NA WZROST I ROZWÓJ Clematis pitcheri in vitro
1Eleonora Gabryszewska, Ludwika Kawa-Miszczak, ElŜbieta Węgrzynowicz-Lesiak, Marian Saniewski
Zakład Fizjologii i Morfogenezy Roślin Ozdobnych, Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa w Skierniewicach
Wstęp
Clematis pitcheri tak jak i inne powojniki jest pnączem o silnym wzroście wydłuŜeniowym. Większość gatunków i odmian powojników charakteryzuje się silną dominacją wierzchołkową i trudno uzyskać rozwój pędów bocznych w kulturach in vitro. U Clematis integrifolia L. zastosowanie cytokinin(BAP, kinetyna 2iP) bardziej stymulowało wzrost pędu głównego i róŜnicowanie węzłów niŜ indukcję pędów bocznych [DĄBSKI, PARZYMIES 2006]. RównieŜ u innych pnączy mnoŜonych in vitro obserwowano dominację pędu głównego i trudności z krzewieniem: Hedera canariensis [AL-JUBOORY i in. 1991], Vitis rotundifolia [SUDARSONO,GOLDY 1991] i Dipladenia sanderi HEMSL.[WOJTANIA i in. 2006].
U roślin rozmnaŜanych in vitro stwierdzono oddziaływanie róŜnego poziomu azotu i/lub węgla w procesie regeneracji i namnaŜania pędów [CABOCHE 1987;SHIMASAKI, UEMOTO 1990;CAO i in. 2003;OGURA,OKUBO 2003;HUANG, OKUBO 2005; OGURA-TSUJITA, OKUBO 2006]. Ostatnio prowadzone badania wskazują na współdziałanie węgla i azotu w regulacji procesów metabolicznych oraz wzrostu i rozwoju roślin [PRICE i in. 2004;
GIBSON 2005; ROLLAND i in. 2006]. Zaproponowano model, według którego geny związane z metabolizmem węgla i azotu są regulowane na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego poprzez sygnały węgla i azotu [CORUZZI, BUSH 2001; CORUZZI, ZHOU 2001]. Stwierdzono takŜe udział azotanów w regulacji genów związanych z metabolizmem glukozy, co wskazuje na obecność mechanizmu koordynującego metabolizm węgla i azotanów [GIBSON 2005].
Wykazano równieŜ regulacyjną rolę cukru w procesie rozwoju roślin - od fazy juwenilnej, poprzez fazę dojrzałą, kwitnienie do starzenia [GIBSON 2005].
Celem badań było określenie wpływu zróŜnicowanego poziomu C i N oraz tem-peratury na wzrost i rozwój pędów Clematis pitcheri rosnących in vitro.
1 Badania były finansowane przez MNiI, grant nr 2P06R 03429.
Materiał i metody
Doświadczenia przeprowadzono na wierzchołkowych fragmentach pędów (2-3 węzłowe) Clematis pitcheri pochodzących z rozmnaŜania in vitro. Eksplantaty
E. Gabryszewska i inni 74
umieszczano na poŜywce podstawowej MURASHIGE i SKOOGA [1962] zawierającej meta-topolinę 0,2 mg⋅dm-3. Stosowano poŜywkę zestaloną agarem - pH 5,6. Badano wpływ zróŜnicowanego poziomu C i N w poŜywce na wzrost i rozwój pędu głównego oraz pędów bocznych powojnika. Jako źródło egzogennego węgla stosowano sacharozę w stęŜeniu: 10 i 30 g⋅dm-3. Natomiast źródłem azotu był róŜny poziom soli azotowych (KNO3 i NH4NO3) wg składu poŜywki MS: stęŜenie standardowe wg poŜywki - 100%, zmniejszone do połowy - 50%. Kultury pędów rosły w fitotronie w warunkach 16-godzinnego oświetlenia w temperaturze 15°C, 20°C i 25°C.
