Metodyka oznaczania hormonu folikulotropowego za pomocą testu Elecsys FSH 73

Hormon folikulotropowy oznaczano za pomocą metody elektrochemiluminescencji „ECLIA” na analizatorze Cobas e 601 z zastosowaniem zestawu do ilościowego oznaczania in vitro stężenia FSH surowicy ludzkiej.

Metoda Elecsys FSH wykorzystuje przeciwciała monoklonalne skierowane przeciwko ludzkiemu FSH. Reakcje krzyżowe z LH, TSH, hCG, hGH i hPL są nieistotne.

5.3.1. Przygotowanie materiału

Materiał biologiczny pobrano od pacjentek w 1, 14 i 21 dniu cyklu miesiączkowego za pomocą zestawów aspiracyjno – próżniowych zgodnie z wymaganiami producenta systemów do pobierania krwi. Surowicę po odwirowaniu jednokrotnie zamrożono i przechowywano w temperaturze -70oC. Próbki z widocznym zmętnieniem, widocznymi strontami po odmrożeniu podlegały ponownemu wirowaniu. Przed oznaczeniem surowicę, kalibratory i surowice kontrolne doprowadzono do temperatury 20-25oC. Oznaczenie po tym procesie zostało dokonane na analizatorze w ciągu 2h.

5.3.2. Aparatura i akcesoria dodatkowe

Oznaczenia wykonano na analizatorze Cobas e 601 firmy Roche Diagnostics. Do analizatorów typu MODULAR ANALYTICS E170, cobas e 601 stosowano następujące, specyficzne akcesoria:

• FSH CalSet II, do sporządzenia 4 x 1 ml

• PreciControl Universal, do sporządzenia 2 x 3 ml PreciControl Universal 1 i 2 • ProCell M - 2 x 2 l bufor systemowy

• CleanCell M - 2 x 2 l płyn płuczący

• PC/CC- Cups, 12 pojemników do wstępnego podgrzania ProCell M i CleanCell M przed użyciem

• ProbeWash M - 12 x 70 ml roztwór myjący do płukania podczas finalizacji i zmiany odczynnika

• PreClean M, 5 x 600 ml płyn myjący mieszaninę reakcyjną przed detekcją • AssayCups/AssayTips Combimagazine M – 48 x 84 naczynka

reakcyjne/końcówki, torby na zużyte materiały • WasteLiner, torby na zużyte materiały

• SysClean Adapter M.

Akcesoria do wszystkich analizatorów:

• Elecsys SysClean - 5 x 100 ml płyn czyszczący.

5.3.3. Odczynniki - roztwory robocze

Do oznaczeń stosowano dwa rodzaje roztworów:

M – mikrocząsteczki opłaszczone streptawidyną w objętości 6,5 ml, a także

konserwant, który stanowiły mikrocząsteczki opłaszczone streptawidyną w stężeniu 0,72 mg/ml

R1 – przeciwciała przeciwko FSH znakowane biotyną w objętości 10 ml, a także

konserwant, w skład którego wchodziły biotynylowane monoklonalne przeciwciała przeciwko anty-FSH w stężeniu 0,5 mg/l: bufor MES 50 mmol/l; pH 6,0; konserwant

R2 – przeciwciała anty-FSH znakowane kompleksem rutenu Ru (bpy3²⁺), a także monoklonalne przeciwciała (mysie) anty-FSH znakowane kompleksem rutenu 0,8 mg/l, bufor MES 50 mmol/l, pH 6,0; konserwant.

Odczynniki, które stanowiły całość gotową do użycia przechowywano w temperaturze 2-8oC. Wszystkie dane niezbędne do przeprowadzenia oznaczenia zapisano w postaci kodu kreskowego odpowiednio dla danego odczynnika.

