Chromatografia oraz elektroforeza kapilarna to w przypadku mikrocystyn jedyne techniki analityczne, które pozwalają na rozdzielenie toksyn oraz ich identyfikację [39], W jednym zakwicie sinic może się znajdować nieraz kil kanaście odmian mikrocystyn [40]. Również z tego powodu konieczne jest użycie bardziej skomplikowanej metody analitycznej. Brak komercyjnie dostę pnych syntetycznych lub naturalnych standardów wpływa na możliwości anali zy chromatograficznej toksyn. Kilka standardów toksyn jest dostarczanych przez firmy Sigma-Aldrich lub Calbiochem po dosyć wysokich cenach. Duży popyt przekracza jednak znacznie możliwości tych firm. Kolejnym problemem jest dobór fazy stacjonarnej, ruchomej oraz innych parametrów rozdziału chro
matograficznego. Mikrocystyny są peptydami o niskiej masie cząsteczkowej, wynoszącej ok. 1000 Da, trwałymi chemicznie podczas wzbogacania próbki oraz rozdziału chromatograficznego [41]. Jonizacja ich grup karboksylowych zachodzi przy pH 3,3-3,4 [33]. Edwards i in. wypróbowali kilka faz stacjonar nych C 18 do HPLC produkowanych przez różne firmy, często stosowanych do rozdzielania peptydów. Najlepszy rozdział mikrocystyn osiągnięto na kolum nach wypełnionych fazą Hyperprep HS BDS C 18 (rozmiar cząstek 8 (im,
646 P. GAJDEK
średnica porów 10 nm) firmy Shandon HPLC [40]. Do celów analitycznych stosuje się kolumny o długości od 150 do 300 mm oraz średnicy ok. 4 mm (najczęściej są to wymiary 250 mm oraz 4,6 mm). Fazę ruchomą stanowi za zwyczaj gradient acetonitrylu lub metanolu w wodzie. Wydajność chrom ato graficzna fazy ruchomej poprawia się znacznie przez dodanie np. TFA. Po zwala on na utrzymanie niskiego pH, przy którym wolne grupy karboksylowe w mikrocystynach są uprotonowane. Chociaż elucja gradientowa daje lepsze rezultaty, stosuje się jeszcze często warunki izokratyczne. Harada i in. [35] stosowali trzy izokratyczne fazy ruchome do rozdziału mikrocystyn: meta nol — 0,05% TFA (6:4), metanol — 0,05 M bufor fosforanowy (pH 3) (6:4) oraz metanol — 0,05 M siarczan sodu (1:1). Przykładowe fazy gradientowe to gradient acetonitryl — 0,05% TFA, pozwalająca na wyjątkowo dobry rozdział mikrocystyn [42], lub gradient acetonitryl — woda z dodatkiem 0,008 M oc tanu amonu [32],
Widma absorpcyjne roztworów mikrocystyn w zakresie nadfioletu wyka zują charakterystyczne pasmo z maksimum przy 238 nm, związane ze sprzężo nym układem wiązań podwójnych w ADDA. Jest ono dosyć intensywne, po nieważ np. współczynnik absorpcji molowej dla mikrocystyny-LR wynosi 39 800 [43]. W przypadku mikrocystyn zawierających tryptofan pojawia się drugie maksimum przy 222 nm [31], natomiast izomery geometryczne przy szóstym węglu w ADDA mają maksima absorpcji przy 242 nm oraz trochę mniejsze współczynniki absorpcji molowej [43]. Przy rozdziale chromatografi cznym pozwala to na zastosowanie detekcji spektrofotometrycznej w zakresie nadfioletu. W przypadku detekcji za pomocą standardowego spektrofotometru stosuje się zwykle pomiar przy 238 nm. Krokiem naprzód jest użycie diodowe go detektora spektrofotometrycznego (Diodę Array Detector — DAD), który umożliwia pomiar całego widma w zakresie np. 200-300 nm w każdej chwili rozdziału. Pozwala on na skuteczną identyfikację mikrocystyn na podstawie ich charakterystycznych widm absorpcyjnych oraz eliminację innych frakcji, czego nie można zrobić tak dobrze przy zastosowaniu detekcji przy pojedyn czej długości fali lub nawet kilku wybranych długościach fal [31], Układy HPLC-DAD produkowane przez różne firmy stały się obecnie niemal standar dem w analizie mikrocystyn. Użycie HPLC z detekcją spektrofotometryczną pozwala na detekcję toksyn w ilościach rzędu kilku nanogramów. Ogranicze niem metody jest objętość próbki nastrzykiwana jednorazowo na kolumnę analityczną. W analitycznych wersjach HPLC wynosi ona standardowo 20 pi. Jeżeli w jednym litrze analizowanej wody pitnej znajduje się 1 pg toksyny (norma WHO), to w objętości 20 pl jest jej zaledwie 20 pikogramów. Jest więc oczywiste, że próbka musi być wnześniej mniej więcej tysiąckrotnie zagęsz czona, co umożliwia jej wzbogacenie metodą SPE. Innym sposobem n a zwięk szenie czułości jest detekcja za pomocą spektrometru mas [44] lub też derywa- tyzacja toksyn i ich detekga za pomocą pomiaru fluorescencji [45] lub chemiluminescencji [46].