Po 8 tygodniach wzrostu kultur oceniono liczbę węzłów i pędów bocznych, długość pędu głównego i pędów bocznych (mm) oraz świeŜą masę całego pędu (mg). W kaŜdej kombinacji było po 6 powtórzeń, gdzie powtórzeniem był słoik z 7 eksplantatami. Wyniki doświadczenia opracowano statystycznie metodą analizy wariancji. Do oceny istotności róŜnic pomiędzy średnimi zastosowano test t-Duncana przy poziomie istotności 5%.
Wyniki i dyskusja
W kulturach pędów Clematis pitcheri, obniŜenie poziomu azotu w poŜywce o połowę (50% KNO3 i NH4NO3) oraz niskie stęŜenie sacharozy - 10 mg⋅dm-3, uaktywniało wzrost pędów bocznych (średnio 3,3), ale tylko u eksplantatów rosnących w temperaturze 25°C (rys. 1A, fot. 1). Jednak wzrost wydłuŜeniowy tych pędów był słabszy, w porównaniu z pędami rosnącymi w obecności wyŜszego stęŜenia soli azotowych (rys. 1B, fot. 1). Najmniej pędów bocznych (0,6-0,7) powstawało w temperaturze 15°C, w obecności wyŜszego stęŜenia sacharozy (30 g⋅dm-3) i przy obydwu poziomach soli mineralnych (rys. 1A). Wzrost stęŜenia sacharozy w poŜywce ograniczał powstawanie pędów bocznych, niezaleŜnie od stosowanego poziomu soli azotowych. U kilku gatunków Cymbidium obserwowano korzystne działanie niskiego poziomu azotu w poŜywce na powstawanie pędów [SHIMASAKI, UEMOTO 1990; OGURA, OKUBO 2003; HUANG, OKUBO 2005; OGURA-TSUJITA, OKUBO 2006]. Przy czym obniŜenie poziomu azotu (25% i 50% KNO3 i NH4NO3 wg MS) powodowało nie tylko wzrost współczynnika namnaŜania, ale takŜe zmniejszoną produkcję etylenu przez fragmenty kłącza Cymbidium kanran [OGURA-TSUJITA,OKUBO 2006]. Odwrotne wyniki uzyskano w przypadku Nicotiana plumbaginifolia, gdzie wysokie stęŜenie azotu indukowało powstawanie pędów, a azotany w większym stopniu stymulowały ten proces niŜ inne związki azotu [CABOCHE 1987]. Natomiast wysokie stęŜenia heksoz hamowały proces regeneracji pędów u tego gatunku, podobnie jak sacharoza u Clematis pitcheri. Inny wpływ cukru obserwowano u kilku odmian Vaccinium corymbosum, gdzie wzrost stęŜenia sacharozy w poŜywce silnie stymulował powstawanie pędów bocznych, jednak optymalne stęŜenie tego cukru było róŜne dla poszczególnych odmian [CAO i in. 2003]. W badaniach molekularnych prowadzonych na Arabidopsis wykazano, Ŝe traktowanie roślin egzogenną glukozą silniej wpływa na ekspresję genów i zmiany w rozwoju niŜ zastosowanie związków azotu [GIBSON 2005].
