Renata Bączek-Kwinta
Katedra Fizjologii Roślin, Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja w Krakowie
Wstęp
Stres oksydacyjny, czyli nadprodukcja aktywnych form tlenu do których za-liczany jest nadtlenek wodoru, zawsze towarzyszy stresowi chłodowemu. Chłodo-odporność jest cechą zaleŜną od wielu przystosowań, zarówno anatomicznych, jak i fizjologiczno-biochemicznych. Rośliny chłodoodpornych genotypów gatunków chłodowraŜliwych wykazują zatem (między innymi) zdolność do uaktywniania systemu antyoksydacyjnego, czyli do syntezy i (lub) aktywacji określonych przeciwutleniaczy.
WaŜnymi enzymatycznymi przeciwutleniaczami - zmiataczami H2O2 są katalaza i peroksydaza askorbinianowa [HODGES i in. 1997; BĄCZEK-KWINTA i in. 2005].
Katalaza (CAT) jest enzymem obecnym w mitochondriach, peroksysomach i apoplaście [FEIERABEND 2005]. Charakteryzuje się wysoką aktywnością molekularną, sięgającą 5 mln cząsteczek substratu przekształconych w ciągu 1 minuty [KĄCZKOWSKI
1987]. CAT przejawia takŜe aktywność peroksydazową, dzięki której katalizuje utlenianie alkoholi, chinonów, mrówczanu i azotynów. Peroksydaza askorbinianowa (APX) występuje w postaci izoform plastydowych, mitochondrialnych, cytozolowych i mikrosomalnych [MITTLER,POULOS 2005]. Powinowactwo APX do jej substratu jest duŜo większe niŜ powinowactwo katalazy. MoŜliwe jest zatem przejmowanie roli izoform katalaz przez róŜne izoformy APX [DE GARA i in. 2000; FATH i in. 2001].
Według standardowych procedur pomiarowych, ze względu na konieczność zapewnienia optymalnego przebiegu reakcji, analizy aktywności APX i CAT naleŜy przeprowadzić w temperaturze 25°C [NAKANO, ASADA 1981; AEBI 1984]. W praktyce stosuje się temperaturę 20-25°C, często po prostu temperaturę pokojową. Rodzi się zatem pytanie: czy aktywność enzymów badana w takich warunkach (in vitro) pozwala na prawidłową ocenę aktywności ujawniającej się in vivo, temperaturze chłodowej?
MoŜna wyrazić obawę, iŜ aktywności enzymów wyznaczone w temperaturze wyŜszej od aktualnie panującej w czasie wegetacji (np. 5°C) nie odzwierciedlają
„rzeczywistych” aktywności. W związku z tym wnioskowanie dotyczące relacji pomiędzy genotypami podczas chłodzenia moŜe zostać zaburzone. Większość białek enzymatycznych charakteryzuje się bowiem zróŜnicowaną wraŜliwością na temperaturę, która wpływając na oddziaływania wewnątrzcząsteczkowe, zmienia konformację tych protein, a co się z tym wiąŜe - ich aktywność. Podczas działania chłodu lub mrozu na rośliny, aktywność poszczególnych enzymów in vivo znacznie odbiega od wartości uzyskanych in vitro - w wyŜszej temperaturze i przy znacznie
R. Bączek-Kwinta 46
większym, niŜ ma to miejsce w tkankach, pomiarowym stęŜeniu substratu. Dlatego niektórzy badacze postulują stosowanie temperatury pomiarowej równej temperaturze wegetacji lub doń zbliŜonej [HUNER i in. 1993; LEIPNER,STAMP 1999] albo wykonywanie oznaczeń aktywności enzymu w duŜym zakresie temperatur [HAKAM, SIMON 1996].
Natomiast badanie w temperaturze chłodowej parametrów kinetyki reakcji katalizowanej przez określone białko moŜe pozwolić na uzyskanie odpowiedzi na pytanie, czy przyczyną spadku aktywności enzymu jest zmniejszone powinowactwo enzymu do substratu (w tym przypadku nadtlenku wodoru), wywołane na przykład zmianami konformacyjnymi części białkowej.
