STRATEGIA PRZYPISYWANIA SYGNAŁÓW DLA CZĄSTECZEK ZNAKOWANYCH IZOTOPOWO

Dla przypisania sygnałów rezonansowych kwasów nukleinowych całkowicie znakowanych izotopami 13C i l5N zaproponowano do tej poiy wiele różnych ekspe­ rymentów, a obszerny ich opis można znaleźć w pracach przeglądowych [18-23].

Dostęp do preparatów znakowanych izotopami 15N i l3C dostarczył badaczom nowych narzędzi w przezwyciężaniu problemów napotykanych w eksperymentach homojądrowych. W literaturze napotkać można zasadniczo dwie strategie przypisa­ nia sygnałów, dla znakowanych izotopowo cząsteczek kwasów nukleinowych. W pierwszej z nich, opierającej się głównie na analizie kontaktów NOE [2, 11 ], przy­

pisywanie sygnałów dokonywane jest w oparciu o różne techniki ,3C/,5N-edycji widm

NOESY i TOCSY. W drugiej, preferowanej ostatnio metodzie [23,20], dla identyfika­ cji sygnałów wykorzystuje się korelację poprzez sprzężenia skalarne, gdzie obecność sygnału korelacyjnego w widmie jednoznacznie dowodzi istnienia wiązania chemicz­ nego pomiędzy jądrami zaangażowanymi w oddziaływania. Zastosowanie tego podej­ ścia rozwiązuje problem niejednoznaczności przypisań napotykany w metodach opar­ tych na sekwencyjnej analizie sygnałów NOE.

Pierwszym etapem analizy widm cząsteczek znakowanych izotopowo jest iden­

tyfikacja sygnałów pochodzących od protonów niewymienialnych (H2, H5, H6, H8)

i protonów wymienialnych (iminowych i aminowych) zasad nukleinowych. W nas­ tępnej kolejności przypisuje się protony należące do reszt cukrowych (HI ’, H 2 \ H3’, H4’, H5’, H5” ). Sygnały pochodzące od poszczególnych reszt zasad koreluje się z odpowiadającymi im resztami cukrowymi w zależności od stosowanej strategii, albo poprzez obserwację kontaktów NOE pomiędzy protonami aromatycznymi i H 1’, lub też poprzez bezpośrednią korelację sygnału H F poprzez sprzężenia skalarne z sygnałami atomu azotu wiązania N-glikozydowego. Sekwencyjne połączenie po­ między kolejnymi resztami nukleotydowymi otrzymywane jest albo za pomocą eks­ perymentów NOE lub też wykorzystując korelacje poprzez wiązania wzdłuż szkieletu fosforocukrowego. W ten sposób możliwe jest często przypisanie prawie wszyst­ kich sygnałów w widmach NMR kwasów nukleinowych.

SPEKTROSKOPIA NMR W BADANIACH STRUKTURALNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH CZESC I 5 7

4.1. P R Z Y P I S A N I E P R O T O N Ó W W N U K L E O Z A S A D A C H

Rozróżnienie pomiędzy sygnałami protonów iminowych pochodzących od reszt uracylu i reszt guanozyny stało się dużo łatwiejsze z chwiląwprowadzenia znakowa­

nia izotopowego 15N, gdyż przesunięcie chemiczne atomu azotu związanego z proto­

nem iminowym różni się znacznie dla reszt guanozyny (145-150 ppm) i uracylu (155-165 ppm). Sygnały pochodzące od atomów azotu grup aminowych można również zidentyfikować na podstawie przesunięć chemicznych. Linie rezonansowe atomów azotu pochodzące od grup aminowych reszt cytozyny występują w regionie 95—100 ppm, natomiast sygnały atomów azotu od grup aminowych guanozyny poja- wiająsię w regionie 70-75 ppm.

Ważną grupę eksperymentów stanowiąmetody pozwalające na korelację pomię­

dzy protonami wymienialnymi a protonami H8/H6 [20,24-27].

a.

O

—H

e.

Rysunek 4. Przykładowe drogi transferu magnetyzacji wykorzystywane dla korelacji różnych jąder w purynach i pirymidynach: a) HNC-TOCSY-CH, b) i e) HCCNH-TOCSY, c) HNCCCH,

5 8 Z. GDANIEC

I tak na przykład w widmach typu HNCCH-TOCSY otrzymuje się informację o od­ działywaniach pomiędzy protonami iminowymi zaangażowanymi w tworzenie wią­

zania wodorowego a protonami H8 puryn lub H6 piiymidyn. Możliwość identyfikacji

sygnałów H2 i H8 przynależących do danej reszty adeniny jest niezwykle istotna

z uwagi na częsty brak jakichkolwiek kontaktów NOE do protonów H2 w regionach jednonicowych struktur RNA. Korelację pomiędzy tymi jądrami uzyskuje się najczę­ ściej za pomocą eksperymentów typu HCCH-TOCSY [28,29].

Rysunek4 ilustruje przykładowe drogi transferu magnetyzacji wykorzystywane dla korelacji różnych jąder w purynach i pirymidynach.

