5. Metody oznaczania podstawowych składników żywności
5.4. Oznaczanie lipidów (Anna Bychowska)
Oznaczanie lipidów należy do rutynowych analiz przeprowadzanych w celu
ustalenia podstawowego składu chemicznego produktów spożywczych. Badania te pozwalają między innymi wnioskować o wartości odżywczej produktu czy też
kontrolować przebieg procesów technologicznych. Przeprowadzenie kompletnej analizy lipidów w tłuszczach spożywczych jest jednak wysoce skomplikowanym zadaniem. Naturalne tłuszcze to bowiem substancje o niezwykle złożonej i różnorodnej budowie. Bardzo często związki te ulegają rozmaitym przemianom wchodząc w reakcje zarówno
same ze sobą, jak też z innymi składnikami żywności. Ponadto, lipidy należą do związków wyjątkowo labilnych, szczególnie słabo odpornych na działanie czynników
190 | S t r o n a
z zachowaniem pewnych środków ostrożności, tak aby zminimalizować wszelkie niepożądane reakcje jak np. autooksydacji.
5.4.1. Metody oznaczania tłuszczu surowego w produktach żywnościowych
W analizie żywności terminem tłuszcz określa się wszystkie substancje, które można wyekstrahować rozpuszczalnikiem organicznym, a które nie są lotne przy suszeniu trwającym jedną godzinę w temperaturze 105°C. Wydzielony w ten sposób materiał nazywa się tłuszczem surowym. Składnikami takiego tłuszczu są różnej klasy lipidy, w głównej mierze acyloglicerole, ale także fosfolipidy, wolne kwasy tłuszczowe, sterole, witaminy, barwniki.
Do oznaczenia zawartości tłuszczu surowego w produktach żywnościowych wykorzystuje się metody: ekstrakcyjne, objętościowe oraz instrumentalne.
Metody ekstrakcyjne
Polegają na wydzieleniu tłuszczu bezpośrednio przy użyciu odpowiedniego rozpuszczalnika albo po wstępnym traktowaniu próby roztworem kwasu lub zasady. Oznaczanie ilości wyekstrahowanego tłuszczu przeprowadza się wagowo, refraktometrycznie lub densymetrycznie. I tak:
- metody ekstrakcyjno-wagowe – w tym przypadku ekstrakcję przeprowadza się zazwyczaj przy użyciu eteru etylowego, eteru naftowego, heksanu czy też chloroformu, a następnie rozpuszczalnik odparowuje się i waży pozostałość. Jest to metoda
czasochłonna aczkolwiek uznawana za najdokładniejszą. Powszechnie stosowane
do oznaczanie tłuszczu surowego metody ekstrakcyjno-wagowe to ekstrakcja w aparacie Soxhleta, metoda Weibulla-Stoldta, Roese-Gottlieba i
Schmidta-Bondzyńskiego-Ratzlaffa.
- ekstrakcyjno-refraktometryczne – polegają na ekstrakcji tłuszczu z badanej próby za pomocą określonej ilości odpowiedniego rozpuszczalnika o ustalonym
współczynniku załamania światła, a następnie refraktometrycznym pomiarze współczynnika załamania światła otrzymanego ekstraktu. Podstawą wyznaczenia zawartości tłuszczu jest w tym przypadku różnica między współczynnikami refrakcji rozpuszczalnika i badanego ekstraktu. Przy tego typu analizach bardzo ważne jest dobranie odpowiedniego rozpuszczalnika do ekstrakcji tłuszczu. Rozpuszczalnik taki powinien charakteryzować się między innymi wysoką wartością współczynnika
191 | S t r o n a
załamania światła, wysoką temperaturą wrzenia oraz nie powinien być lotny w temperaturze pomiaru. Najczęściej wykorzystuje się w tym celu bromonaftalen.