MIKROCYSTYNY SINIC 647 Scharakteryzowano widma masowe wielu mikrocystyn, otrzymane np. metodami ESIMS (Electrospray Ionisation Mass Spectrometry) [47] lub FABMS (Fast Atom Bombardment Mass Spectrometry) [48]. Cechą charak terystyczną widm masowych wszystkich mikrocystyn zawierających niezmody- fikowany łańcuch, będący częścią ADDA, jest charakter} styczne maksimum przy m/z 135 [49]. Kondo i in. oznaczali mikrocystyny w ilościach piko- gramowych za pomocą chromatografu cieczowego, sprzężonego ze spektro metrem mas [44], Detekcja masowa jest jednak wciąż zbyt kosztowna, szcze gólnie dla mniejszych laboratoriów [39]. Zamiast detekcji masowej można zastosować detekcję elektrochemiczną jako metodę uzupełniającą [50], Wy próbowano też SPE połączone w jeden układ z HPLC na zasadzie przełącza nia kolumn, co prowadzi m.in. do zwiększenia szybkości analizy (całkowity czas analizy próbki wody — 90 min) oraz zwiększa objętość próbki, która może być jednokrotnie analizowana [51].
Techniką komplementarną do HPLC jest elektroforeza kapilarna (CE —
Capillary Electrophoresiś). Bateman i in. [52] zastosowali tę technikę w kom
binacji ze spektrometrem mas do oznaczania mikrocystyn. Osiągnęli oni 0,2 pg/ml jako granicę detekcji mikrocystyny-LR tą metodą. Chromatografia cienkowarstwowa (TLC — Thin-Layer Chromatography) jest użyteczną tech niką w oznaczaniu mikrocystyn, chociaż wciąż niedocenianą. Aparatura do TLC jest względnie prosta i tania. Za pomocą tej techniki można oznaczać kilka próbek jednocześnie, a oczyszczanie próbki ma tutaj mniejsze znaczenie niż w przypadku HPLC. Użycie technik dwuwymiarowych pozwala na roz dział nieraz bardzo skomplikowanych mieszanin. Harada i in. [53] osiągnęli za pomocą TLC na żelu silikonowym przy użyciu faz ruchomych octan ety- lu-izopropanol-woda (4:3:7) lub chloroform-metanoł-woda (65:35:10), ok. 100 nanogramów jako granicę detekcji mikrocystyn. Ojanperä i in. [54] po trafili oznaczyć 10 pg mikrocystyny-LR na gram zliofilizowanych komórek sinic przy zastosowaniu ekstrakcji toksyn rozcieńczonym kwasem octowym, wzbogacania próbki przez SPE na RP-ODS oraz analizy za pomocą TLC na żelu silikonowym, przy zastosowaniu fazy ruchomej octan etylu-izopropa- nol-woda (9:6:5) oraz skaningowego detektora densytometrycznego.