W związku z powyŜszym celem doświadczeń było ustalenie bezpośredniego wpływu temperatury pomiaru (5 lub 20°C) na aktywność enzymów rozkładających nadtlenek wodoru w liściach form mieszańcowych. Uwzględniono aktywność zarówno konstytutywną, jak i ujawniającą się podczas chłodu. Wybrano genotypy o ustalonej, zróŜnicowanej chłodoodporności [BĄCZEK-KWINTA,KOŚCIELNIAK 2003]. Zbadano ponadto niektóre parametry kinetyki reakcji enzymatycznej katalizowanej przez CAT w nadziei na poznanie przyczyny niŜszej aktywności tego enzymu u mieszańca wraŜliwego na temperaturę chłodową w porównaniu z odpornym. Relacje takie wykazano w pracach prowadzonych przez BĄCZEK-KWINTĘ [2002] oraz BĄCZEK-KWINTĘ iKOŚCIELNIAKA
[2003].
Materiał i metody
Materiał roślinny
Nasiona badanych genotypów kukurydzy (KOC 9431 i K103 X K85) pochodziły z firmy „Nasiona Kobierzyc”. Ziarniaki zaprawione zaprawą nasienną T (50-procentowy Thiuram) wysiano po 10 sztuk do plastikowych wazonów o pojemności 5 dm3, z podłoŜem o składzie torf + gleba brunatna + piasek (proporcja objętościowa 3 : 2 : 1). Wegetację wstępną prowadzono w klimatyzowanej szklarni, przy fotoperiodzie 15/9 godz. (dzień/noc). Do momentu skiełkowania ustalono temperaturę 20°C, następnie utrzymywano termoperiod 20°C/17°C (dzień/noc). Wilgotność względna powietrza (RH) wynosiła około 60%, oświetlenie około 500 µmol(kwantów)⋅m-2⋅s-1. W dni pochmurne rośliny doświetlano lampami matalohalogenkowymi. Niezbędne do wegetacji makro- i mikroskładniki dostarczano roślinom od momentu wykształcenia przez nie trzeciego liścia, w postaci poŜywki Hoaglanda stosowanej w ilości zapewniającej osiągnięcie polowej pojemności wodnej gleby. W momencie osiągnięcia przez rośliny fazy trzeciego liścia (z pojawiającym się liściem czwartym), materiał przeniesiono do komór wegetacyjnych o temperaturze 5°C. Utrzymywano poprzedni fotoperiod, RH i poziom oświetlenia.
Oznaczenia aktywności enzymów antyoksydacyjnych wykonywano na próbkach pochodzących z trzeciego liścia, utrwalonych w ciekłym azocie. W kaŜdym przypadku jeden liść stanowił jedno powtórzenie biologiczne. Oznaczenia dla kaŜdej grupy prowadzono w pięciu powtórzeniach biologicznych, a dla kaŜdej próbki w dwóch powtórzeniach instrumentalnych. Stałość temperatury podczas pomiarów (5 lub 20°C) zapewniono wykorzystując termostatowany pokój laboratoryjny.
Izolacja enzymów
Po rozdrobnieniu w ciekłym azocie i rozmroŜeniu, tkanki homogenizowano przy pomocy homogenizatora elektrycznego (prod. Ultraturrax, Ika Labortechnik, Niemcy), w 0,05 mol⋅dm-3 buforze fosforanowym o pH 7,0 z dodatkiem 0,5% albuminy (BSA;
CZY TEMPERATURA POMIARU AKTYWNOŚCI PEROKSYDAZY ... 47 prod. SIGMA) i 0,1 mmol⋅dm-3 EDTA (prod. SIGMA). Homogenat odwirowano przy 10000 g przez 3 minuty, w temperaturze 4°C. Do dalszej procedury uŜyto nadsączu (supernatantu) (0,6 ml), który umieszczono w nitrocelulozowych woreczkach i dializowano przez 6 godzin na mieszadle magnetycznym, w buforze fosforanowym z dodatkiem 0,1 mmol⋅dm-3 EDTA, w 4°C. Dializaty przeniesiono do probówek Eppendorfa i przechowywano w lodzie podczas pomiarów oraz aktywności APX i CAT oraz zawartości białka. W przypadku oznaczeń aktywności APX do buforów ekstrakcyjnego i dializacyjnego dodano kwasu askorbinowego (AsA; prod. POCh) w ilościach zapewniających utrzymanie stęŜenia 0,5 mmol⋅dm-3 tego związku, niezbędnego do podtrzymania aktywności enzymu [ASADA 1992].