- ekstrakcyjno-densymetryczne – w tej metodzie najpierw dokonuje się ekstrakcji
tłuszczu z próbki a następnie wyznacza gęstość wyciągu tłuszczowego i porównuje z krzywą wzorcową. Zawartość tłuszczu wylicza się na podstawie zmian w gęstości
czystego rozpuszczalnika oraz gęstości ekstraktu tłuszczowego. Z uwagi na małą lotność oraz dużą gęstość najczęściej jako rozpuszczalnika stosuje się tutaj czterochlorek węgla.
Metody objętościowe (butyrometryczne)
Polegają na rozpuszczeniu zawartych w próbce substancji białkowych i związków towarzyszących przy pomocy kwasu siarkowego(VI), a następnie wydzieleniu tłuszczu za pomocą rozpuszczalnika organicznego. Proces ten przeprowadza się w specjalnych przyrządach zwanych tłuszczomierzami lub butyrometrami. Metody objętościowe stosuje się głównie do oznaczenia zawartości tłuszczu surowego w mleku i produktach
mleczarskich, w przetworach mięsnych oraz gotowych posiłkach. Ich zaletą jest prostota, szybkość wykonania, nieskomplikowana aparatura a także stosunkowo
niskie koszty pomiaru. Przykładem objętościowej metody oznaczania zawartości tłuszczu jest tzw. metoda Gerbera.
Metody instrumentalne
W celu szybkiego oznaczania zawartości tłuszczu surowego w próbkach żywności można wykorzystać również takie techniki jak: spektroskopię magnetycznego
rezonansu jądrowego (NMR) oraz spektroskopię w bliskiej podczerwieni (NIR). W ten sposób oznacza się m.in.: zawartość tłuszczu w nasionach, margarynie, mięsie,
produktach mleczarskich oraz w czekoladzie.
5.4.2. Metody oznaczania poszczególnych klas lipidów w produktach żywnościowych
Oznaczenie lipidów w produktach żywnościowych nie polega wyłącznie na określeniu ich ogólnej zawartości w postaci tłuszczu surowego. Istotne jest również
zidentyfikowanie poszczególnych klas lipidów w próbce (np. triacyloglicerole, fosfolipidy, glikolipidy, sterole, wolne kwasy tłuszczowe), a także ilościowe oznaczenie każdego
192 | S t r o n a
składnika. Kompleksową analizę lipidów w produktach spożywczych przeprowadza się głównie przy pomocy chromatografii kolumnowej (LC), chromatografii
cienkowarstwowej (TLC) oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Przed analizą za pomocą techniki chromatografii gazowej (GC) i cieczowej (HPLC) próbkę żywności należy odpowiednio przygotować. Służy do tego najczęściej technika
ekstrakcji do fazy stałej (SPE), która ma na celu rozdzielenie mieszaniny lipidów
na poszczególne klasy. Jako fazę stałą stosuje się tu zazwyczaj kolumny krzemionkowe lub amino-propylowe, natomiast poszczególne frakcje lipidowe wymywa się przy pomocy mieszaniny takich rozpuszczalników jak: eter dietylowy, heksan, chloroform czy też metanol. W odróżnieniu od tradycyjnej chromatografii kolumnowej (LC) rozdział lipidów techniką SPE odbywa się przy użyciu znacznie mniejszych ilości eluentów, co jest bardziej przyjazne zasadom zielonej chemii.
Chromatografia kolumnowa (LC) – to najczęściej stosowana metoda służąca do rozdzielenia lipidów na poszczególne frakcje. Podział następuje tu w zależności od
powinowactwa do fazy stacjonarnej lub ruchomej, natomiast wymywanie poszczególnych klas lipidów odbywa się poprzez zmianę składu eluenta. Przykładowo lipidy neutralne są eluowane z kolumny wypełnionej żelem krzemionkowym za pomocą chloroformu, glikolipidy za pomocą acetonu zaś fosfolipidy za pomocą metanolu. Rozdzielone w ten sposób lipidy można z kolei rozdzielać dalej stosując inne żele krzemionkowe oraz inne układy eluentów. I tak na przykład frakcję lipidów neutralnych można rozdzielić dodatkowo na węglowodory, estry cholesterolu, triacyloglicerole, cholesterol i diacyloglicerole, monoacyloglicerole wymywając je odpowiednio heksanem, heksanem z dodatkiem 2% eteru, heksanem z dodatkiem 5% eteru,
heksanem z dodatkiem 15% eteru i czystym eterem. Ocenę ilościową każdej z otrzymanych frakcji przeprowadza się z kolei albo wagowo po uprzednim
odparowaniu rozpuszczalników, albo techniką chromatografii gazowej, dodając wzorca wewnętrznego i przeprowadzając je w odpowiednie lotne pochodne, np. acyloglicerole w estry metylowe.