Warto również wspomnieć o metodach nie pozwalających na rozdzielenie mieszaniny toksyn, ale niekiedy bardzo czułych. Zaproponowano np. metody analityczne pozwalające oznaczyć całkowitą zawartość toksyn. Są one oparte na tworzeniu kwasu 4-fenylo-3-metoksy-2-metylomasłowego jako produktu utleniania mikrocystyn metodą Lemieux (mieszaniną metanadjodanu sodu i nadmanganianu potasu) albo przez ozonolizę. Produkt ten jest następnie oznaczany jako ester metylowy przy użyciu chromatografu gazowego z płomie niowym detektorem jonizacyjnym albo z detektorem mas. Może on być rów nież derywatyzowany i oznaczany przy użyciu HPLC z detektorem fluorescen cyjnym w ilościach pikogramowych [55-57]. Metody tego typu mają jednak wiele słabych punktów. Toksyczność różnych odmian mikrocystyn nie jest
648 P. GAJDEK.
taka sama i całkowita zawartość ADDA nie jest wyznacznikiem toksyczności zakwitu. Poza tym wiele produktów degradacji mikrocystyn zawiera ADDA, co prowadzi do zawyżonego wyniku oznaczenia stężenia toksyn. Istnieje rów nież kilka odmian mikrocystyn, w których ADDA jest zmodyfikowany. Nie wiadomo, jak odmiany te zachowują się w sugerowanej procedurze analitycz nej. Bardzo czułe są również, nie omówione w tym artykule, metody biochemi czne (test hamowania aktywności fosfatazy proteinowej) lub immunologiczne (ELISA), pozwalające na detekcję mikrocystyn w zakresie pikogramów. Meto dy te są szybkie, ale mogą często prowadzić do fałszywych wyników. Mogą one mieć zastosowanie przy monitorowaniu wód [1, 3, 24].
UWAGI KOŃCOWE
Ze względu na opisane zagrożenia stacje uzdatniania wody oraz laborato ria zajmujące się analizą jakości wody pitnej w naszym kraju powinny posia dać możliwości oznaczania zawartości toksyn sinic w wodzie oraz ich usuwa nia lub degradacji w procesie uzdatniania wody. Warto się również zastanowić nad oznaczaniem toksyn sinic w wodzie wodociągowej dużych miast. Powinno się również szerzej niż dotąd informować społeczeństwo o niebezpieczeństwach związanych z zakwitami toksycznych sinic, czemu między innymi służy niniej szy artykuł.
Podziękowania
Dziękuję Panu mgr. Tadeuszowi Bochni za fachowe uwagi krytyczne oraz Panu dr. hab. Zbigniewowi Lechowskiemu za wprowadzenie w temat. Dziękuję również Fundacji na rzecz Nauki Polskiej za stypendium krajowe.
PIŚMIENNICTWO CYTOWANE
[1] K. S iv o n e n , Mycotoxins and Phycotoxins — Developments in Chemistry, Toxicology and
Food Safety, 1998, s. 547.
[2] M. R o g a ls k a -K u p ie c , T. B o ch n ia . Wiad. Botaniczne, 1998, 42, 11. [3] W. W. C h a r m ich a el, Adv. Botanical Res., 1997, 27, 211.
[4] K. S iv o n e n , Phycologia, 1996, 35, 12.
[5] W. W. C a rm ic h a e l, Scientific American, 1994, 270, 78. [6] M. T a r c z y ń sk a , M. Z a lew sk i, Gosp. Wodna, 1995, 4, 83.
[7] M. T a r c z y ń sk a , M. Z a le w sk i, Zintegrowana strategia ochrony i zagospodarowania ekosys
temów wodnych, „Biblioteka Monitoringu Środowiska”, Uniwersytet Łódzki 1994, s. 79.
[8] M. T a r c z y ń sk a , K. Iz y d o r c z y k , M. Z a le w sk i, Raport o stanie środowiska w wojewódz
twie sieradzkim w latach 1995-1996, „Biblioteka Monitoringu Środowiska”, Sieradz 1997,
s. 145.
M IK ROC YSTYN Y SINIC 649
czania substancji rakotwórczych w wodach, Państwowy Zakład Higieny, Warszawa, materia ły konferencyjne, 1997, 121.
[10] A. K. M. K a b z iń sk i, H. S ch o ll, S. D o m a g a ła . Biological Processes in Recultivation of
Lakes, Łódź 1995, s. 221.
[11] M. R. P rin se p , F. R. C aplan, R. E. M oore, G. M. L. P a tte r so n , R. E. H on k an en , A. L. B o y n to n , Phytochemistry, 1992, 31, 1247.