Oznaczenia aktywności enzymów
Aktywność peroksydazy askorbinianowej wyznaczono według NAKANO i ASADY
[1981]. Podczas kolejnych etapów przygotowania próbek roślinnych do pomiaru stosowano dodatek AsA, uzyskując jego stęŜenie w buforach równe 0,5 mmol⋅dm-3. Po przystąpieniu do analiz aktywności próbki poddano 5-minutowej inkubacji ze zbuforowanym roztworem AsA. Po dodaniu roztworu H2O2 (o stęŜeniu 0,1 mmol⋅dm-3) i szybkim wymieszaniu składników rozpoczęto pomiar przy λ = 290 nm, przez 2 minuty. W obliczeniach wykorzystano wartość molowego współczynnika ekstynkcji ε = 2,8 mmol⋅cm-1 . Dla kaŜdej próbki wykonano takŜe pomiary kinetyki mające na celu obliczenie poprawek uwzględniających utlenianie askorbinianu: nieenzymatyczne przy udziale H2O2 i enzymatyczne (przy braku H2O2) przez oksydazę askorbinianową (EC 1.10.3.3.). Aktywność katalazy i parametry kinetyki reakcji enzymatycznej CAT mierzono spektrofotometrycznie wg zmodyfikowanej metody AEBI’EGO [1984]. Łączna objętość odczynników w kuwecie pomiarowej wynosiła 3 ml. Mieszaninę reakcyjną stanowiły: bufor fosforanowo-potasowy o pH 7,0 (0,05 mol⋅dm-3) oraz roztwór H2O2 (0,54 mol⋅dm-3) w tym buforze. Składniki dokładnie wymieszano i wstrzyknięto 25-200 µl supernatantu roślinnego, ponownie wymieszano roztwory i przez 2 minuty mierzono spadek absorbancji przy 240 nm, w temperaturze 20°C. Stałą Michaelisa (Km) i maksymalną szybkość reakcji enzymatycznej (Vmaks.) wyznaczono na podstawie graficznego ujęcia zaleŜności szybkości rozkładu H2O2 od jego stęŜenia, przy stałym (zawartym w danej próbce roślinnej) stęŜeniu enzymu. PosłuŜono się modelem Line-weavera-Burka. Zastosowano cztery stęŜenia H2O2: 0,108; 0,054; 0,027 i 0,014 mol⋅dm-3, przy których wykonano pomiary kinetyki reakcji dla kaŜdej próbki roślinnej. Maksymalną szybkość enzymu uzyskano przy stęŜeniu 0,108 mol⋅dm-3. Oznaczenia wykonywano w dwóch temperaturach: 20°C i 5°C. Aktywność enzymatyczną APX i CAT dla kaŜdej próbki roślinnej odniesiono do ilości obecnego w niej białka.
Zawartość białek rozpuszczalnych oznaczono metodą BRADFORD [1976]. Wynik odniesiono do krzywej kalibracyjnej sporządzonej dla albuminy z osocza krwi bydlęcej (BSA).
Analiza statystyczna wyników
Dla kaŜdej serii danych składających się na średnią arytmetyczną przepro-wadzono badanie normalności rozkładu próby testem Kołmogorowa-Smirnowa. W przypadku wartości procentowych i logarytmowanych dokonano przekształcenia według wzoru: y = arcsin√x. Jednorodność wariancji zbadano testem Levene’a.
Istotność statystyczną wpływu stosowanego czynnika eksperymentalnego na badane parametry oceniono na podstawie analizy wariancji (ANOVA) w układzie całkowicie
R. Bączek-Kwinta 48
losowym. Szczegółowej oceny róŜnic pomiędzy poszczególnymi średnimi wykonano stosując testy: t-Studenta lub Manna-Whitney’a przy porównaniu dwóch średnich oraz test Duncana przy porównywaniu trzech średnich.