Chromatografia cienkowarstwowa (TLC) – uznawana za bardzo cenne narzędzie w analizie zarówno prostych jak też złożonych lipidów. Główną zaletą tej metody są
niskie koszty, szybkość i prostota. W analizie lipidów techniką TLC stosuje się zazwyczaj płytki wykonane z żelu krzemionkowego (faza stacjonarna), a jako fazę ruchomą kombinację takich rozpuszczalników jak: heksan, eter dietylowy i kwas octowy.
193 | S t r o n a
Ten system pozwala rozdzielić od siebie acyloglicerole, wolne sterole, estry steroli, wolne kwasy tłuszczowe oraz inne neutralne lipidy. Do rozdzielania fosfolipidów stosuje się z kolei kombinację takich rozpuszczalników jak: chloroform – metanol – woda albo chloroform – metanol - kwas octowy. Ocenę ilościową frakcji wyodrębnionych metodą
TLC prowadzi się następnie densytometrycznie, choć należy zaznaczyć, że jest to metoda głównie wykorzystywana do analiz jakościowych a rzadziej do ilościowych.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) – w analizie lipidów stosuje się ją od niedawna (1980 r.); charakteryzuje się dużą zdolnością rozdzielania lipidów na poszczególne klasy, a także wymaga użycia niewielkiej ilości próbki do analiz.
Początkowo wykorzystywano ją wyłącznie do analiz lipidów o charakterze nienasyconym, gdyż jako jedyne wykazywały one zdolność do absorpcji promieniowania UV i tym samym można było oznaczać je przy pomocy detektora UV.
Obecnie najbardziej uniwersalnym detektorem wykorzystywanym w badaniach nad lipidami techniką HPLC jest laserowy detektor promieniowania rozproszonego
(LLSD). Pozwala on oznaczać jakościowo i ilościowo wszystkie klasy lipidów, zarówno polarne jak i niepolarne, o charakterze nasyconym i nienasyconym. W dodatku
rozdzielanie lipidów na poszczególne klasy techniką HPLC-LLSD można prowadzić w normalnym i odwróconym układzie faz. Przykładowe warunki pracy zestawu
HPLC-LLSD w normalnym układzie faz to: kolumna Econosil Silica, eucja gradientowa od 0% fazy A (eter naftowy) do 100% fazy B (83,5% dichlorometan, 15% aceton i 1.5% izopropanol) z narostem liniowym w 20 min, temp. rurki dyfuzyjnej detektora 42°C, ciśnienie CO2 od 0,1 do 0,2 MPa.
5.4.3. Oznaczanie składu kwasów tłuszczowych w produktach żywnościowych
Skład kwasów tłuszczowych w tłuszczach spożywczych oznacza się przy użyciu dwóch zasadniczych technik analitycznych, mianowicie chromatografii gazowej (GC) oraz wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC). Dobór odpowiedniej techniki zależy w głównej mierze od rodzaju analizowanej próbki, a także od takich czynników jak: długość łańcucha węglowodorowego, stopień nienasycenia oraz obecność różnych grup funkcyjnych.