WPŁYW TEMPERATURY ORAZ ZRÓśNICOWANEGO ... 75
Liczba pędów bocznych Number of axillary shoots
15°C 20°C 25°C
Długość pędu bocznego (mm) Length of axillary shoot (mm)
15°C 20°C 25°C
sacharoza; sucrose Rys. 1. Wpływ temperatury (15°C, 20°C, 25°C), stęŜenia sacharozy (10 g⋅dm-3, 30 g⋅dm-3) i
soli azotowych (100% N, 50% N) w poŜywce na liczbę (A) i długość (B) pędów bocznych u Clematis pitcheri in vitro (średnie oznaczone tą samą literą nie róŜnią się istotnie (5%) według testu t-Duncana)
Fig. 1. Effect of temperature (15°C, 20°C, 25°C), sucrose (10 g⋅dm-3, 30 g⋅dm-3) and nitrogen compounds (100% N, 50% N) concentrations in the medium on the number (A) and length (B) of axillary shoots of Clematis pitcheri in vitro (means followed by the same letter do not differ at 5% level of significance t-Duncan’s test)
Temperatura jest jednym z najwaŜniejszych czynników środowiskowych re-gulujących regenerację oraz wzrost i rozwój roślin in vitro. W przypadku Clematis pitcheri temperatura oraz stęŜenie sacharozy i soli mineralnych w większym stopniu oddziaływały na wzrost świeŜej masy pędów oraz uaktywnianie i wydłuŜanie pędów bocznych niŜ na wzrost pędu głównego (rys. 1B, 2 i 3). Z drugiej strony, czynniki te nie miały istotnego wpływu na liczbę powstających węzłów - średnio powstawało około 3 węzłów/pęd główny (dane niepublikowane). NajdłuŜsze pędy boczne uzyskano w temperaturze 20°C i 25°C, na poŜywce zawierającej 100% stęŜenie KNO3 i NH4NO3 oraz niski poziom sacharozy (10 g⋅dm-3). Wzrost stęŜenia sacharozy w poŜywce istotnie hamował wydłuŜanie pędów bocznych, szczególnie przy wyŜszym poziome soli
E. Gabryszewska i inni 76
azotowych w poŜywce (rys. 1B, fot. 1). TakŜe pędy lnu zwyczajnego charakteryzowały się najlepszym wzrostem wydłuŜeniowym i wigorem na poŜywce zawierającej sacharozę w stęŜeniu 10 g⋅dm-3[CHEN i in.2003]. soli azotowych (100% N, 50% N) w poŜywce na długość pędu głównego u Clematis pitcheri in vitro (objaśnienie: patrz rysunek 1)
Fig. 2. Effect of temperature (15°C, 20°C, 25°C), sucrose (10 g⋅dm-3, 30 g⋅dm-3) and nitrogen compounds (100% N, 50% N) concentrations in the medium on the length of the main shoot of Clematis pitcheri cultured in vitro (explanation: see Figure 1)
Pędy powojnika mnoŜone w temperaturze 20°C i 25°C charakteryzowały się wyŜszą świeŜą masą niŜ eksplantaty rosnące w 15°C (rys. 3). Wraz ze wzrostem temperatury obserwowano istotny wzrost świeŜej masy pędów, szczególnie u eks-plantatów rosnących w obecności wyŜszego stęŜenia sacharozy - 30 g⋅dm-3. Inne wyniki uzyskano u piwonii zielnej odmiany Jadwiga, gdzie największy wzrost świeŜej masy stwierdzono zarówno u pędów chłodzonych, jak i niechłodzonych rosnących w temperaturze 15°C [GABRYSZEWSKA 2006]. Natomiast wyŜsza temperatura, a takŜe kolejne pasaŜe po chłodzeniu silnie ograniczały przyrost świeŜej masy pędów piwonii.
U pędów powojnika mnoŜonych w temperaturze 15°C i 20°C, wysokie stęŜenie azotu (100% KNO3 i NH4NO3) ograniczało przyrost świeŜej masy pędów w obecności 30 g⋅dm-3 sacharozy, w porównaniu z eksplantatami rosnącymi przy niŜszym stęŜeniem tego cukru (rys. 3).
Uzyskane wyniki wskazują na moŜliwość rozmnaŜania in vitro Clematis pitcheri, poprzez uaktywnianie pąków kątowych i wzrost pędów bocznych. Zastosowanie niskiego stęŜenia sacharozy (10 mg⋅dm-3) i obniŜenie o połowę poziomu azotu w poŜywce (50% KNO3 i NH4NO3 wg składuMURASHIGE iSKOOGA 1962) oraz prowadzenie kultury w temperaturze 25°C wpływa na zwiększenie wartości współczynnika namnaŜania Clematis pitcheri. Dodatkowo moŜna takŜe stosować podział na węzły zarówno pędu głównego, jak i pędów bocznych. W przypadku Clematis integrifolia jako korzystniejszą uznano metodę mnoŜenia poprzez indukcję wzrostu wydłuŜeniowego pędu głównego i dzielenia go na węzły w kolejnych pasaŜach [DĄBSKI, PARZYMIES 2006]. Najlepszy wzrost pędu głównego uzyskano przy niskim stęŜeniu
WPŁYW TEMPERATURY ORAZ ZRÓśNICOWANEGO ... 77 kinetyny w poŜywce, natomiast liczba indukowanych pędów bocznych była niska przy tym poziomie cytokininy.