Wyniki
NiezaleŜnie od termicznych warunków wegetacji siewek (przed chłodzeniem lub w jego trakcie), zastosowanie temperatury pomiaru 5oC wywołało silne zmniejszenie aktywności peroksydazy askorbinianowej (APX) w porównaniu z aktywnością uzyskaną w temperaturze 20°C (rys. 1A).
Tabela 1; Table 1 Analiza wariancji dla aktywności peroksydazy askorbinianowej (APX),
katalazy (CAT) oraz siły kinetycznej CAT, zaleŜnie od temperatury wegetacji siewek (5 i 20°C) i temperatury pomiarów reakcji enzymatycznych (5 i 20°C). Podano wartości statystyki F;
prawdopodobieństwo oznaczono ** dla p < 0,01; * dla p < 0,05;
oraz jako r.n. (róŜnica nieistotna) dla p > 0,05
Analysis of variance for the activity of APX, CAT and kinetic power of CAT, in response to vegetation temperature (5 and 20°C) and the measurement temperature
(5 and 20°C). The values of F statistics are given; the probability is marked ** for p < 0.01; * for p < 0.05; and n.s.
(difference not significant) for p > 0.05
CZY TEMPERATURA POMIARU AKTYWNOŚCI PEROKSYDAZY ... 49
Analiza wariancji wykazała, Ŝe temperatura pomiaru była jedynym istotnym staty-stycznie źródłem zmienności aktywności APX (tab. 1). Stwierdzono, Ŝe ten właśnie czynnik doświadczenia nie wchodził w interakcję z pozostałymi, a wśród nich takŜe z chłodowraŜliwością genotypu. Aktywności APX określone w 5°C stanowiły średnio dla siewek chłodzonych i niechłodzonych mieszańca KOC (chłodoodpornego) około 51,5%, a dla K103 x K85 (chłodowraŜliwego) 53,6% aktywności uzyskanej w 20°C (tab. 2). ObniŜenie temperatury pomiaru spowodowało zatem u obu mieszańców podobne hamowanie aktywności APX.
Tabela 2; Table 2 Aktywność APX i CAT w liściach mieszańców kukurydzy,
oznaczona w 6. dniu chłodzenia, przy temperaturze pomiaru 5°C, wyraŜona w procentach aktywności mierzonej w temperaturze 20°C.
p- prawdopodobieństwo braku róŜnic aktywności względnej mieszańców przy danej temperaturze wegetacji według testu Manna-Whitney’a
Activity of APX and CAT in leaves of maize hybrids, assayed on the 6th day of chilling,
at the measurement temperature of 5°C, expressed as the percentage of activity assayed at 20°C. p- probability of the lack of difference among the hybrid
and a given vegetation temperature, according to the Mann-Whitney test
Enzym aktywności APX (rys. 1B). Analiza wariancji wykazała, Ŝe interakcje temperatury pomiaru aktywności CAT zarówno z temperaturą wegetacji siewek jak i genotypem (w tym przypadku - chłodowraŜliwością) nie wywarły istotnego wpływu na tę aktywność (tab. 1). Wartość badanego parametru, wyznaczanego w 5°C (tab. 2) spadła w relacji do temperatury pomiarowej 20°C u siewek obu mieszańców. Zatem niezaleŜnie od temperatury pomiarów (5 i 20°C) oraz temperatury wegetacji, aktywność CAT była istotnie wyŜsza u roślin genotypu odpornego niŜ u chłodowraŜliwego.
Stwierdzono, Ŝe maksymalna szybkość reakcji rozkładu H2O2 (Vmaks.) przez CAT była w trzech na cztery przypadki niŜsza podczas pomiarów przeprowadzonych w 5°C niŜ w 20°C (tab. 3), ale analiza wariancji nie potwierdziła istotności statystycznej tych róŜnic (dane nieprzedstawione). Przyczyną była prawdopodobnie wysoka zmienność w obrębie uzyskanych danych, o czym świadczą wysokie wartości odchylenia standardowego (tab. 3). Poprzez analizę wariancji wykazano natomiast, Ŝe interakcje temperatury pomiaru zarówno z genotypem jak i z temperaturą wegetacji siewek nie
R. Bączek-Kwinta 50
wywarły istotnego wpływu na Vmaks. (dane nie przedstawione). Z kolei siła kinetyczna (Vmaks./Km) wyznaczona dla katalazy była niŜsza w temperaturze pomiaru 5°C niŜ w 20°C o średnio 1/3 (tab. 1, 3). Podobnie jednak do Vmaks., interakcje temperatury pomiaru zarówno z genotypem jak i z temperaturą wegetacji nie wpływały na wartości siły kinetycznej CAT (tab. 1). Wykazano jednak, Ŝe była ona nawet 3-krotnie wyŜsza w liściach mieszańca odpornego (KOC 9431) w porównaniu z chłodoodpornym (K103 x K85; tab. 1, 3).
