Lokalizacja wybranych genów zwi ązanych ze steroidogenezą

Metodą immunohistochemii (dwustopniowa metoda immunoperoksydazowa z kompleksem EnVision-HRP) uwidoczniono produkty wybranych genów związanych ze steroidogenezą w komórkach regenerującej kory nadnerczy szczura. Substancje Star-immunoreaktywne występują w cytoplazmie komórek całej kory nadnercza szczurów kontrolnych (ryc. 23A) oraz w cytoplazmie komórek regenerującej kory (ryc. 23B,C,E). W regenerującej korze nie obserwuje się odczynu w paśmie komórek przyległych do torebki.

Substancje Cyp11a1-immunoreaktywne występują w cytoplazmie komórek całej kory nadnercza szczurów kontrolnych (ryc. 23F) oraz w cytoplazmie komórek regenerującej kory (ryc. 23G,H,J). Na podkreślenie zasługuje fakt, iż odczyn ten występuje także w komórkach przyległych do torebki regenerującego nadnercza.

Również substancje Cyp11b1-immunoreaktywne występują w cytoplazmie komórek całej kory nadnercza szczurów kontrolnych (ryc. 23K) oraz w cytoplazmie komórek regenerującej kory (ryc. 23L,M,O). Na podkreślenie zasługuje fakt, iż podobnie jak w przypadku Cyp11a1 odczyn ten występuje także w komórkach przyległych do torebki regenerującego nadnercza.

57

Ryc. 23. Immunohistochemiczna lokalizacja białkowych produktów genów Star (A-E), Cyp11a1 (F-J)

oraz Cyp11b1 (K-O) w regenerujących nadnerczach szczura oraz nadnerczach szczurów kontrolnych (A,F,K). Substancje Star-immunoreaktywne występują w cytoplazmie komórek całej kory nadnercza szczurów kontrolnych (A) oraz w cytoplazmie komórek regenerującej kory, w której nie obserwuje się odczynu w paśmie komórek przyległych do torebki (B,C,E). Substancje Cyp11a1-immunoreaktywne występują w cytoplazmie komórek całej kory nadnercza szczurów kontrolnych oraz w cytoplazmie komórek regenerującej kory (F,G,H,J). Podobną lokalizację wykazuje odczyn na Cyp11b1 (K,L,M,O). B,G,L – 3. dzień regeneracji; C,H,M – 5. dzień regeneracji; E,J,O – duże powiększenie komórek miąższowych regenerującej kory nadnerczy szczura w 5. dniu doświadczenia - strzałki wskazują podziały mitotyczne. Brak odczynu w reakcjach kontrolnych (D,I,N – 5. dzień regeneracji). Dwustopniowa metoda immunoperoksydazowa z kompleksem EnVision+HRP. Skrawki podbarwione hematoksyliną. Powiększenia zaznaczone na zdjęciach.

58

5. Dyskusja

Zastosowane w niniejszych badaniach techniki mikromacierzy ekspresyjnych pozwoliły prześledzić zmiany profilu globalnej ekspresji genów (około 30 tysięcy transkryptów) w toku indukowanej enukleacją regeneracji kory nadnercza szczura. Ogólna analiza ujawniła znaczące zmiany ekspresji genów w regenerującym gruczole w porównaniu do grupy kontrolnej. Dynamiczne zmiany ekspresji różnych genów przedstawiono na podstawie różnic w poziomie ekspresji w różnych dniach regeneracji. W 1. dniu od enukleacji ekspresja blisko 2. tysięcy genów uległa zmianie przynajmniej 2-krotnej (wzrost/spadek), podczas gdy w 15. dniu doświadczenia, już tylko ekspresja około 400. genów była zmieniona. Analizy tej ekspresji pozwoliły na wyodrębnienie różnorodnych grup funkcjonalnych genów o zmienionej ekspresji. Tak jak się spodziewano, najbardziej znaczące różnice obserwowano w przypadku ekspresji genów związanych z rozwojem stanu zapalnego oraz powstawaniem skrzepu, m.in. w okresie między 1. a 3. dniem po zabiegu enukleacji wysoką ekspresję odnotowano w przypadku genów Serpina3n, Vcan, Prg4, Chi3l1 czy Fcgr2b (rola genów zamieszczona jest w bazie GO). Podobnie, istotne zmiany ekspresji dotyczyły również genów kodujących metaloproteinazy macierzy (Mmp2, Mmp9, Mmp12), zaangażowanych w rozkład macierzy pozakomórkowej, a także te kodujące selektyny (Sell, Selp), związane z adhezją komórek. Uzyskane wyniki sugerują prawdopodobną rolę czynników stanu zapalnego w angiogenezie w toku indukowanej enukleacją regeneracji kory nadnercza.

Spośród grup tych genów dokładniej przeanalizowano te, które odgrywają zasadniczą rolę w odbudowie struktury i wysoce wyspecjalizowanej funkcji gruczołu, w szczególności jej części korowej. Do procesów tych zaliczono angiogenezę, proliferację i różnicowanie komórek oraz steroidogenezę.

