praktyce stosunek sygnału do szumu (S/N), jest określona wzorem:

A

gdzie N0 jest liczbą molekuł w aktywnej przestrzeni próbki, ywzb i yobs są odpowied­ nio czynnikami magnetogirycznymi jąder wzbudzanych i tych, których sygnał jest obserwowany, natomiast NA jest liczbą akumulacji, B0 — wielkością stałej indukcji magnetycznej, a T — temperaturą bezwzględną.

Zależność czułości od N0 jest oczywista. Liczba aktywnych cząsteczek jest bo­ wiem wprost proporcjonalna do stężenia i objętości czynnej części próbki. Przy czym należy również uwzględnić relatywne zawartości związanych z eksperymentem izo­

topów. Wzrost Nq można więc osiągnąć trzema sposobami :

— przez zwiększenie stężenia (w przypadku badań roztworów), w granicach rozpuszczalności danej substancji i tak, by uniknąć znaczącego wzrostu lepkości, a w konsekwencji, przyspieszenia relaksacji poprzecznej;

— przez zwiększenie objętości próbki, pamiętając jednak, że im jest ona więk­ sza, tym trudniej uzyskać zadowaląjącąjednorodność stałego pola BQ i jednocześnie — przez, często niezbędne w badaniach większych cząsteczek o znaczeniu biolo­ gicznym, wzbogacenie próbki w rzadkie izotopy. Wiąże się to jednak z kosztowną procedurą i nie zawsze jest możliwe w praktyce.

Liczba akumulacji (NA) jest wprost proporcjonalna do czasu trwania ekspery- nentu, jednak w idealnym przypadku stosunek sygnału do szumu rośnie proporcjo­ nalnie do '¡NA. Tak więc, na dziesięciokrotną poprawę stosunku sygnału do szumu potrzeba stukrotnie dłużej trwającego eksperymentu. Nie zawsze to jest możliwe, nie tylko z przyczyn ekonomicznych, ale też ze względu na długofalową stabilność spektrometru i jego otoczenia. Czas pojedynczej akumulacji można natomiast zmniej­ szać do minimum wyznaczonego przez straty sygnału, wynikające z częściowego nasycenia, spowodowanego zbyt wolną relaksacją podłużną wzbudzanych jąder.

Dla danej próbki w określonym polu B0 najefektywniej można uzyskać zwięk­ szenie czułości przez wzbudzenie i pomiar sygnału swobodnego zaniku indukcji

(FID)2 jąder o jak najwyższym współczynniku y. I tu właśnie największe znaczenie

ma właściwy dobór eksperymentu z wykorzystaniem co najmniej jednego przenie­ sienia populacji poziomów spinowych pomiędzy jądrami różnych rodzajów. Wa­ runkiem powodzenia w transferze polaryzacji jądrowej jest istnienie niezerowych sprzężeń spinowo-spinowych, skalarnych lub dipolowych.

PODSTAWOWE TECHNIKI EKSPERYMENTALNE SPEKTROSKOPII NMR W FAZIE CIEKŁEJ 113

Możliwe jest przeniesienie polaryzacji zarówno od jąder czutych (I) o wysokim y do jąder mniej czułych (S), jak i w odwrotnym kierunku, a następnie detekcji sygnału FID. W tym drugim przypadku mówi się czasem o tak zwanej detekcji

odwrotnej”3 [22—24], Najsilniejsze teoretycznie wzmocnienie można uzyskać dzię­

ki dwukrotnemu przeniesieniu polaryzacji z jąder czułych do niskoczułych i z po­ wrotem. W takim przypadku jednak niemożliwe jest bezpośrednie uzyskanie para­ metrów spektralnych jąder S w widmie jednowymiarowym i konieczny staje się pomiar pośredni — przez wprowadzenie dodatkowego wymiaru czasu — a w konse­ kwencji, po dwuwymiarowej transformacji Fouriera, częstości.

Najczęściej do przeniesienia polaryzacji stosuje się techniki INEPT4 [25] lub

DEPT5 [26], choć często wykorzystuje się także krzyżowe przeniesienie polaryzacji

w heterojądrowym eksperymencie Hartmanna-Hahna [27]. Ta ostatnia technika sto­ sowana jest rutynowo w badaniach stałych próbek polikrystalicznych, poddanych jednocześnie wirowaniu pod tzw. kątem magicznym w celu uśrednienia anizotropii

ekranowania (MAS)6.