Stabilność zestawów wynosiła:

 Zamknięte, przechowywane w temperaturze 2-8^oC – do ustalonej przez producenta daty ważności odczynnika

 Po otwarciu odczynnika w temperaturze 2-8^oC – do 12 tygodni

5.3.4. Kalibracja metody

Metoda standaryzowana była wobec Enzymun – Test FSH. Enzymun – Test FSH standaryzowany był wobec 2nd IRP WHO Referene Standard 78/ 549. Wzorcowa krzywa kalibracyjna była dostosowywana do danego analizatora przy użyciu Elecsys FSH CalSet II. Wszystkie dane kalibracyjne dla danej serii odczynników umieszczonych w każdym zestawie zapisano w postaci kodu kreskowego. Każdorazowo kalibrację była przeprowadzano dla nowej serii odczynnika w ciągu 24h od umieszczenia go na pokładzie analizatora. W przypadku stosowania tej samej serii odczynnika ponowną kalibrację była stosowano po upływie 1 miesiąca (28 dniach). W przypadku stosowania na analizatorze tego samego zestawu odczynnikowego ponowną kalibrację wykonywano była po 7 dniach. Ponowną kalibrację stosowano również w przypadku odchyleń tj. np., gdy wyniki kontroli jakości wykraczały poza ustalone zakresy [Thienpont et al. 1988].

5.3.5. Kontrola jakości metody

Do przeprowadzania kontroli jakości stosowane były odczynniki kontrolne dostarczone przez producenta analizatora Elecsys PreciControl Universal 1 i 2. Kontrole dla różnych zakresów stężeń przeprowadzano równolegle do próbek badanych, co najmniej w odstępach 24 – godzinnych, raz dla danego zestawu kalibracyjnego, a także po każdej serii odczynnika. Częstotliwość i zakres kontroli dostosowano do wymogów laboratorium. Uzyskane wartości mieściły się w granicach odchylenia 2S. W przypadku odchyleń poza dopuszczalne zakresy stosowane były wdrożone procedury naprawcze.

5.3.6. Granice i zakresy pomiarowe

Zakres pomiarowy dla metody wyznaczony był przez dolną granicę wykrywalności oraz najwyższy punkt krzywej wzorcowej i wynosił 0,100 – 200 mlU/ml. Wartości poniżej dolnej granicy wykrywalności podawane były, jako <100 mlU/ml.

Za dolną granicę wykrywalności (czułość analityczna) przyjęto najniższe mierzalne stężenie oznaczanej substancji, które można odróżnić od zera, obliczane jako wartość powyżej dwóch odchyleń standardowych najniższego wzorca (kalibrator wzorcowy, wzorzec 1 + 2 OS, badanie powtarzalności, n = 21).

Wartości powyżej zakresu pomiarowego podawano jako > 200 mlU/ml.

5.3.7. Precyzja

Precyzję określono w oparciu o odczynniki Elecsys, zlewkowaną surowicę ludzką oraz próbki kontrolne zgodnie z modyfikowanym protokołem Clinical and Laboratory Standards Institute.

5.3.8. Oznaczenie i zasada testu

W celu optymalnego dokonania oznaczenia należy stosowano się do zaleceń producenta analizatora. Odczynniki wymagane do oznaczeń, po wyjęciu z lodówki doprowadzano do temperatury 20o – 25o C, umieszczano w rotorze odczynnikowym analizatora unikając tworzenia piany. Analizator automatycznie kontrolował temperaturę odczynników na pokładzie, ich otwieranie i zamykanie.

Całkowity czas wykonania oznaczenia przez analizator wynosił 18 min. Podczas 1 inkubacji antygen próbki (40 l) tworzył kompleks immunologiczny typu sandwicz z biotynylowanymi monoklonalnymi przeciwciałami swoistymi dla FSH oraz monoklonalnymi przeciwciałami swoistymi dla FSH znakowanymi kompleksem rutenu. Podczas 2 inkubacji po dodaniu mikrocząsteczek opłaszczonych streptawidyną kompleks wiązał się z fazą stałą dzięki powinowactwu biotyny i streptawidyny. Następnie mieszanina reakcyjne przenoszona była do komory pomiarowej, w której mikrocząsteczki przyciągane były do powierzchni elektrody za pomocą magnesu. Niezwiązane substancje usuwane były za pomocą buforu ProCell. Napięcie przyłożone

do elektrody indukowało reakcję chemiluminescencji i emisję fotonu, mierzoną za pomocą fotopowielacza.

Wyniki odczytywano z krzywej kalibracyjnej przygotowanej dla analizatora w oparciu o kalibrację dwupunktową oraz krzywą wzorcową zawartą w kodzie kreskowym odczynnika.

5.4. Metodyka oznaczania hormonu luteinizującego za