[12] K. L. R in eh a rt, M. N a m ik o sh i, B. W. C hoi. J. Appl. Phycology. 1994, 6, 159. [13] G. A. G od d, C. J. W ard, K. A. B e a ttie , S. G. B ell, The Phototrophic Prokaryotes, Kluwer
Akademie, New York 1999, 623.
[14] S. P ou ria, A. de A nd rad e, J. B arb osa, R. L. C a v a lca n ti, V. T. S. B arreto, C. J. Ward, W. P re ise r, G. K. P o o n , G. N. N eild , G. A. Codd, Lancet, 1998, 352, 21. [15] E. M. J o c h im se n , W. W. C a rm ic h a e l, J. An, D. M. C ardo, S. T. C o o k so n ,
C. E. M. H o lm e s, M. B. de C. A n tu n es, D. A. de M. F ilh o , T. M. L yra, V. S. T. B arreto, S. M. F. O. A z e v e d o , W. R. Jarvis, New Engl. J. Med., 1998, 338, 873.
[16] R. M. D a w so n , Toxicon, 1998, 36, 953.
[17] M. C raig, H. A. Luu, T. L. M cC read y, D. W illia m s, R. J. A n d ersen , C. F. B. H olm es, Biochem. Cell Biol., 1996, 74, 569.
[18] T. Abe, T. L a w to n , J. D. B. W eyers, G. A. C odd, New Phytologist, 1996, 133, 651. [19] G. A. C odd, J. S. M e tca lf, K. A. B e a ttie , Toxicon, 1999, 37, 1181.
[20] Y. U en o, S. N a g a ta , T. T su tsu m i, A. H a seg a w a , M. F. W ata n a b e, H.-D. Park, G.-C. C hen, G. C hen, S.-Z. Yu, Carcinogenesis, 1996, 17, 1317.
[21] P. G ajdek, Postępy Biol. Kom., 1999, 26, 743.
[22] T. W. L am b ert, C. F. B. H olm es, S. E. H rudey, Water Res., 1996, 30, 1411. [23] K. H im b erg, A.-M. K e ijo la , L. H iis v ir ta . H. P y y sa lo . K. S iv o n e n , Water Res., 1989,
23, 979.
[24] J. M e r ilu o to , A.-S. H ä r m ä lä -B r a sk e n , J. E r ik sso n , D. T o i v o la , T. L ind holm , Phycologia, 1996, 35, 125.
[25] L. Shi, W. W. C a rm ic h a e l, I. M ille r, Arch. Microbiol., 1955, 163, 7.
[26] M. F. W atan ab e, K. T suji, Y. W ata n a b e, K.-I. H arada, M. S u zu k i, Natural Toxins, 1992, 1, 48.
[27] M. Ikaw a, N. P h illip s , J. F. H an ey, J. J. Sasner, Toxicon, 1999, 37, 923.
[28] W. W. C a r m ic h a e l, P. R. G orham , The Water Environment. Algal Toxins and Health, Plenum Press, New York 1981, s. 161.
[29] M. M. W a ta n a b e, K. K aya, N. T ak am u ra, J. Phycology, 1992, 28, 761. [30] R. L. O liv er, J. Phycology, 1994, 30, 161.
[31] L. A. L a w to n , C. E d w ard s, G. A. C odd , Analyst, 1994, 119, 1525.
[32] G. J. Jon es, I. R. F a lc o m e r , R. M. W ilk in s, Environ. Toxicol. Water Qual., 1995,10,19. [33] C. R iv a sse a u , S. M a r tin s, M.-C. H e n n io n , J. Chromatogr. A, 1998, 799, 155. [34] R. J. W icks, P. G. T h iel, Environ. Sei. Techno]., 1990, 24, 1413.
[35] K.-I. H arada, K. M a tsu u ra , M. S u zu k i, H. Oka, M. F. W atan ab e, S. O ish i. A. M. D a h lem , V. R. B e a sle y , W. W. C arm ich a el, J. Chromatogr., 1988, 448, 275. [36] T. T r ish n a m u r th y , W. W. C a rm ic h a e l, E. W. Sarver, Toxicon, 1986, 24, 865. [37] K. T suji, S. N a it o , F. K o n d o , M. F. W atan ab e, S. Suzuki, H. N a k a z a w a , M. S u z u
ki, T. S h im a d a , K.-I. H arada, Toxicon, 1994, 32, 1251.
