regeneracji nadnercza, przeciwnie do ekspresji inhibitorów cyklu, których ekspresja była obniżona. Fraticelli i wsp. (1998) wcześnie już obserwowali spadek stężenia mRNA białka p57 (Cdkn1c) na początku regeneracji, które w 5. dniu wzrosło i w 7. dniu osiągnęło wartości wyższe niż w kontroli. Wyniki obecnych badań potwierdziły te doniesienia, wskazując bardzo silne obniżenie ekspresji białka p57 w pierwszych pięciu dniach regeneracji w porównaniu do nadnerczy kontrolnych. Z drugiej strony, obserwowano silny wzrost ekspresji mRNA białka p21 (również inhibitor Cdk, Cdkn1a) prawie w każdym badanym dniu regeneracji nadnerczy. Białko p21 pełni funkcje regulatora cyklu komórkowego poprzez oddziaływanie w fazie G1 i S. Jest ono uważane również za potencjalny czynnik regulujący proliferację hepatocytów podczas regeneracji wątroby (Su i wsp., 2002). Wysoka ekspresja białka p21 hamuje cykl komórkowy w fazie G1, całkowicie zatrzymując podziały komórkowe. Regenerujące komórki kory nadnerczy zaprzestają podziałów i kierowane są do fazy Go, w której najprawdopodobniej różnicują się w komórki strefy pasmowatej. To przypuszczenie wydaje się być prawdziwe, bowiem w 5. dniu regeneracji wzrasta do poziomu porównywalnego z kontrolą ekspresja Cyp11b1 (Tyczewska i wsp., 2014).
Wyniki obecnych badań, oparte o metodę QPCR, wskazały także godny uwagi wzrost ekspresji mRNA cykliny B1 i Cdk1 w regenerujących nadnerczach. Jak wiadomo, wysoka ekspresja obu genów jest wymagana do przekroczenia punktu kontrolnego pod koniec fazy G2
interfazy.
Postęp cyklu komórkowego regulowany jest również przez inne geny. Przykładowo, gen Gadd45 (growth arrest and DNA-damage-inducible, alpha; NM_024127.2) poprzez indukcję naprawy DNA hamuje przejście komórki z fazy G2 do M cyklu komórkowego. Analiza mikromacierzy ekspresyjnych ujawniła znaczący wzrost ekspresji tego genu 24 godziny po zabiegu enukleacji. Podobnie, ekspresja tego genu była podwyższona podczas fazy wstępnej regeneracji wątroby myszy (Su i wsp., 2002).
Istnieje kilka punktów restrykcyjnych mitozy, np. tworzenie płytki metafazalnej czy rozdzielenie chromatyd siostrzanych podczas anafazy, w których geny Nek6 i Pttg1 odgrywają istotną rolę. Produkt genu Nek6, znany jako kinaza białkowa serynowo-treoninowa, działa na etapie metafazy podziału mitotycznego, a jego zahamowanie prowadzi do apoptozy komórki, podczas gdy produkt genu Pttg1, będący substratem kompleksu anafazowego (APC) uczestniczy w rozchodzeniu się chromatyd do przeciwnych biegunów komórki. Z wykorzystaniem zarówno metody mikromacierzy RNA, jak i metody QPCR, odnotowano bardzo silny, istotny statystycznie wzrost ekspresji obu genów w każdym
65
badanym dniu regeneracji, z najwyższą ekspresją w jej 2. dniu. Na temat funkcji Nek6 i Pttg1 w komórkach nadnerczy dostępnych jest niewiele informacji, jednak wiadomo, że ich obecność konieczna jest w trakcie tworzenia wrzeciona kariokinetycznego. Produkt genu Nek6 (NIMA kinase 6) najprawdopodobniej oddziałuje z Cdk1 i przyczynia się do rozdziału centrosomów (Bertran i wsp., 2011; Cao i wsp., 2012). Z drugiej strony, wcześniejsze doniesienia wskazują, że produkt genu Pttg1 wzmaga proliferację keratynocytów (Ishitsuka i wsp., 2012).Wzrost nadnerczy w warunkach in vivo podlega regulacji wielu czynników wzrostu i ich receptorów, np. zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFgf), insulinopodobnych czynników wzrostu (Igf1 i Igf2) i nabłonkowego czynnika wzrostu (Egf) (Basile i Holzwarth, 1993; Penhoat i wsp., 1994; Coulter i wsp., 1996; Vendeira i wsp., 1999; Chu i wsp., 2009). Wysoki poziom transkryptu mRNA Igf1 odnotowano w komórkach strefy ZF i jak wiadomo, Igf1 stymuluje proliferację oraz steroidogenezą w komórkach kory nadnerczy człowieka, szczura i bydła (Jackson i wsp., 1991; Mesiano i wsp., 1993; Penhoat i wsp., 1994). Ponadto, ekspresja receptorów Igf1 wzrasta pod wpływem ACTH i podwyższona ekspresja tego genu, jak zaobserwowano w obecnej pracy, mogła być spowodowana kompensacyjną hipersekrecją ACTH (Louveau i wsp., 1989; Penhoat i wsp., 1989). Igf2 to czynnik wzrostu, który również stymuluje wzrost płodowych nadnerczy (Mesiano i wsp., 1993). Analiza mikromacierzy RNA ujawniła znaczący wzrost ekspresji genu Igf1 na początku regeneracji (szczególnie w dniach 1-5), podczas gdy poziom ekspresji zarówno Igf2, jak i genów Igf1r oraz Igf2r pozostała niezmieniona (danych nie przedstawiono). Wcześniejsze badania Gospodarowicza i wsp. (1977) zidentyfikowały bFgf jako czynnik stymulujący podziały i migrację komórek kory nadnerczy szczura i bydła. bFgf jest także znanym czynnikiem wzrostu, który pośredniczy w proliferacji komórek kory nadnerczy podczas kompensacyjnego wzrostu nadnerczy oraz regeneracji nadnerczy (Basile i Holzwarth, 1993; Chu i wsp., 2009). Wyniki obecnych badań potwierdziły wcześniejsze doniesienia, gdyż odnotowano, że ekspresja genu bFgf wzrosła w fazie początkowej regeneracji.
