KATALITYCZNE DNA

Specyficzne sekwencyjnie jednoniciowe DNA mogą przyjmować struktury przestrzenne zdolne do selektywnego wiązania różnego typu cząsteczek, np. trombiny [28] czy ATP [44]. Te obserwacje zainspirowały badaczy do po­ szukiwania cząsteczek DNA wykazujących określone właściwości katalityczne, tzw. deoksyrybozymów. Pierwsze doniesienia dotyczyły hydrolizy wiązania fos- fodiestrowego w substratach RNA w obecności jonów metali P b +2 [10] lub Mg+2 [73], z szybkością 105 razy większą niż w reakcjach niekatalizowanych. Joyce wyselekcjonował 31-nt sekwencję DNA, która hydrolizuje w symulowa­ nych warunkach fizjologicznych wiązanie P—O w prawie każdym substracie RNA, rozpoznając substrat przez tworzenie par Watsona-Cricka [74, 75]. Pa­ rametry reakcji (stała szybkość reakcji w danym pH i obecność kofaktora) świadczą o deprotonacji grupy 2'-OH w obecności jonów metalu i w konse­ kwencji do hydrolizy wiązania intemukleotydowego. Enzym deoksyrybonukleo- tydowy zawiera 15-nt domenę katalityczną i dwie 8-nt domeny rozpoznania substratu RNA (rys. 9).

1 Substrat RNA 3' ---e ' Y R p --- 5' V G G A G Domena C C katalityczna T A deoksyrybozymu A A G C C T A Y = U lub C R = A lub G

Rys. 9. Sekwencja domeny katalitycznej deoksyrybozymu zdolnego do hydrolizy wiązania fos- fodiestrowego w cząsteczce RNA pomiędzy 5-R-Y-3', gdzie R = A lub G, a Y = U lub C [74, 75]

SELEKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH 633 Takie deoksyrybozymy użyto do zakończonej sukcesem degradacji syn­ tetycznych RNA, kodujących białka wirusa HIV-1 [76]. W tab. 4 podane są przykłady selekcji katalitycznych DNA. Ostatnio wykazano istnienie sekwencji DNA zdolnych do hydrolizy wiązania diestrowego chimerycznych oligonu- kleotydów w miejscu wprowadzenia pojedynczej jednostki rybonukleotydowej, otoczonej fragmentami deoksyrybonukleotydowymi w obecności lub bez ka­ tionów dwuwartościowych [77]. Wyselekcjonowano także DNA, którego ak­ tywność zależała od obecności jonów wapnia Ca+2 [78]. Ten katalityczny DNA przyspieszał reakcję hydrolizy wiązania fosforanowego chimery DNA-RNA około 1000 razy, podobnie jak rybozymy o strukturze głowy młot­ ka (ang. hammerhead) [88] lub o strukturze typu trzon-pętla [77].

Tabela 4. Przykłady selekcji in vitro oligodeoksyrybonukleotydów o właściwościach katalitycznych (deoksyrybozymów) Właściwości katalityczne wyselekcjonowanego RNA Białka wykazujące analogiczne właściwości katalityczne Piśmien­ nictwo

Hydroliza wiązania fosfodiestrowego w RNA (Pb+2) Rybonukleaza [10]

Hydroliza wiązania fosfodiestrowego w RNA (Mg+2) Zawiązywanie wiązania fosfodiestrowego DNA-DNA

Rybonukleaza [73]

(Zn+2/C u +2) Ligaza [82]

Melatacja porfiryn Ferrochelataza [66]

Hydroliza wiązania P—N w amidofosforanach DNA Fosforamidaza [80]

Hydroliza wiązania fosfodiestrowego w RNA (Mg+2) Hydroliza wiązania fosfodiestrowego w

chimerycz-Rybonukleaza [74]

nych RNA/DNA (Mg+2/C a+2) Nukleaza [77, 78]

Hydroliza wiązania fosfodiestrowego w DNA (Cu+2) Nukleaza (enzymy restrykcyjne) [81]

Znaleziono także sekwencję DNA mającą właściwości hydrolizy własnego szkieletu fosforanowego [79] lub amidofosforanowego [80] bądź szkieletu DNA nici komplementarnej [81]. Zastosowana tutaj strategia hybrydyzacji do form dupleksowych lub trypleksowych pozwoliła na specyficzną degradaqę wybranego wiązania fosfodiestrowego. Autorzy porównują funkcję wyselek­ cjonowanych deoksyrybozymów do funkcji enzymów restrykcyjnych. Spektrum aktywności katalitycznych DNA poszerzono także o zdolności ligacji dwóch fragmentów DNA [82]. Wyselekcjonowano także 47-nt sekwencję DNA, zdol­ ną w obecności jonów Zn+2 lub C u+2 do zawiązywania nowego wiązania fosfodiestrowego między oligonukleotydem zawierającym 3'-terminalną grupę fosfoimidazolidową a 5'-terminalną grupą hydroksylową sekwencji DNA za­ wierającej domenę katalityczną [82].