[38] M.-C. H e n n io n , V. P ic h o n , Environ. Sei. Technol., 1994, 28, 576. [39] J. M e r ilu o to , Anal. Chim. Acta, 1997, 352, 277.
[40] C. E dw ards, L. A. L a w to n , S. M. C o y le, P. R oss, J. Chromatogr. A, 1996, 734, 175. [41] K. T suji, S. N a it o , F. K o n d o , N. Ish ik a w a , M. F. W atan ab e, M. S uzuk i, K.-L
H arada, Environ. Sei. Technol., 1994, 28, 173.
[42] L. A. L aw ton , C. E d w ard s, K. A. B e a ttie , S. P le a sa n c e, G. J. D ear, G. A. Codd, Natural Toxins, 1995, 3, 50.
650 P. GAJDEK
[43] K.-I. H arada, K. M a tsu u r a , M. S u zu k i, M. F. W ata n a b e, S. O ish i, A. M. D ah lem , V. R. B e a sle y . W. W. C a rm ic h a e l, Toxicon. 1990. 28. 55.
[44] F. K o n d o , Y. Ik a i, H. O ka, H. M a tsu m o to , S. Y am ad a, N. Ish ik a w a , K. Tsuji, K.-I. H arad a, T. S h im ad a, M. O sh ik a ta , M. S u zu k i, Natural Toxins, 1995, 3, 41. [45] K.-I. H arad a, M. O sh ik a ta , T. S h im ad a, A. N a g a ta , N. Ish ik a w a , M. Suzuk i,
F. K o n d o , M. S h im izu , S. Y am ada, Natural Toxins, 1997, 5, 201.
[46] H. M u r a t a H. S h oji, M. O sh ik a ta . K.-I. H a r a d a M. S u z u k i, F. K o n d o , H. G oto, J. Chromatogr. A, 1995, 693, 263.
[47] M. Y uan, M. N a m ik o s h i, A. O tsu k i, K. L. R in eh a rt, K. S iv o n e n , M. F. W atan ab e, J. Mass Spectr., 1999, 34, 33.
[48] M. N a m ik o s h i, M. Y uan. K. S iv o n e n . W. W. C a rm ic h a e l, K. L. R in e h a r t, L. Rou- h ia in en , F. Sun, S. B r itta in , A. O tsu k i, Chem. Res. Toxicol., 1998, 11, 143. [49] F. K o n d o , Y. Ik ai, H. O ka, N. Ish ik a w a , M. F. W a ta n a b e, M. W atan ab e,
K. -I. H arada, M. S u zu k i, Toxicon, 1992, 30, 227.
[50] J. M e r ilu o to , B. K in ca id , M. R. Sm yth, M. W asb erg, J. Chromatogr. A, 1998,810,226. [51] H. S. L ee, C. K. J e o n g , H. M. L ee, S. J. C h o i , K. S. D o, K. Kim , Y. H. Kim,
J. Chromatogr. A, 1999, 848, 179.
[52] K. P. B atem an , P. T h ib a u lt, D. J. D o u g la s, R. L. W hite, J. Chromatogr. A, 1995, 712, 253.
[53] K L. H arad a, M. S u zu k i, A. M. D a h lem , V. R. B e a sle y , W. W. C a rm ic h a e l, K. L. R in e h a r t Jr., Toxicon, 1998, 26, 433.
[54] I. O jan p erâ, A. P ela n d er , E. V uori, K. H im b erg, M. W aris, K. N iin iv a a r a , J. Planar Chromatogr., 1995, 8, 69.
[55] T. S ano, K. N o h a r a , F. S h ir a ish i, K. K a y a Int. J. Environ. Anal. Chem., 1992, 49, 163. [56] K.-I. H arada, H. M urata, Z. Q ian g, M. S u zu k i, F. K o n d o , Toxicon, 1996, 34, 701. [57] K. K aya, T. S ano, Anal. Chim. Acta, 1999, 386, 107.
WIADOMOŚCI 200C. 54. 7-8
chemiczne p l i s s n 0043-5104