Względne czułości różnych typów eksperymentów dla jąder o różnych /zesta­ wione są dla przykładu w Tabeli 1. Relatywne czasy pomiaru do osiągnięcia równe­ go stosunku sygnału do szumu, z pominięciem innych aspektów eksperymental­ nych, jak np. szybkości relaksacji, sąkwadratami odwrotności liczb umieszczonych w tej tabeli. Z wielkości tych wynika niezbicie, że nawet w przypadku pomiarów

widm 13C w prostych związkach organicznych, przy stężeniach rzędu 10~2 molxdnr3,

stosowanie wzbudzenia i detekcji protonów daje duże korzyści. Znacznie szybciej można uzyskać widmo dwuwymiarowe tego rodzaju, niż konwencjonalne widm< jednowymiarowe, nawet przy wykorzystaniu maksymalnego wzmocnienia prze: jądrowy efekt Overhausera. Natomiast w przypadku spektroskopii NMR jądei o niższym współczynniku /c z y pomiarach dużych cząsteczek bioorganicznych, metody oparte na wielokrotnym przeniesieniu polaryzacji stają się koniecznością, nawet przy wzbogaceniu w rzadkie izotopy.

Omawiając czułość eksperymentów NMR, należy wspomnieć również, o sze­ roko obecnie wykorzystywanych zastosowaniach impulsowych gradientów B0 (PFG8) [28,29]. Choć wybór dróg koherencji za pomocą PFG wiąże się zazwyczaj ze stratą czułości (czasem nawet dwukrotną), ich użycie wydatnie wspomaga tłumienie nie­ pożądanych sygnałów np. pochodzących od rozpuszczalnika czy izotopomerów za­ wierających l2C lub KN. Pozwala to na poprawę dynamiki rejestrowanego sygnału FID, a w przypadku próbek związków organicznych o relatywnie wysokich stężę-5 ang. Inverse detection. Historycznie, standardowa konfiguracja spektrometrów oparta była na założeniu detekcji jąder o niskim

y z ewentualnym odprzęganiem jąder o wysokim czynniku 7, najczęściej *H. Stąd przeciwna konfiguracja dostosowana do obserwacji np. *H z użyciem kanału odprzęgania dostrojonego do częstości nuklidów o małym ^nazywana je s t czasem myląco odwrotną.

4 ang. Insensitive Nuclei Enhancement by Polarization Transfer.

5 ang. Distortionless Enhancement by Polarization Transfer.

6 ang. Cross Polarization.

7 ang. Magic Angle Spinning.

1 1 4 W. KOŹMIŃSKI

niach, zastosowanie PFG w technikach korelacyjnych - dzięki skróceniu niezbęd­ nych cykli fazowych - pozwala na przyspieszenie ich rejestracji.

Tabela I. Porównanie względnych czułości eksperymentów NMR ze wzbudzeniem i obserwacją różnych jąder. Względne zawartości izotopowe nie zostały uwzględnione, jednak ich wpływ nie zależy

od sposobu pomiaru______________________________ I S jflV XS) w z b S obs S N O E = 0 lr(S) \Á w z b l o b s S \r(i)r(S)\K w zb I obs I 1 / ( 1 # ‘H ,5C 4 1/32 1/8 1 'H ,3n - 1 0 1/316 1/32 1 ‘H ” Fe 31 1/5350 1/173 1

Zależność czułości eksperymentu NMR od stałej indukcji magnetycznej B0 wydawała się dotąd oczywista, a budowa coraz silniejszych magnesów nadprzewo­ dzących limitowana była wyłącznie postępem technicznym i ich ceną. Jednak za­ stosowanie jeszcze mocniejszych magnesów do spektroskopii NMR wysokiej zdol­ ności rozdzielczej, prawdopodobnie już w niedalekiej przyszłości ograniczone bę­ dzie istotnym udziałem efektów anizotropowych. Przykładem może być zwiększa­ jący szerokość sygnałów mechanizm relaksacyjny, związany z anizotropią przesu­ nięcia chemicznego (CSA9). Prędkość relaksacji wywoływanej przez efekty CSA jest proporcjonalna do kwadratu B0. Podobnie możliwe w bardzo wysokich polach częściowe porządkowanie się molekuł w fazie ciekłej może powodować poszerza­ nie się sygnałów ze względu na pojawianie się resztkowych sprzężeń bezpośrednich dipol-dipol.