Te przykłady świadczą dobitnie o możliwościach selekcji in vitro w iden­ tyfikacji szerokiego spektrum sekwencji DNA, cechujących się określonymi właściwościami katalitycznymi. Odkrycie katalizatorów DNA ma szczególnie duże znaczenie w aspekcie względnie łatwej dostępności syntetycznych

oligo-634 B. NAWROT

nukleotydów DNA i ich wysokiej trwałości w porównaniu z innymi biopolime­ rami. Należy oczekiwać, że te cechy zwiększą aplikacyjność katalitycznych DNA jako potencjalnych terapeutyków oraz katalizatorów użytecznych w pro­ cesach chemicznych i biologicznych, a także w szerzej pojętych procesach tech­ nologicznych [83].

PODSUMOWANIE

Selekcja in vitro (SELEX) jest techniką pozwalającą z dużej puli sekwen­ cyjnie zróżnicowanych cząsteczek jednoniciowych RNA lub DNA izolować oligonukleotydy wykazujące określone właściwości fizyczne lub chemiczne. Dostępne techniki enzymatycznej amplifikacji kwasów nukleinowych (reakcja PCR, transkrypcja in vitro i odwrotna transkrypcja in vitro) umożliwiają wielo­ krotne powtarzanie procesu selekcji wobec cząsteczek docelowych, takich jak białka czy niskocząsteczkowe związki organiczne. Wynikiem tego procesu jest izolowanie aptamerów DNA i RNA, wiążących specyficznie do białek i innych niskocząsteczkowych ligandów, oraz kwasów nukleinowych o właściwościach katalitycznych. Metoda SELEX jest użytecznym narzędziem biologii moleku­ larnej, diagnostyki, medycyny molekularnej i chemii bioorganicznej.

PIŚMIENNICTWO CYTOWANE

[1] G. F. Joyce, Curr. Opin. Struct. Biol., 1994, 4, 331. [2] C. Tuerk, L. G old , Science, 1990, 249, 505.

[3] A. D. E llin g to n , J. W. S zo sta k , Nature, 1990, 346, 818. [4] D. L. R o b ertso n , G. F. Joyce, ibid., 1990, 344, 467. [5] J. R. L orsch, J. W. S zo sta k , ibid., 1994, 371, 31.

[6] E. H. E kland, J. W. S zo sta k , D. P. B a rtel, Science, 1995, 269, 364. [7] L. Jaeger, Curr. Opin. Struct. Biol., 1997, 3, 324.

[8] T. Pan, ibid., 1997, 1, 17.

[9] P. B u rgstaller, M. F am u lok , Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1995, 34, 1189. [10] R. R. Breaker, G. F. Joyce, Chem. BioL, 1994, 1[4], 223.

[11] K. Y. Wang, S. M cCardy, R. G. Shea, S. S w a m in a th a n , P. H. B o lto n , Biochemistry, 1993, 32, 1899.

[12] D. P. Bartel, J. W. S zo sta k , Science, 1993, 261, 1411. [13] L. E. O rgel, Trends Błochem. Sei., 1998, 491.

[14] P. J. U nrau, D. P. B artel, Nature, 1998, 395, 260. [15] M. Yarus, J. Mol. Evol., 1998, 47, 109.

[16] L. A. T h om p son , J. A. E llm an, Chem. Rev.j 1996, 96, 555. [17] J. M Burke, A. B erzal-H erran z, FASEB J„ 1993, 7, 106.

[18] D. J. K enan, D. E. T sai, J. D. K een e, Trends Biochem. Sei., 1994, 19, 57.

[19] R. K. S aik i, D. H. G elfand , S. S to ffe l, S. J. Scharf, R. H u g ih i, K. B. M ullis, H. A. E rlich, Science, 1988, 239, 487.

[20] M. Jungerm an, R. S łom sk i, Post. Bioch., 1990, 36, 14. [21] J. W rzesiń sk i, W. K r zy ż o sia k , ibid., 1990, 36, 21.

