V. METODYKA BADAŃ
5.5. Metodyka oznaczania 17-β estradiolu za pomocą testu Elecsys Estradiol II
17β-estradiol oznaczano za pomocą metody elektrochemiluminescencji „ECLIA” na analizatorze Cobas e 601 z zastosowaniem zestawu do ilościowego oznaczania in vitro 17β-estradiolu w surowicy ludzkiej. Metoda ta jest metodą kompetycyjną stosującą swoiste przeciwciało poliklonalne skierowane przeciwko 17β-estradiolowi. Uwolniono z próbki przez mesterolon endogenny estradiol współzawodniczy z dodaną, znakowaną kompleksem rutenu, pochodną estradiolu o miejsca wiązania na biotynylowanym przeciwciale.
5.5.1. Przygotowanie materiału
Materiał biologiczny pobrano od pacjentek w 1, 14 i 21 dniu cyklu miesiączkowego za pomocą zestawów aspiracyjno – próżniowych zgodnie z wymaganiami producenta systemów do pobierania krwi. Surowica po odwirowaniu została jednokrotnie zamrożona i przechowywana w temperaturze -70oC. Próbki z widocznym zmętnieniem, widocznymi strontami po odmrożeniu ponownie wirowano. Przed oznaczeniem surowica, kalibratory i surowice kontrolne doprowadzono do temperatury 20-25oC. Oznaczenia po tym procesie dokonano na analizatorze w ciągu 2h.
5.5.2. Aparatura i akcesoria dodatkowe
Oznaczenia wykonano na analizatorze Cobas e 601 firmy Roche Diagnostics. Do analizatorów typu MODULAR ANALYTICS E170, cobas e 601 stosowano następujące, specyficzne akcesoria:
• PreciControl Universal do sporządzenia 2 x 3 ml z PreciControl Universal1 i 2 lub
• PreciControl Universal, do sporządzenia 2 x 3 ml z PreciControl Universal 1 i 2
• PreciControl Universal, do sporządzenia 2 x 3 ml PreciControl Universal 1 i 2 • ProCell M - 2 x 2 l bufor systemowy
• CleanCell M - 2 x 2 l płyn płuczący
• 12 pojemników do wstępnego podgrzania ProCell M i CleanCell M przed użyciem
• ProbeWash M - 12 x 70 ml roztwór myjący do płukania podczas finalizacji i zmiany odczynnika
• PreClean M - 5 x 600 ml płyn myjący mieszaninę reakcyjną przed detekcją • AssayCups/AssayTips Combimagazine M - 48 x 84 naczynka
reakcyjne/końcówki, torby na zużyte materiały • WasteLiner, torby na zużyte materiały
• SysClean Adapter M.
Akcesoria do wszystkich analizatorów:
• Elecsys SysClean - 5 x 100 ml płyn czyszczący • Elecsys SysClean - 5 x 100 ml płyn czyszczący.
5.5.3. Odczynniki - roztwory robocze
Do oznaczeń stosowano dwa rodzaje roztworów:
M – mikrocząsteczki opłaszczone streptawidyną w objętości 6,4 ml, a także
konserwant, który stanowiły mikrocząsteczki opłaszczone streptawidyną w stężeniu 0,72 mg/ml
R1 – przeciwciała przeciwko estradiolowi znakowane biotyną w objętości 8 ml,
a także konserwant, w skład którego wchodziły biotynylowane poliklonalne przeciwciała przeciwko estradiolowi w stężeniu 45 ng/ml: mesterolon 130 ng/ml, bufor MES 50 nmol/l o pH 6,0
R2 – pochodna estradiolu znakowana kompleksem rutenu Ru (bpy32+), a także konserwant, w skład którego wchodziła pochodna estradiolu znakowana kompleksem rutenu w stężeniu 2,75 ng/ml oraz bufor MES 50 nmol/l o pH 6,0
Odczynniki stanowiły całość gotową do użycia, przechowywano w temperaturze 2-8oC. Wszystkie dane niezbędne do przeprowadzenia oznaczenia zapisano w postaci kodu kreskowego odpowiednio dla danego odczynnika.
Stabilność zestawów wynosiła:
Zamknięte, przechowywane w temperaturze 2-8oC – do ustalonej przez producenta daty ważności odczynnika
Po otwarciu odczynnika w temperaturze 2-8oC – do 12 tygodni
Na pokładzie analizatora – do 8 tygodni.