a a a
b
bc b
c-d
c-e e de
c-e c-e
0 50 100 150 200 250
100% N 50% N 100% N 50% N
10 g·dm-3 30 g·dm-3 sacharoza, sucrose
ŚwieŜa masa pędu (mg) Fresh weight of shoot (mg)
15°C 20°C 25°C
sacharoza; sucrose
Rys. 3. Wpływ temperatury (15°C, 20°C, 25°C), stęŜenia sacharozy (10 g⋅dm-3, 30 g⋅dm-3) i soli azotowych (100% N, 50% N) w poŜywce na wzrost świeŜej masy pędów Clematis pitcheri in vitro (objaśnienie: patrz rysunek 1)
Fig. 3. Effect of temperature (15°C, 20°C, 25°C), sucrose (10 g⋅dm-3, 30 g⋅dm-3) and nitrogen compounds (100% N, 50% N) concentrations in the medium on the fresh weight of Clematis pitcheri shoots cultured in vitro (explanation: see Figure 1)
Wnioski
1. Najwięcej pędów bocznych (3,3) uzyskano u eksplantatów mnoŜonych w temperaturze 25°C na poŜywce z obniŜonym poziomem azotu (50% KNO3 i NH4NO3) i niskim stęŜeniem sacharozy - 10 g⋅dm-3.
2. Najmniej pędów bocznych (0,6-0,7) powstawało w temperaturze 15°C, w obecności wyŜszego stęŜenia sacharozy (30 g⋅dm-3) i przy obydwu poziomach soli mineralnych.
3. WyŜsze stęŜenie sacharozy w poŜywce ograniczało powstawanie i wzrost elongacyjny pędów bocznych, niezaleŜnie od stosowanego poziomu soli azo-towych.
4. Wzrost temperatury, szczególnie przy wyŜszym stęŜeniu sacharozy, stymulował przyrost świeŜej masy pędów.
Literatura
AJ-JUBOORY K.H.,WILLIAMS D.J.,SKIRVIN R.M.1991.Growth regulators influence root and shoot development of micropropagated Algerian ivy. HortScience 26(8):
1079-1080.
CABOCHE M.1987. Nitrogen, carbohydrate and zinc requirements for the efficient in-duction of shoot morphogenesis from protoplast-derived colonies of Nicotiana
plum-E. Gabryszewska i inni 78
baginifolia. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 8: 197-206.
CAO X., FORDHAM I., DOUGLASS L., HAMMERSCHLAG F. 2003. Sucrose level influences micropropagation and gene delivery into leaves from in vitro propagated highbush blueberry shoots. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 75: 255-259.
CHEN Y.,LIN S.,DUGUID S., DRIBNENKI P.,KENASCHUK E.2003. Effect of sucrose con-centration on elongation of shoots from flax anther culture. Plant Cell Tiss. Organ Cult.
72: 181-183.
CORUZZI G.,BUSH DR. 2001. Nitrogen and carbon nutrient and metabolite signaling in plants. Plant Physiol. 125: 61-64.
CORUZZI G.M., ZHOU L. 2001. Carbon and nitrogen sensing and signaling in plants:
Emerging ‘matrix effects’. Curr. Opin. Plant Biol. 4: 247-253.
DĄBSKI M.,PARZYMIES M.2006. Wpływ cytokinin na namnaŜanie powojnika całolistnego (Clematis integrifolia L.) in vitro. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 510: 119-125.