SELEKCJA KWASÓW NUKLEINOWYCH 635

[22] C. Tuerk, S. M a c D o u g a l, L. G old , Proc. Natl. Acad. Sei., 1992, 89, 6988.

[23] D. J. S ch n e id e r, J. F eig en , Z. H o sto m sk y , L. G old , Biochemistrv, 1995. 34, 9599. [24] H. C hen, D. G. M cB room , Y. Zhu, L. G old, T. W. N orth, ibid., 1996. 35, 6923. [25] R. Y a m am oto, S. T o y o ta , P. V ilja n en , K. M a c h id a S. N ish ik a w a , K. M urakam i,

K. T aira, P. K. Kum ar, Nucleic Acids Svmp. Ser., 1995, 34, 145.

[26] L. G iver, D. B artel, M. Zapp, G. B. T ak le, A. D. E llin g to n , Nucleic Acids Res 1993 21, 5509.

[27] M. A. L och rie, S. W augh, D. G. J. Pratt, J. C lever, T. G. P a rslo w , B. P o lisk y ibid 1997, 25, 2902.

[28] L. C. Bock, L. C. G riffin , J. A. L atham , E. H. V erm aas, J. J. T o o le Nature 1992 355 564.

[29] R. F. M acaya, P. S ch u ltze , F. W. Sm ith, J. A. Roe, J. F eig o n , Proc. Natl Acad Sei USA, 1993, 90, 3745.

[30] K. P a d m a n a b h a n , K. P. P ad m an ab h an , J. D. Ferrara, J. E. S adler, A T u lin sk v J. Biol. Chem., 1993, 268, 17651.

[31] E. H. B lack b u rn , Trends Biochem. Sei., 1991, 16, 378.

[32] K. N. M orris, K. B. Jensen, C. M. Julin, M. W eil, L. G old, Proc. Natl. Acad Sei USA 1998, 95, 2902.

[33] V. H o rn u n g , H.-P. H ofm ann. M. S prin zl, Biochemistry, 1998, 37, 7260.

[34] S. J. K lug, A. H ü tten h o fe r, M. K rom ayer, M. F am u lok , Proc. Natl. Acad Sei USA, 1997, 94, 6676.

[35] F. Z in o n i, J. H eid er, A. Bock, ibid., 1990, 87, 4660.

[36] A. K r a k o w ia k , M. K o z io lk ie w ic z , Post. Bioch., 1998, 44, 306.

[37] Y. Lin, D. N ie u w la n d t, A. M a g a lla n e z, B. F eistn er, S. D. J a y a sen a , Nucleic Acids Res., 1996, 24, 3407.

[38] K. A. D a v is, B. A bram s, Y. Lin, S. D. Jayasen a, ibid., 1996, 24, 702. [39] M. F a m u lo k , J. W. S zostak , J. Am. Chem. Soc., 1992, 114, 3990. [40] I. M a je rfeld , M. Yarus, Nature Struct. Biol., 1994, 1, 287.

[41] A. G eiger, P. B u rg sta ller , H. von der Eltz, A. R oeder, M. F a m u lo k , Nucleic Acids Res., 1996, 24, 1029.

[42] M. F a m u lo k , J. Am. Chem. Soc., 1994, 116, 1698. [43] M. S a ssa n fa r, J. W. S zo sta k , Nature, 1993, 364, 550. [44] D. E. H u ize n g a , J. W. S zo sta k , Biochemistry, 1995, 34, 656.

[45] D. K ig a , Y. F u tam u ra, K. S a k a m o to , S. Y ok oyam a, Nucleic Acids Res., 1998,26,1755. [46] M. G. W allis, U. von A hsen, R. S ch roed er, M. F am u lok , Chem. Biol., 1995, 2, 543. [47] Y. W. W ang, J. K illia n , H. H am asak i, R. F. R ando, Biochemistry, 1996, 35, 12338. [48] D. H. Burke, L. G old , Nucleic Acids Res., 1997, 25, 2020.

[49] J. R. L orsch , J. W. S zo sta k , Biochemistry, 1994, 33, 973. [50] Y. Li, R. G eyer, D. Sen, ibid., 1996, 35, 6911.

[51] G. F. Joyce, Nature, 1989, 338, 217.

[52] D. S ö ll, The RNA World, R. F. Gesteland, J. F. Atkins (red.), 1993, s. 157. [53] I. M a je rfeld , M. Y arus, RNA, 1998, 4, 471.

[54] R. D. J en iso n , S. C. G ill, A. P ard i, B. P o lisk y , Science, 1994, 263, 1425.