Tabela 3; Table 3 Wpływ temperatury pomiaru i temperatury wegetacji
na parametry kinetyki reakcji CAT w liściach mieszańców kukurydzy, przed chłodzeniem siewek i w 6. dniu chłodzenia (5°C).
Wartości średnie obejmują 5 powtórzeń biologicznych ± odchylenie standardowe The influence of the measurement and vegetation temperature
on the parameters of CAT kinetics in leaves of maize hybrid, assayed before chilling and on the 6th day of chilling (5°C).
Means for 5 biological replicates ± standard deviation Parametr
20 0,029±0,009 0,041±0,029 0,012±0,003 0,049±0,021
5 0,021±0,008 0,025±0,013 0,012±0,006 0,011±0,006 Vmaks./Km
(dm3⋅min-1)
20 0,98±0,20 1,23±0,74 0,76±0,38 0,65±0,42
5 0,86±0,23 0,65±0,52 0,54±0,40 0,23±0,18
CZY TEMPERATURA POMIARU AKTYWNOŚCI PEROKSYDAZY ... 51
Rys. 1. Wpływ temperatury pomiaru (5°C i 20°C) na aktywność peroksydazy askorbi-nianowej (APX; A) i katalazy (CAT; B) w liściach mieszańców kukurydzy, przed chłodzeniem i po 6 dniach chłodu. Prezentowane wartości są średnimi z 5 powtórzeń biologicznych. Statystyka: por. z tabelą 1
Fig. 1. The influence of the measurement temperature (5°C and 20°C) on the activity of ascorbate peroxidase (APX; A) and catalase (CAT; B) in leaves of maize hybrids, before chilling and on the 6th day of chilling. Presented values are the means for 5 biological replicates. For stastistics, compare with Table 1
Dyskusja
Przedstawione dane uprawniają do stwierdzenia, Ŝe bez względu na termiczne warunki wegetacji siewek (5 lub 20°C), temperatura pomiaru (równieŜ 5 lub 20°C) nie deformuje wzajemnych proporcji aktywności APX i CAT w liściach badanych mieszańców. Oznacza to, Ŝe aktywność APX nie zaleŜy od chłodowraŜliwości genotypu, w przeciwieństwie do CAT, a zaleŜność tę moŜna wykazać niezaleŜnie od temperatury pomiaru.
Kolejne wnioski moŜna wysnuć w przypadku parametrów kinetyki reakcji CAT.
Tak więc w badaniach chłodoodporności maksymalna szybkość reakcji (Vmaks) nie jest dobrym wyznacznikiem reakcji enzymatycznej katalizowanej przez CAT w przeciwieństwie do siły kinetycznej (Vmaks./Km). Zgodnie z opinią wielu biochemików, stała Michaelisa Km, wykorzystywana często w badaniach biochemicznych jako bezpośrednia miara wydajności katalitycznej enzymu, jest oceniana jako nieefektywna przy tak niskich wartościach stęŜenia substratu, jakie występują w liściach. W związku z tym często proponuje się zastosowanie Vmaks./Km do określania wydajności katalitycznej enzymów in vivo [CORNISH-BOWDEN 1976; FERSHT 1985; PATTERSON,GRAHAM
1987].