194 | S t r o n a
Analiza kwasów tłuszczowych techniką chromatografii gazowej (GC)
Największym ograniczeniem w analizie kwasów tłuszczowych techniką chromatografii gazowej jest ich mała lotność. Przed wykonaniem analizy właściwej istnieje zatem konieczność przeprowadzenia tych związków w odpowiednie pochodne. W większości
przypadków przeprowadza się je w mniej polarne estry metylowe, a niekiedy także w estry butylowe oraz trimetylosililowe (TMS). Jedynie krótkołańcuchowe kwasy
tłuszczowe, takie jak octowy, propionowy, walerianowy, są na tyle lotne, że nie wymagają uprzedniego przeprowadzania w pochodne. Metoda otrzymywania estrów metylowych kwasów tłuszczowych zależy głównie od charakteru analizowanej substancji. Jeżeli próbka zawiera wyłącznie wolne kwasy tłuszczowe to w tym celu powinien być użyty kwaśny reagent (np. MeOH-HCl). Natomiast w przypadku kwasów związanych z glicerolem (acylogliceroli) preferowana jest alkaliczna metanoliza.
Kwasy tłuszczowe w postaci pochodnych metylowych można analizować przy użyciu kolumn kapilarnych o różnej polarności. Stwierdzono jednak, że najbardziej
efektywne rozdziały tych związków uzyskuje się na kolumnach o bardzo polarnych
fazach stacjonarnych. Są to zazwyczaj fazy cyjanoetylosilikonowe oraz cyjanopropylosilikonowe.
W przypadku gdy badana mieszanina kwasów tłuszczowych zawiera w swym składzie zarówno kwasy krótkołańcuchowe i długołańcuchowe, to analizę prowadzi się w programowanej temperaturze. W ten sposób uzyskać można kompletny rozdział
wszystkich składników mieszaniny, co zdecydowanie ułatwia ich identyfikację oraz ocenę ilościową.
Najbardziej odpowiedni w analizie większości kwasów tłuszczowych techniką GC jest uniwersalny detektor płomieniowo-jonizacyjny (FID). Charakteryzuje się między innymi wysoką czułością, stabilnością nawet podczas analiz z programowaną temperaturą, krótkim czasem odpowiedzi czy też liniowością w szerokim zakresie stężeń. W analizie estrów metylowych kwasów tłuszczowych wykorzystuje się również
detektor wychwytu elektronów (ECD) a także spektrometr mas zazwyczaj sprzężony w układzie GC-MS.
Analizę jakościową estrów metylowych kwasów tłuszczowych przeprowadza się tradycyjnie w oparciu o parametry retencji. Ponadto identyfikacji można również dokonać poprzez zastosowanie odpowiedniego detektora jakościowego. W tym
195 | S t r o n a
ze spektrometrią mas (GC-MS). Oprócz parametrów retencji układ ten rejestruje widma mas i tym samym umożliwia przeprowadzenie kompletnej identyfikacji. Ocenę ilościową dla tej grupy związków przeprowadza się z kolei zazwyczaj albo poprzez zastosowanie
metody wzorca wewnętrznego albo wyliczając procentowy udział każdego ze składników analizowanej mieszaniny.
Analiza kwasów tłuszczowych techniką wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC)
Podczas analizy kwasów tłuszczowych techniką HPLC zazwyczaj wykorzystuje się dwa
zasadnicze typy detekcji: detektor UV oraz detektor fluorescencyjny. W zależności od rodzaju stosowanej do analiz detekcji kwasy tłuszczowe należy uprzednio
przeprowadzić w odpowiednie pochodne. W tym celu w przypadku detektora UV kwasy
estryfikuje się alkoholem lub amidami, natomiast przy detekcji fluorescencyjnej do estryfikacji kwasów stosuje się alkohol mający właściwości fluorescencyjne np.
antranol.