[55] G. R. Z im m erm an n , R. D. Jen iso n , C. L. Wick, J. P. Sim orre, A. Pardi, Nature Struct. Biol., 1997, 4, 644.

[56] F. Jian g, R. A. K um ar, R. A. Jon es, D. J. P atel, Nature, 1996, 382, 183. [57] T. D iec k m a n n , E. Suzuki, G. K. N akam ura, J. F eig o n , RNA, 1996, 2, 628. [58] Y. Y ang, M. K o c h o y a n , P. B u rg sta ller , E. W esth of, M. F am u lok , Science, 1996, 272,

1343.

[59] M. E gli, Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36, 480.

[60] L. G o ld , D. B row n, Y. Y. He, T. S h ta tla n d , B. S. Singer, Y. Wu, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 1997, 94, 59.

636 B. NAWROT

[61] T. R. Cech, Science, 1987, 236, 1532. [62] L. E. O rgel, Scient. Am., 1994, 271, 76.

[63] X. D. D ai, A. D. M esm aek er, G. F. Joyce, Science, 1995, 267, 237. [64] T. M. T arasow , S. L. T arasow , B. E. E aton , Nature, 1997, 389, 54.

[65] M. M. C onn, J. R. P ru d en t, P. G. S ch u ltz, J. Am. Chem. Soc., 1996, 118, 7012. [66] Y. Li D. Sen, Nat. Struct. Biol., 1996, 3, 743.

[67] M. Illa n g a se k a r e , G. S anchez, T. N ic k le s, M. Y arus, Science, 1995, 267, 643. [68] P. L ohse, J. W. S zo sta k , Nature, 1996, 381, 442.

[69] B. Zhang, T. R. Cech, Chem. Biol., 1998, 10, 539.

[70] J. R. P ru dent, T. U no, P. G. S ch u ltz, Science, 1994, 264, 1924. [71] M. C. W right, G. F. Joyce, ibid., 1997, 276, 614.

[72] M. P. R o b e rtso n , A. D. E llin g to n , Cuit. Biol., 1997, 7, R376. [73] R. R. Breaker, G. F. Joyce, Chem. Biol., 1995, 2, 655.

[74] S. W. S an toro, G. F. Joyce, Biochemistry, 1997, 94, 4262. [75] S. W. S a n to ro , G. F. Joyce, ibid., 1998, 37, 13330.

[76] T. K uw abara, M. W arashin a, T. T an abe, K. T ani, S. A san o, K. T aira, Nucleic Acids Res., 1997, 25, 3074.

[77] D. F aulham m er, M. F am u lok , J. Mol. Biol., 1997, 269, 188.

[78] D. F au lh am m er, M. F am u lok , Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1996, 35, 2837. [79] N. Carmi, L. A. S h u ltz, R. R. B reaker, Chem. Biol., 1996, 3, 1039.

[80] J. B u rm eister, G. K ie d r o w sk i, A. D. E llin g to n , Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1997, 36, 1321.

[81] N. Carmi, R. B. S h am eelah , R. R. B reaker, Biochemistry, 1998, 95, 2233. [82] B. C uenou d, J. W. S zo sta k , Nature, 1995, 375, 611.

[83] M. W arashin a, T. K u w abara, Y. N a k a m a tsu , K. T aira, Chem. Biol., 1999, 6, 237. [84] S. P. H ale, P S ch im m el, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1996, 93, 2755.

[85] G. J. C o n n ell, M. Yarus, Science, 1994, 264, 1137.

[86] P. B u rg sta ller, M. F a m u lo k , Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 1994, 33, 1084. [87] S. A. Shub, Curr. Opin. Genet. Dev., 1991, 1, 478.

[88] J. H. Yang, J. P. P erreau lt, D. Labuda, N. U sm an, R. C ed ergren , Biochemistry, 1990, 29, 11156.

[89] B. S eelin g , A. Jâschk e, Chem. Biol., 1999, 6, 167.

[90] M. Chee, R. Yang, E. H u b b ell, A. B erno, X. C. H u ang, D. Stern, J. W in kler, D. J. L ock h art, M. S. M orris, S. P. F o d o r , Science, 1996, 274, 610.

[91] S. R. M irm ira, I. T in o c o , Jr., Biochemistry, 1996, 35, 7664.

[92] Baza danych Medline, National Library of Medicine, National Institutes of Health, USA, luty 2000.

[93] L. L. L ebruska, L. J. M ah er 3rd, Biochemistry, 1999, 38, 3168.

WIADOMOŚCI

chemiczne p l i s s n 0043-5104

MIKROCYSTYNY SINIC