Znacznie wyŜsze wartości Vmaks./Km uzyskane w liściach chłodoodpornego mieszańca kukurydzy skłaniają do wnioskowania, Ŝe w tym przypadku pojedyncze
R. Bączek-Kwinta 52
cząsteczki katalazy są zdolne do bardziej wydajnego rozkładu H2O2 (w obu tem-peraturach wegetacji i pomiaru) niŜ w liściach mieszańca chłodowraŜliwego. MoŜna przypuszczać, iŜ przyczyną wolniejszego tempa hamowania aktywności CAT w chłodzie u odpornego mieszańca KOC 9431 jest zwiększone (w relacji do wraŜliwego) powinowactwo enzymu do jego substratu, związane być moŜe z mniejszym stopniem proteolitycznej degradacji. Kolejna moŜliwość to bardziej skuteczna ekspresja genów CAT. W związku z tym wydaje się waŜne, Ŝe niektóre czynniki środowiskowe, takie jak podwyŜszone stęŜenie CO2 wywierają ochronny wpływ na siewki kukurydzy poprzez łagodzenie hamowania aktywności CAT wywołanej chłodem, co wykazano w pracy BĄCZEK-KWINTY iKOŚCIELNIAKA [2003]. Aktywność tego enzymu wydaje się zatem być powiązana z chłodoodpornością.
Wnioski
1. Aktywność katalazy w liściach chłodoodpornego genotypu kukurydzy jest wyŜsza niŜ w przypadku chłodowraŜliwego, niezaleŜnie od temperatury pomiaru.
Aktywności peroksydazy askorbinianowej nie moŜna natomiast powiązać z chłodowraŜliwością.
2. Aktywność katalazy oraz jej siła kinetyczna (Vmaks./Km) mogą być wyznacz-nikami chłodoodporności kukurydzy przydatnymi w badaniach ekofizjologi-cznych.
Literatura
AEBI H. 1984. Catalase in vitro. Meth. Enzymol. 105: 121-126.
ASADA K. 1992. Ascorbate peroxidase - a hydrogen peroxide-scavenging enzyme in plants. Physiol. Plant. 85: 235-241.
BĄCZEK-KWINTA R. 2002. Uszkodzenia chłodowe i aktywność wybranych antyoksydan-tów siewek kukurydzy w róŜnych warunkach środowiska. Rozprawa doktorska, Wydział Rolniczo-Ekonomiczny Akademii Rolniczej w Krakowie.
BĄCZEK-KWINTA R., KOŚCIELNIAK J. 2003. Anti-oxidative effect of elevated CO2 con-centration in the air on maize hybrids subjected to severe chill. Photosynthetica 41:
161-165.
BĄCZEK-KWINTA R.,NIEWIADOMSKA E.,MISZALSKI Z. 2005. Physiological role of reactive oxygen species in chill-sensitive plants. Phyton. Ann. Rei Bot. 45: 25-37.
BRADFORD M. 1976. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72: 248-254.
CORNISH-BOWDEN A.1976. Principles of enzyme kinetics. Wyd. Butterrworths, Londyn.
DE GARA L.,PACIOLLA C.,DE TULLIO M.C.MOTTO M.,ARRIGONI O. 2000. Ascorbate-de-pendent hydrogen peroxide detoxification and ascorbate regeneration during germi-nation of a highly productive maize hybrid: Evidence of an improved detoxification mechanism against reactive oxygen species. Physiol. Plant. 109: 7-13.
FATH A.,BETHKE P.C.,JONES R.L. 2001. Enzymes that scavenge reactive oxygen species are down-regulated prior to gibberelic acid-induced programmed cell death in barley aleurone. Plant Physiol. 126: 156-166.
FEIERABEND J. 2005. Catalases in plants: molecular and functional properties and role in
CZY TEMPERATURA POMIARU AKTYWNOŚCI PEROKSYDAZY ... 53 stress defence, w: Antioxidants and reactive oxygen species in plants. Smirnoff N.
(Red.): 101-140. Blackwell Publishing.
FERSHT A. 1985. Enzyme structure and mechanism. W.H. Freeman and Company: Nowy Jork: 105-106.
HAKAM N.,SIMON J-P. 1996. Effect of low temperatures on the activity of oxygen-sca-venging enzymes in two populations of the C4 grass Echinochloa crus-galli. Physiol.
Plant. 97: 209-216.
HODGES D.M., ANDREWS C.J., JOHNSON D.A., HAMILTON R.I. 1997. Antioxidant enzyme responses to chilling stress in differentially sensitive maize inbred lines. J. Exp. Bot. 48:
1105-1113.