Analizy kwasów tłuszczowych techniką chromatografii cieczowej prowadzi się zazwyczaj w odwróconym układzie faz (RP-HPLC). Stosowane w tym celu fazy stacjonarne to najczęściej żele krzemionkowe modyfikowane grupami oktadecylowymi (C18) oraz oktylowymi (C8). Rozdzielenie wykonuje się zarówno w warunkach izokratycznych jak też w gradiencie przy użyciu rozpuszczalników polarnych, takich jak: metanol, acetonitryl, woda. Kolejność elucji poszczególnych kwasów tłuszczowych
zależy od długości łańcucha węglowodorowego (czasy retencji wzrastają wraz ze wzrostem długości łańcucha) oraz ilości wiązań podwójnych w cząsteczce kwasu
(czasy retencji maleją wraz ze wzrostem ilości wiązań podwójnych). Technikę HPLC wykorzystuje się m.in. do ilościowych analiz krótkołańcuchowych kwasów tłuszczowych.
5.4.4. Oznaczanie parametrów jakości tłuszczu
W trakcie przechowywania tłuszczy zachodzi wiele niekorzystnych zmian, w efekcie
których pogarsza się ich jakość bądź też całkowicie ulegają zepsuciu. Procesy te nazywa się jełczeniem, a zachodzą głównie pod wpływem czynników zewnętrznych
takich jak temperatura, światło, powietrze. Wyróżnia się dwa podstawowe rodzaje zmian zachodzących w tłuszczach:
196 | S t r o n a
mikroorganizmów i enzymów tkankowych; prowadzą do uwalniania z glicerydów wolnych kwasów tłuszczowych, a także powodują rozpad wyższych kwasów tłuszczowych na kwasy o krótszym łańcuchu węglowym.
zmiany spowodowane działaniem tlenu na nienasycone wiązania przy udziale światła i katalizatorów, np. jonów żelaza; w efekcie dochodzi do utlenienia (autooksydacji) tłuszczy i powstania nadtlenków, a następnie aldehydów i ketonów.
W celu określenia niekorzystnych zmian zachodzących w tłuszczach podczas jego przechowywania wprowadzono tzw. liczby tłuszczowe.
Liczba kwasowa (LK) – jest miarą zawartości wolnych kwasów tłuszczowych powstałych w efekcie hydrolizy acylogliceroli; wyraża się ją jako ilość miligramów
wodorotlenku potasu potrzebną do zobojętnienia kwasów tłuszczowych zawartych w 1 g badanego tłuszczu. Liczba kwasowa nie jest wartością stałą dla danego
gatunku tłuszczu.
Liczba zmydlenia (LZ) – parametr ten pozwala na określenie średniej masy cząsteczkowej kwasów tłuszczowych; jest to liczba miligramów wodorotlenku potasu potrzebna do zobojętnienia wolnych kwasów tłuszczowych i zmydlenia acylogliceroli zawartych w 1 g badanego tłuszczu.
Liczba estrowa (LE) – świadczy o długości łańcuchów kwasów tłuszczowych wchodzących w skład acylogliceroli danego tłuszczu; jest tym wyższa, im łańcuchy są krótsze; wyraża się ją jako ilość miligramów wodorotlenku potasu potrzebną do zmydlenia zestryfikowanych kwasów tłuszczowych zawartych w 1 g badanego tłuszczu. Oblicza się ją z różnicy pomiędzy liczbą zmydlenia (LZ) i liczbą kwasową (LK).
Liczba jodowa (LJ) – charakteryzuje tłuszcz pod względem zawartości w nim
nienasyconych kwasów tłuszczowych. Jest to liczba gramów chlorowca w przeliczeniu na jod, która przyłącza się w określonych warunkach do podwójnych
wiązań kwasów tłuszczowych znajdujących się w 100 g badanego produktu.
R-CH2-CH=CH-CH2-R + BrJ → R-CH2-CHBr-CHJ-CH2-R
Liczba nadtlenkowa (LOO) – parametr ten służy do określenia zawartości nadtlenków i traktowany jest jako wskaźnik stopnia zjełczenia tłuszczu. Jest to liczba cm3 mianowanego roztworu tiosiarczanu sodu potrzebna do zmiareczkowania jodu197 | S t r o n a
wydzielonego z roztworu jodku potasu w wyniku działania nadtlenków zawartych w 1 g tłuszczu.