GABRYSZEWSKA E.2006. Effects of temperature on the growth and dormancy of tissue-cultured herbaceous peony shoots. Acta Hort. 725: 471-475.
GIBSON S.I.2005. Control of plant development and gene expression by sugar signaling.
Curr. Opin. Plant Biol. 8: 93-102.
HUANG C.L., OKUBO H. 2005. In vitro morphogenesis from rhizomes of Cymbidium sinensis. J. Fac. Agr., Kyushu Univ. 50: 11-18.
MURASHIGE T.,SKOOG F.1962. A revised medium for rapid growth and bioasssays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: 473-497.
OGURA Y.,OKUBO H.2003. In vitro shoot formation from rhizome apices of Cymbidium ensifolium and C. kanran. J. Fac. Agr., Kyushu Univ. 47: 301-306.
OGURA-TSUJITA Y., OKUBO H. 2006. Effects of low nitrogen medium on endogenous changes in ethylene, auxins, and cytokinins in in vitro shoot formation from rhizomes of Cymbidium kanran. In Vitro Cell. Dev. Biol. Plant. 42: 614-616.
PRICE J.,LAXMI A.,MARTIN S.K.S.,JANG J.C.H. 2004. Global transcription profiling re-veals multiple sugar signal transduction mechanisms in Arabidopsis. Plant Cell 16:
2128-2150.
ROLLAND F.,BAENA-GONZALES E.,SHEEN J. 2006.Sugar sensing and signaling in plants:
conserved and novel mechanisms. Annu. Rev. Plant Biol. 57: 675-709.
SHIMASAKI K.,UEMOTO S. 1990. Micropropagation of a terrestrial Cymbidium species using rhizomes developed from seeds and pseudobulbs. Plant Cell Tiss. Organ Cult. 22:
237-244.
SUDARSONO, GOLDY R. 1991. Growth regulator and axillary bud position on in vitro establishment of Vitis rotundifolia. HortScience 26(3): 304-307.
WOJTANIA A.,GABRYSZEWSKA E.,WOŹNIAK P.2006.Zastosowanie kultur in vitro w roz-mnaŜaniu Dipladenia sanderi Hemsl. Zesz. Probl. Post. Nauk Roln. 510: 717-722.
Słowa kluczowe: Clematis pitcheri, rozmnaŜanie in vitro, poziom C i N, temperatura Streszczenie
Ostatnio prowadzone badania wskazują na współdziałanie węgla i azotu w regulacji procesów metabolicznych oraz wzrostu i rozwoju roślin. Zaproponowano
WPŁYW TEMPERATURY ORAZ ZRÓśNICOWANEGO ... 79 model, według którego geny związane z metabolizmem węgla i azotu są regulowane na zasadzie sprzęŜenia zwrotnego poprzez sygnały węgla i azotu. Celem badań było określenie wpływu temperatury i zróŜnicowanego poziomu C : N na wzrost i rozwój pędów Clematis pitcheri rosnących in vitro. Doświadczenia przeprowadzono na wierzchołkowych fragmentach pędów Clematis pitcheri pochodzących z rozmnaŜania in vitro. Eksplantaty umieszczano na poŜywce podstawowejMURASHIGE i SKOOGA [1962]
zawierającej meta-topolinę 0,2 mg⋅dm-3. Badano wpływ dwu stęŜeń sacharozy (10, 30 g⋅dm-3) oraz róŜnego poziomu KNO3 i NH4NO3 (stęŜenie standardowe wg poŜywki - 100% i zmniejszone do połowy - 50%) w procesie wzrostu i rozwoju pędu głównego oraz pędów bocznych powojnika. Kultury pędów rosły w fitotronie w warunkach 16-godzinnego oświetlenia w temperaturze 15°C, 20°C i 25°C.
