Metodyka oznaczania progesteronu za pomocą testu Elecsys Progestrone II

Progesteron oznaczano za pomocą metody elektrochemiluminescencji „ECLIA” na analizatorze Cobas e 601 z zastosowaniem zestawu do ilościowego oznaczania in vitro stężenia progesteronu surowicy ludzkiej. Metoda ta jest metodą kompetycyjną.

5.6.1. Przygotowanie materiału

Materiał biologiczny pobrano od pacjentek w 1, 14 i 21 dniu cyklu miesiączkowego za pomocą zestawów aspiracyjno – próżniowych zgodnie z wymaganiami producenta systemów do pobierania krwi. Surowicę po odwirowaniu jednokrotnie zamrożono i przechowywano w temperaturze -70oC. Próbki z widocznym zmętnieniem, widocznymi strontami po odmrożeniu podlegały ponownemu wirowaniu. Przed oznaczeniem surowicę, kalibratory i surowice kontrolne doprowadzono do temperatury 20-25oC. Oznaczenia po tym procesie dokonano na analizatorze w ciągu 2h.

5.6.2. Aparatura i akcesoria dodatkowe

Oznaczenia wykonano na analizatorze Cobas e 601 firmy Roche Diagnostics. Do analizatorów typu MODULAR ANALYTICS E170,cobas e 601 stosowano następujące, specyficzne akcesoria:

• Progesterone II CalSet II, do sporządzenia 4 x 1 ml

• PreciControl Universal, do sporządzenia 2 x 3 ml PreciControl Universal 1 i 2 • Elecsys Diluent Estradiol/Progesteron, 2 x 22ml rozcieńczalnika próbek • ProCell M - 2 x 2 l bufor systemowy

• 12 pojemników do wstępnego podgrzania ProCell M i CleanCell M przed użyciem

• ProbeWash M - 12 x 70 ml roztwór myjący do płukania podczas finalizacji i zmiany odczynnika

• PreClean M - 5 x 600 ml płyn myjący mieszaninę reakcyjną przed detekcją • AssayCups/AssayTips Combimagazine M - 48 x 84 naczynka

reakcyjne/końcówki, torby na zużyte materiały • WasteLiner, torby na zużyte materiały

• SysClean Adapter M.

Akcesoria do wszystkich analizatorów:

Elecsys SysClean - 5 x 100 ml płyn czyszczący.

5.6.3. Odczynniki - roztwory robocze

Do oznaczeń stosowano dwa rodzaje roztworów:

M – mikrocząsteczki opłaszczone streptawidyną w objętości 6,5 ml, a także

konserwant, który stanowią mikrocząsteczki opłaszczone streptawidyną w stężeniu 0,72 mg/ml

R1 – przeciwciała przeciwko progesteronowi znakowane biotyną w objętości

10 ml, a także konserwant, w skład którego wchodzą biotynylowane monoklonalne przeciwciała przeciwko progesteronowi w stężeniu 15 mg/l: bufor fosforanowy 25 mmol/l; pH 7,0; konserwant

R2 – pochodna progesteronu znakowana kompleksem rutenu Ru (bpy3²⁺), a także konserwant, w skład którego wchodzi progesteron pochodzenia roślinnego połączony z syntetycznym peptydem znakowanym kompleksem rutenu w stężeniu 10 ng/ml oraz bufor fosforanowy25 mmol/l o pH 7,0.

Odczynniki stanowiły całość gotową do użycia, były przechowywane w temperaturze 2-8oC. Wszystkie dane niezbędne do przeprowadzenia oznaczenia zapisano w postaci kodu kreskowego odpowiednio dla danego odczynnika.

Stabilność zestawów wynosiła:

 Zamknięte, przechowywane w temperaturze 2-8^oC – do ustalonej przez producenta daty ważności odczynnika

 Po otwarciu odczynnika w temperaturze 2-8^oC – do 12 tygodni

 Na pokładzie analizatora – do 8 tygodni.

5.6.4. Kalibracja metody

Metodę standaryzowano wobec ID – GC/MS (chromatografia gazowa z izotopowym rozcieńczeniem/ spektrofotometria masowa). Wzorcową krzywą kalibracyjną dostosowywano do danego analizatora przy użyciu Elecsys Progesterone II CalSet II. Wszystkie dane kalibracyjne dla danej serii odczynników umieszczonych w każdym zestawie zapisano w postaci kodu kreskowego. Każdorazowo kalibrację przeprowadzano dla nowej serii odczynnika w ciągu 24h od umieszczenia go na pokładzie analizatora. W przypadku stosowania tej samej serii odczynnika ponowną kalibrację była stosowano po upływie 1 miesiąca (28 dniach). W przypadku stosowania na analizatorze tego samego zestawu odczynnikowego ponowną kalibrację wykonywano po 7 dniach. Ponowną kalibrację stosowano również w przypadku odchyleń tj. np., gdy wyniki kontroli jakości wykraczały poza ustalone zakresy [Thienpont et al.1988].