4.2. P R Z Y P I S A N I E S Y G N A Ł Ó W P O C H O D Z Ą C Y C H O D P I E R Ś C I E N I A C U K R O W E G O

Zastosowanie znakowania izotopowego l3C niezwykle ułatwia przypisanie syg­ nałów pochodzących od reszt cukrowych, dzięki możliwości edycji widm w dodat­

kowym wymiarze ,3C. W celu identyfikacji sygnałów pierścieni cukrowych cząste­

czek całkowicie znakowanych izotopem l3C stosuje się eksperymenty typu HCCH- TOCSY, HCCH-COSY lub ich hybrydowe formy [22, 28,30,31]. W widmach typu HCCH-TOCSY czy HCCH-COSY magnetyzacja przenoszona jest pomiędzy protona­ mi tej samej reszty cukrowej i pośredniczącymi atomami węgla. Oznacza to, że transfer magnetyzacji następuje poprzez duże sprzężenia skalarne przez jedno wiązanie

(155-170 Hz) i sprzężenia l3C-l3C (38-42 Hz), a nie jak w eksperymentach homojąd-

rowych poprzez małe, zależne od konformacji cukru wicynalne stałe sprzężenia

3Jhh (2-8 Hz). Eksperymenty te są stosunkowo czułe, gdyż duże stałe sprzężenia

prowadzą do wydajnego transferu magnetyzacji.

4.3. K O R E L A C J A S Y G N A Ł Ó W P IE R Ś C IE N IA C U K R O W E G O I Z A S A D Y

W cząsteczkach kwasów nukleinowych zasada heterocykliczna połączona jest z pierścieniem cukrowym wiązaniem N-glikozydowym. Dlatego też optymalnym roz­ wiązaniem dla korelacji sygnału protonu HI ’ z odpowiadającym mu sygnałem proto­

nu aromatycznego H8/H6 wydająsię być eksperymenty rezonansu potrójnego HCN

[22,28, 32]. W metodach opartych na obserwacji efektu NOE nie zawsze jest moż­ liwe jednoznaczne przypisanie pierścienia cukrowego do właściwej nukleozasady, ztego też względu eksperymenty wykorzystujące korelacje poprzez wiązania sąnie- zwykle ważne w analizie widm kwasów nukleinowych. W eksperymentach typu

HCN proton anomeryczny wiąże się z protonami H6/H8 poprzez korelacje do wspól­

nego atomu azotu N1/N9 (HsCNb — od strony pierścienia cukrowego łączy jądra

H I’, C l’ iN 9/N l, a HbCNb koreluje jądra H6/H8, C6/C8 iN l/N 9). Z kolei wekspe-

rymentach HCNCH możemy uzyskać bezpośrednie korelacje pomiędzy sygnałem

SPEKTROSKOPIA NMR W BADANIACH STRUKTURALNYCH KWASÓW NUKLEINOWYCH CZĘSC I 5 9

nek 5). W literaturze można spotkać jeszcze inne modyfikacje tych eksperymentów [33—35], a ich głównym celem jest poprawa czułości eksperymentu.

Rysunek 5 Korelacje poprzez wiązania pomiędzy sygnałem HI ’ i odpowiadającym mu sygnałem protonu aromatycznego H6/H8 otrzymywane w widmach HCN i HCNCH

4.4. S E K W E N C Y J N E P R Z Y P IS A N I E R E S Z T C U K R O W Y C H Z W Y K O R Z Y S T A N IE M K O R E L A C J I H E T E R O J Ą D R O W Y C H W Z D Ł U Ż S Z K IE L E T U

F O S F O R O C U K R O W E G O

Sekwencyjne przypisanie sygnałów dla reszt cukrowych można uzyskać za po­ mocą widm 3D HCP [36, 37], w których transfer magnetyzacji następuje poprzez wiązania wzdłuż szkieletu fosforocukrowego. W eksperymentach tych wykorzystu­

je się stosunkowo duze wartości sprzęzeń oraz JC4,(iil)p(i). W widmach HCP

sygnały H4’C4’ pochodzące od jednej reszty cukrowej wykazująkorelacje do dwóch sygnałów atomów fosforu: P oraz P(j+|), a więc odpowiednio z końca 5’ i 3’. Nato­

miast sygnały H2’C2’ i H3’C3’ łączą się tylko z atomem fosforu P , a sygnały

C5’H5’/H5” są skorelowane z atomem fosforu P .

O NH2

OH OH _{OH OH}

\

6 0 Z. GDANIEC

W widmach cząsteczek RNA zarówno sygnały pochodzące od protonów H4’, jak i od jąder 3IP bardzo często się nakrywają, co utrudnia analizę widm HCP. Popra­ wę rozdzielczości w tego typu eksperymentach można uzyskać przenosząc magne­ tyzację do znacznie lepiej rozdzielonych protonów HI Sekwencją, która wykorzy­ stuje ten rodzaj ścieżki jest sekwencja PCCH-TOCSY [38], W eksperymencie PCCH— TOCSY transfer magnetyzacji następuje od atomu fosforu do atomu węgla C4’, po­ tem kolejno magnetyzacjaprzekazywanajest poprzez C3’,C 2 ’ do C l ’ anastępnie do

protonów anomerycznych, H I’ (Rysunek 6).