Inny czynnik wzrostu – nabłonkowy czynnik wzrostu (Egf) – stymuluje wzrost kory nadnerczy i jej funkcjonalne dojrzewanie, a w komórkach nadnerczy płodach makaka jego działanie połączone jest z indukcją ekspresji 11beta-hydroksylazy (Cyp11b1) i dehydrogenazy 3beta-hydroksysteroidowej (3bHsd) (Coulter i wsp., 2001). W obecnych badaniach nie wykazano istotnych statystycznie zmian ekspresji genu Egf w toku regeneracji nadnerczy (analiza mikromacierzy, dane nie przedstawione). Przeciwnie, jak wykazano metodą QPCR, ekspresja genu receptora Egf (Egfr) była znacząco podwyższona w toku
66
regeneracji kory nadnerczy (do 15. dnia doświadczenia). Jest to bardzo interesujące, ze względu na fakt, iż Egfr i jego ligandy (Tgfa – transformujący czynnik wzrostu alfa i Hbegf – czynnik wzrostu podobny do Egf, wiążący heparynę) odgrywają istotną rolę jako czynniki mitogenne w pierwotnej hodowli hepatocytów oraz podczas indukowanej częściową hepatektomią regeneracji wątroby (Argast i wsp., 2004; Fausto i wsp., 2006). Taki stymulujący wpływ Hbegf na postęp cyklu komórkowego zaobserwowano już wcześniej (Webber i wsp., 1994; Kiso i wsp., 1995). Inny ligand Egfr - Tgfa również stymuluje proliferację komórek i ich zdolność migracji, a także stymuluje powstawanie naczyń krwionośnych. Uważany jest on również za istotny czynnik w początkowej fazie regeneracji wątroby (Fausto, 2000). Wyniki obecnych badań (analiza mikromacierzy) ujawniły znaczny wzrost ekspresji genu Tgfa 24 godziny po enukleacji, sugerując jego rolę w regeneracji nadnerczy jako analogiczną do tej obserwowanej w regeneracji wątroby.Jak wiadomo, proliferacja komórek kory nadnercza podlega kontroli peptydów wywodzących się z proopiomelanokortyny (POMC), szczególnie peptydów powstających z jej N-końcowego odcinka (Alfano i wsp., 1985; Estivariz i wsp, 1988). Jak już wspomniano, enukleacja nadnerczy wywołuje nagły spadek poziomu kortykosteronu we krwi, co prowadzi do kompensacyjnej hipersekrecji ACTH i innych peptydów N-końcowego odcinka POMC wydzielanych przez przysadkę mózgową (Perone i wsp., 1997). W warunkach in vivo ACTH w pierwszym etapie prowadzi do hipertrofii komórek miąższowych kory nadnercza, a dopiero w późniejszym okresie pobudza ich proliferację (Dallman i wsp., 1980, 1984-85). Z drugiej strony znanym jest, iż in vitro ACTH hamuje proliferację hodowanych komórek kory, czemu towarzyszy pobudzenie ich czynności wydzielniczej (Rybak i Ramachandran, 1981; Rucinski i wsp., 2009). W aspekcie tych danych prześledzono profil ekspresji genu Mc2r (receptora ACTH) w regenerujących nadnerczach szczura. Niespodziewanie, w ciągu pierwszych 8. dni regeneracji poziom transkryptu mRNA Mc2r był znacząco obniżony w porównaniu do nadnerczy kontrolnych, tylko w 15. dniu doświadczenia ekspresja wzrosła do poziomu porównywalnego do kontroli. Wyniki te sugerują, że w regenerujących nadnerczach nie tylko ACTH kontroluje proliferację i różnicowanie komórek kory. Z drugiej strony, istnieje inny peptyd powstający z N-końcowego odcinka POMC o znanym mitogennym działaniu na komórki kory nadnerczy (Bicknell i Lowry, 2002). Peptyd ten jest wycinany z N-końcowego prekursora POMC za pomocą specyficznej proteazy (Asp, Tmprss11d, NM_001033652.1), która ulega ekspresji w części zewnętrznej kory nadnerczy. Jednakże w obecnych badaniach analiza mikromacierzy RNA nie ujawniła istotnych statystycznie zmian ekspresji genu Asp w toku regeneracji kory nadnerczy (dane nie przedstawione).