5.6.5. Kontrola jakości metody

Do przeprowadzania kontroli jakości stosowane były odczynniki kontrolne dostarczone przez producenta analizatora Elecsys PreciControl Universal 1 i 2. Kontrole dla różnych zakresów stężeń były przeprowadzane równolegle do próbek badanych, co najmniej w odstępach 24 – godzinnych, raz dla danego zestawu kalibracyjnego, a także po każdej serii odczynnika. Częstotliwość i zakres kontroli była dostosowana do wymogów laboratorium. Uzyskane wartości mieściły się w granicach odchylenia 2S. W przypadku odchyleń poza dopuszczalne zakresy stosowano wdrożone procedury naprawcze.

5.6.6. Granice i zakresy pomiarowe

Zakres pomiarowy dla metody wyznaczony był przez dolną granicę wykrywalności oraz najwyższy punkt krzywej wzorcowej i wynosił 0,095 – 191 nmol/l. Wartości poniżej dolnej granicy wykrywalności podawane były jako <0,095 nmol/l lub < 0,030 ng/ml po zastosowaniu przelicznika (analizator automatycznie dokonywał obliczeń stężenia badanej substancji w materiale biologicznym w jednostkach pmol/l; pg/ml; ng/l lub dodatkowo nmol/l zgodnie z współczynnikiem przeliczeniowym:

nmol/l x 0,314 = ng/ml ng/ml x 3,18 = nmol/l).

Za dolną granicę wykrywalności (czułość analityczna) przyjęto najniższe stężenie substancji, które można było odróżnić od zera, obliczane jako wartość powyżej dwóch odchyleń standardowych najniższego wzorca (kalibrator wzorcowy, wzorzec 1 + 2 OS, badanie powtarzalności, n = 21).

Wartości powyżej dolnej granicy wykrywalności podano jako > 191 nmol/l lub >60,0 ng/ml.

Czułość funkcjonalna, czyli najniższe stężenie oznaczanej substancji, mierzone w powtórnych oznaczeniach ze współczynnikiem zmienności precyzji pośredniej pomiędzy seriami ≤ 20% wynosiło 48 nmol/L (12 pg/ml).

5.6.7. Precyzja

Precyzję określono w oparciu o odczynniki Elecsys, zlewkowaną surowicę ludzką oraz próbki kontrolne zgodnie z modyfikowanym protokołem Clinical and Laboratory Standards Institute.

5.6.8. Oznaczenie i zasada testu

W celu optymalnego dokonania oznaczenia zastosowano się do zaleceń producenta analizatora. Odczynniki wymagane do oznaczeń, po wyjęciu z lodówki doprowadzano do temperatury 20o – 25o C, umieszczano w rotorze odczynnikowym analizatora unikając tworzenia piany. Analizator automatycznie kontrolował temperaturę odczynników na pokładzie, ich otwieranie i zamykanie.

Całkowity czas wykonania oznaczenia przez analizator wynosił 18 min. Podczas 1 inkubacji 30 l próbki inkubowane było z danazolem w celu uwolnienia progesteronu. Inkubacja zachodziła w obecności biotynylowanego monoklonalnego przeciwciała swoistego dla progesteronu oraz jego pochodnej znakowanej kompleksem rutenu. Progesteron w próbce konkurował ze znakowaną pochodną progesteronu o miejsca wiązania na przeciwciele. Podczas 2 inkubacji po dodaniu mikrocząsteczek opłaszczonych streptawidyną kompleks wiązał się z fazą stałą dzięki powinowactwu biotyny i sterptawidyny. Ilość znakowanej pochodnej progesteronu związanej z fazą stałą była odwrotnie proporcjonalna do zawartości progesteronu w próbce. Mieszanina reakcyjna przenoszono do komory pomiarowej, gdzie mikrocząsteczki przyciągane były do powierzchni elektrody za pomocą magnesu. Niezwiązane substancje usuwane były za pomocą buforu. Napięcie przyłożone do elektrody indukowało reakcję chemiluminescencji i emisję fotonu, która była mierzona przy pomocy fotopowielacza. Wyniki odczytywano z krzywej kalibracyjnej przygotowanej dla analizatora w oparciu o kalibrację 2-punktową oraz krzywą wzorcową zawartą w kodzie kreskowym odczynnika.