5.5.4. Kalibracja metody
Metodę standaryzowano wobec ID – GC/MS (chromatografia gazowa z izotopowym rozcieńczeniem/ spektrofotometria masowa). Wzorcową krzywą kalibracyjna dostosowywano do danego analizatora przy użyciu Elecsys Estradiol II CalSet II. Wszystkie dane kalibracyjne dla danej serii odczynników umieszczonych w każdym zestawie zapisano w postaci kodu kreskowego. Każdorazowo kalibrację przeprowadzano dla nowej serii odczynnika w ciągu 24h od umieszczenia go na pokładzie analizatora. W przypadku stosowania tej samej serii odczynnika ponowną kalibrację stosowano po upływie 1 miesiąca (28 dniach). W przypadku stosowania na analizatorze tego samego zestawu odczynnikowego ponowną kalibrację wykonywano po 7 dniach. Ponowną kalibrację stosowano również w przypadku odchyleń tj. np., gdy wyniki kontroli jakości wykraczały poza ustalone zakresy [Thienpont et al. 1988].
5.5.5. Kontrola jakości metody
Do przeprowadzania kontroli jakości stosowano odczynniki kontrolne dostarczone przez producenta analizatora Elecsys PreciControl Universal 1 i 2. Kontrole dla różnych zakresów stężeń przeprowadzano równolegle do próbek badanych, co najmniej w odstępach 24 – godzinnych, raz dla danego zestawu kalibracyjnego, a także po każdej serii odczynnika. Częstotliwość i zakres kontroli dostosowano do wymogów laboratorium. Uzyskane wartości mieściły się w granicach odchylenia 2S. W przypadku odchyleń poza dopuszczalne zakresy stosowano wdrożone procedury naprawcze.
5.5.6. Granice i zakresy pomiarowe
Zakres pomiarowy dla metody wyznaczony był przez dolną granicę wykrywalności oraz najwyższy punkt krzywej wzorcowej i wynosił 18,4 – 15781 pmol/l. Wartości poniżej dolnej granicy wykrywalności podawane były jako <18,4 pmol/l lub < 5,00 pg/ml po zastosowaniu przelicznika (analizator automatycznie dokonywał obliczeń stężenia badanej substancji w materiale biologicznym w jednostkach pmol/l; pg/ml; ng/l lub dodatkowo nmol/l zgodnie ze współczynnikiem przeliczeniowym:
pmol/l x 0,273 = pg/ml pg/ml x 3,67 = pmol/l.
Za dolną granicę wykrywalności (czułość analityczna) przyjęto najniższe stężenie substancji, które można odróżnić od zera, obliczane jako wartość powyżej dwóch odchyleń standardowych najniższego wzorca (kalibrator wzorcowy, wzorzec 1 + 2 OS, badanie powtarzalności, n = 21).
Wartości powyżej zakresu pomiarowego podano jako > 15781 pmol/l lub >4300 pg/ml.
Czułość funkcjonalna, czyli najniższe stężenie oznaczanej substancji, mierzone w powtórnych oznaczeniach ze współczynnikiem zmienności precyzji pośredniej pomiędzy seriami ≤ 20% wynosiło 44 pmol/L (12pg/ml).
5.5.7. Precyzja
Precyzję określono w oparciu o odczynniki Elecsys, zlewkową surowicę ludzką oraz próbki kontrolne zgodnie z modyfikowanym protokołem Clinical and Laboratory Standards Institute.
5.5.8. Oznaczenie i zasada testu
W celu optymalnego dokonania oznaczenia zastosowano się do zaleceń producenta analizatora. Odczynniki wymagane do oznaczeń, po wyjęciu z lodówki doprowadzano do temperatury 20oC i umieszczano w rotorze odczynnikowym analizatora unikając tworzenia piany. Analizator automatycznie kontrolował temperaturę odczynników na pokładzie, ich otwieranie i zamykanie.
Całkowity czas wykonania oznaczenia przez analizator wynosił 18 min. Podczas 1 inkubacji antygen próbki (35 l) tworzył kompleks immunologiczny ze swoistym dla estradiolu biotynylowanym przeciwciałem. Ilość powstałego kompleksu zależna była od stężenia oznaczanej substancji w próbce. Podczas 2 inkubacji cały kompleks wiązał się z fazą stałą dzięki reakcji biotyny ze streptawidyną. Po dodaniu mikrocząsteczek opłaszczonych streptawidyną i pochodnej estradiolu znakowanej kompleksem rutenu. Dotychczas wolne miejsca biotynylowanych przeciwciał były zajmowane z utworzeniem kompleksu przeciwciało – hapten. Następnie mieszanina reakcyjna przenoszona była do komory pomiarowej, gdzie mikrocząsteczki przyciągane były do powierzchni elektrody za pomocą magnesu, a następnie niezwiązane substancje usuwane były za pomocą buforu ProCell. Napięcie przyłożone do elektrody indukowało reakcję chemiluminescencji i emisję fotonu mierzoną za pomocą fotopowielacza. Wyniki odczytywano za pomocą krzywej kalibracyjnej przygotowanej dla danego analizatora w oparciu o kalibrację 2 – punktową oraz krzywą wzorcową zawartą w kodzie kreskowym odczynnika [ Lichtenberg et al. 1992].