ObniŜenie poziomu azotu w poŜywce o połowę (50% KNO3 i NH4NO3) oraz niskie stęŜenie sacharozy - 10 mg⋅dm-3 uaktywniało wzrost pędów bocznych (średnio 3,3) powojnika, ale tylko u eksplantatów rosnących w temperaturze 25°C. Najmniej pędów bocznych (0,6-0,7) powstawało w temperaturze 15°C, w obecności wyŜszego stęŜenia sacharozy (30 g⋅dm-3) i przy obydwu poziomach soli mineralnych. Wzrost stęŜenia sacharozy w poŜywce ograniczał powstawanie i wzrost pędów bocznych, niezaleŜnie od stosowanego poziomu soli azotowych. NajdłuŜsze pędy boczne uzyskano w temperaturze 20°C i 25°C, na poŜywce zawierającej 100% stęŜenie KNO3 i NH4NO3 oraz niski poziom sacharozy (10 g⋅dm-3). Pędy powojnika mnoŜone w temperaturze 20°C i 25°C charakteryzowały się wyŜszą świeŜą masą niŜ eksplantaty rosnące w 15°C.
EFFECT OF TEMPERATURE VARIOUS LEVELS OF C AND N IN THE MEDIUM ON THE GROWTH AND DEVELOPMENT
OF Clematis pitcheri in vitro
Eleonora Gabryszewska, Ludwika Kawa-Miszczak, ElŜbieta Węgrzynowicz-Lesiak, Marian Saniewski
Department of Physiology and Morphogenesis of Ornamental Plants Research Institute of Pomology and Floriculture, Skierniewice
Key words: Clematis pitcheri, propagation in vitro, level of C and N, temperature
Summary
It is know that in plants, sugar and nitrogen are critical nutrients. Sugar can act as a signal that trigger changes in gene expression and influence the developmental and metabolic processes in plants. Nitrogen sources have been also shown to regulate gene expression. A model was proposed in which genes involved in carbon and nitrogen metabolism are cross-regulated by both carbon and nitrogen signals. The influence of different sucrose/nitrogen levels on the growth and development of Clematis pitcheri cultured in vitro was investigated. The apical stem section (2-3 nodes) were placed on MS basic culture media with m-Topolin 0.2 mg⋅dm-3. The influence of sucrose (10, 30 g⋅dm-3) and different levels of KNO3 and NH4NO3 (normal strength - 100%; half strength - 50% according to the MS medium) in the process of main and axillary shoot growth and development were investigated. The cultures were incubated at the tempera-tures of 15°C, 20°C and 25°C.
The highest number of axillary shoots (3.3) was obtained on the explants growing at the temperature of 25°C, in the presence of 50% of KNO3 and NH4NO3 strength, and
E. Gabryszewska i inni 80
sucrose at 10 g⋅dm-3. On the other hand, the culture growing at the temperature of 15°C produced the lowest numbers of axillary shoots (0.6-0.7) on the media containing sucrose at 30 g⋅dm-3 and both strengths of KNO3 and NH4NO3. High concentration of sucrose inhibited the formation and elongational of axillary shoots. The best elongation of axillary shoots was found at the temperatures of 20°C and 25°C on the medium with a normal strength (100%) of KNO3 and NH4NO3 and a low (10 g⋅dm-3) concentration of sucrose. The shoots growth at the temperatures of 20°C and 25°C had a higher fresh mass than the explants cultured at 15°C.
Dr Eleonora Gabryszewska Pracownia Kultur Tkankowych Instytut Sadownictwa i Kwiaciarstwa ul. Pomologiczna 18
96-100 SKIERNIEWICE
e-mail: eleonora.gabryszewska@insad.pl
Fot. 1. Wpływ temperatury (15°C, 20°C, 25°C), stęŜenia sacharozy (10 g⋅dm-3, 30 g⋅dm-3) i soli azotowych (100% N, 50% N) w poŜywce na wzrost i rozwój pędów Clematis pitcheri rosnących in vitro
Photo 1. Effect of temperature (15°C, 20°C, 25°C), sucrose (10 g⋅dm-3, 30 g⋅dm-3) and nitrogen compounds (100% N, 50% N) concentrations in the medium on the growth and development of Clematis pitcheri shoots cultured in vitro
ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2008 z. 524: 8393