HUNER N.P.A.,ÖQUIST G.,HURRY V.M.,KROL M.,FALK S.,GRIFFITH M. 1993. Photosyn-thesis, photoinhibition and low temperature acclimation in cold tolerant plants. Pho-tosynth. Res. 37: 19-39.
KĄCZKOWSKI J. 1987. Biochemia roślin. PWN, Warszawa: 81 ss.
LEIPNER J.,STAMP P. 1999. Effect of chilling temperature on reactive oxygen formation and defence systems in maize leaves. Crop Development for Cool and Wet Climates of Europe, COST-814. M. Sánchez-Díaz, J.J. Irigoyen, J. Aguirreolea, K. Pithan (Eds).
Luxembourg: Office for Official Publications in the European Countries: 99-106.
MITTLER R.,POULOS T.L. 2005. Ascorbate peroxidase, w: Antioxidants and reactive oxygen species in plants. Smirnoff N. (Red.), Blackwell Publishing: 101-140.
NAKANO Y.,ASADA K. 1981. Hydrogen peroxide is scavenged by ascorbate-specific per-oxidase in spinach chloroplasts. Plant Cell Physiol. 22: 867-880.
PATTERSON B.D., GRAHAM D. 1987. Temperature and metabolism. Biochemistry of plants. Davies D.D. (Ed.), Academic Press, Nowy Jork 12: 153-199.
Słowa kluczowe: APX, CAT, kukurydza, chłodowraŜliwość, kinetyka reakcji enzymatycznej
Streszczenie
Podczas działania niskich temperatur na rośliny, aktywność poszczególnych enzymów in vivo znacznie odbiega od wartości uzyskanych in vitro w wyŜszej stan-dardowej temperaturze. W związku z tym celem pracy było ustalenie wpływu temperatury pomiaru (5 lub 20°C) na aktywność enzymów rozkładających nadtlenek wodoru - peroksydazy askorbinianowej (APX) i katalazy (CAT). Badano aktywność w liściach roślin form mieszańcowych kukurydzy o zróŜnicowanej chłodoodporności rosnących w temperaturze 20 i 5°C.
Stwierdzono, Ŝe niezaleŜnie od temperatury pomiaru, aktywności APX nie moŜna powiązać z chłodowraŜliwością roślin, natomiast aktywność CAT w liściach okazów chłodoodpornego genotypu kukurydzy jest o około 1/3 wyŜsza niŜ w przypadku chłodowraŜliwego. W związku z tym aktywność CAT i niektóre parametry kinetyki tej aktywności (tzw. siła kinetyczna - Vmaks./Km) mogą być zastosowane w badaniach chłodoodporności kukurydzy.
IS THE MEASUREMENT OF TEMPERATURE
OF ASCORBATE PEROXIDASE AND CATALASE ACTIVITY ABLE TO DISTURB THE ESTIMATION OF CHILING SENSITIVITY OF MAIZE?
R. Bączek-Kwinta 54
Renata Bączek-Kwinta
Department of Plant Physiology, Agricultural University, Kraków
Key words: APX, CAT, maize, chiling sensitivity, enzyme kinetics
Summary
While plants were subjected to low temperature on plants, the activity of individual enzymes in vivo differd a lot than that obtained in vitro, at a higher standard temperature. Therefore the aim of the work was to establish the influence of the measurement temperature (5 or 20°C) on the activity of the enzymes that decompose hydrogen peroxide - ascorbate peroxidase (APX) and catalase (CAT). The activity in leaves of maize hybrid plants of differentiated chilling-sensitivity grown at 20 and 5°C was studied.
It was established that, irrespectively to the measurement temperature, the activity of APX cannot be related to the chilling sensitivity of plants, whereas CAT activity in leaves of the specimens of the chill-resistant maize genotype is higher (of ca. 1/3) than that of chill-sensitive. Hence, catalase activity and some parameters of its kinetics (the so-called kinetic power, Vmax/Km) may be applied in the studies on the chill resistance of maize.
Dr inŜ. Renata Bączek-Kwinta Katedra Fizjologii Roślin
Akademia Rolnicza im. H. Kołłątaja ul. PodłuŜna 3
30-239 KRAKÓW
e-mail: rrbaczek@cyf-kr.edu.pl
ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2008 z. 524: 55-61