W ostatnich latach indukowaną enukleacją regenerację kory nadnercza szczura, jako model badań nad szybkim wzrostem gruczołu, wykorzystywano głównie w celu poszukiwania komórek macierzystych kory nadnercza (Kim i Hammer, 2007). Wzrostowi gruczołu towarzyszy gwałtowna angiogeneza, jednak istnieje tylko niewiele informacji dotyczących procesu powstawania nowych naczyń krwionośnych w tym modelu doświadczalnym. Jak wiadomo, enukleacja nadnerczy prowadzi do powstania skrzepu, z czym związane jest pojawienie się stanu zapalnego. Procesy te mogą wpływać zarówno na proliferację komórek regenerującej kory, jak i ich różnicowanie oraz angiogenezę.

Istnieje niewiele danych dotyczących procesu powstawania naczyń krwionośnych i profilu ekspresji czynników wzrostu związanych z angiogeneza w regenerujących

59

nadnerczach (Albertin i wsp., 2005; Chu i wsp., 2009; Taniguchi i wsp., 2004). W niniejszej pracy wykazano dynamiczne zmiany ekspresji genów związanych z angioegenzą. W pierwszym dniu regeneracji kory nadnercza odnotowano zmiany ekspresji ponad 60. genów. Pośród genów, których ekspresja wzrosła znalazły się bFgf, Mmp2, integryna 2b, Figf, łożyskowy czynnik wzrostu (Pgf), Il1b. Produkty tych genów stymulują angiogenezę poprzez bezpośredni wpływ na komórki śródbłonka lub pośredni, poprzez aktywację komórek prozapalnych, takich jak makrofagi, monocyty, neutrofile, które w odpowiedzi uwalniają czynniki angiogenne (Isik i wsp., 1996; Salcedo i wsp., 2000). Niektóre z nich pobudzają interakcje komórka - komórka, komórka – macierz pozakomórkowa lub produkcję Vegf (Autiero i wsp., 2003; Gospodarowicz, 1976; Lee i wsp., 2011). W tym samym czasie, zidentyfikowano także geny, których ekspresja obniżyła się, np. Hhex, który koduje czynnik transkrypcyjny, hamujący transkrypcję genów Vegf, Vegfr-1 i Vegfr-2 (Cantile i wsp., 2008; Noy i wsp., 2010). Dla porównania, w 15. dniu regeneracji odnotowano wzrost ekspresji tylko 6. genów (np. Figf), a 4. spadek.

Dobrze udokumentowana jest rola klasycznego czynnika angiogenezy, czynnika wzrostu śródbłonka (Vegf) i jego receptorów, w procesie angiogenezy (Amoroso i wsp., 1997; Conn i wsp., 1990; Ferrara i wsp., 1997; Leung i wsp., 1989; Nicosia i wsp., 1994; Pepper i wsp., 1992; Tolentino i wsp., 1996). Oprócz stymulacji angiogenezy, czynniki z rodziny Vegf mogą chronić komórki śródbłonka przed apoptozą, fenestracją i wzrostem przepuszczalności makromolekuł w komórkach śródbłonka nowo powstałych naczyń krwionośnych regenerującej kory nadnercza (Roberts i Palade, 1995; Vittet i wsp., 2000). W nadnerczach ekspresja genów systemu Vegf podlega także regulacji ACTH (Mallet i wsp., 2003). Wcześniejsze badania zespołu wykazały wzrost poziomu mRNA Vegf w toku regeneracji nadnercza (Albertin i wsp., 2005). Przeciwnie, w procesie regeneracji autotransplantów kory nadnercza szczura Taniguchi (2004) obserwował znaczny spadek ekspresji Vegf (izoformy 164 i 120) oraz receptora kinazy tyrozynowej 1 (Flt-1, Vegfr-1) w pierwszym tygodniu po transplantacji, a następnie jej wzrost, który w 4. tygodniu obserwacji osiągnął wartości porównywalne do kontroli. Wyniki niniejszych badań wskazały spadek ekspresji genów Vegfa, Vegfc, Kdr (Vegfr-2) w pierwszych dniach regeneracji nadnercza. Z drugiej strony, ekspresja mRNA Vegfd wzrosła w 5. dniu doświadczenia. Ponadto, reakcja immunohistochemiczna w przypadku Vegfa w regenerujących nadnerczach potwierdziła również, że to komórki regenerującej kory produkują i uwalniają czynniki Vegf i w ten sposób - prawdopodobnie na drodze parakrynowej - stymulują angiogenezę w toku

60

W dokumencie Profil ekspresji wybranych genów związanych ze wzrostem, różnicowaniem i czynnością komórek kory nadnercza szczura w przebiegu indukowanej enukleacją regeneracji gruczołu (Stron 56-60)