G-CBrGGCGG-C (1), G-CGGCBrGG-C (2), G-CMeGGCGG-C (3)
Z uwagi na niedopasowanie G:G występujące w cząsteczkach zbudowanych z powtórzeń CGG, takie cząsteczki są bardzo trudne do analizy metodami spektroskopii NMR. Dla uzyskania stabilnych par zasad G:G jedną z reszt guanozyny zastąpiłam jej analogiem posiadającym objętościowy podstawnik w pozycji C8. Otrzymałam cząsteczki RNA, które zawierały modyfikacje 8-bromoguanozynę oraz 8-metyloguanozynę. W przeciwieństwie do typowej dla formy A-RNA konformacji anti, reszty BrG i MeG przyjmują konformację syn. W widmach 1H NMR zarejestrowanych w H2O obserwowałam dwa sygnały od iminowych atomów wodoru, które wskazywały na tworzenie się par zasad Br
G:G, G:BrG lub MeG:G. Ponieważ na podstawie widm 2D NOESY wykluczyłam możliwość powstawania pary zasad typu N1-karbonylo (rys. 122 A), w której zaangażowane byłyby dwa iminowe atomy wodoru, najbardziej prawdopodobne było powstawanie pary zasad typu N1-karbonylo, N7-amino przedstawionej na rys. 122 B. Dla cząsteczki G-CMeGGCGG-C sygnały
korelacyjne w widmie 2D NOESY pomiędzy protonem iminowym reszty G6, a protonami grupy metylowej reszty G3, jednoznacznie potwierdziły powstawanie tej pary zasad. Ponieważ nawet w temperaturze pokojowej i wyższej obserwowałam w widmie NMR sygnał iminowego atomu wodoru G3-NH1 (zaznaczony w kółku, rys. 129 B), to musiał on być zaangażowany w wiązanie wodorowe oraz niedostępny dla cząsteczek wody. Jedynym wytłumaczeniem tego zjawiska była możliwość asocjacji dwóch dupleksów, co prowadziłoby do powstania struktury czteroniciowej z pojedynczymi G-tetradami oraz mieszanymi tetradami G:C:G:C. Taki kwadrupleks byłby nietypowy, stosowałam więc różne metody takie jak spektroskopię CD, TDS, analizowałam krzywe topnienia przy różnych długościach fali, wykorzystywałam migrację w żelu poliakrylamidowym oraz spektrometrię mas aby potwierdzić jego powstawanie. Pomimo, iż w przypadku cząsteczki 1 i 3, na podstawie widm 2D NOESY potwierdziłam tworzenie się mieszanych G1:C8:G1:C8 tetrad, to jednak nie obserwowałam większości sygnałów korelacyjnych charakterystycznych dla typowych kwadrupleksów. Ze względu na brak w strukturze powstających kwadrupleksów, co najmniej dwóch sąsiadujących G-tetrad cząsteczki te dawały widma UV typowe dla dupleksów.Niezależny w stosunku do spektroskopii NMR dowód, iż cząsteczki 1 i 3 tworzą struktury czteroniciowe otrzymałam na podstawie widm masowych, stosując jonizację poprzez elektrorozpraszanie. Dodatkowo okazało się, że równowaga między formą dupleksu a kwadrupleksu zależała od wielu czynników takich jak: stężenie RNA, typ modyfikacji (Br
G, MeG), rodzaj kationu i jego stężenie czy też temperatura pomiaru. Finalnie, w oparciu o informacje uzyskane z analizy widm NMR zarejestrowanych dla cząsteczki G-CMeGGCGG-C, zbudowałam model antyrównoległego kwadrupleksu pokazany na rysunku 146.
Także cząsteczki RNA o sekwencjach G-CBrGGCGG-C oraz G-CGGCBrGG-C tworzą w roztworze
antyrównoległe kwadrupleksy o takiej samej topologii jak cząsteczka G-CMe
GGCGG-C. W tetradach
(Br/MeG):G:(Br/MeG):G obie modyfikowane reszty BrG lub MeG przyjmują konformację syn, a guanozyny występują w formie anti. Wszystkie te reszty tworzą wiązania wodorowe na sposób Hoogsteena. Mieszane tetrady G:C:G:C utworzone z dwóch par Watsona-Cricka stabilizowane są siecią wiązań wodorowych, w które zaangażowana jest krawędź Hoogsteena reszt guanozyny oraz grupa aminowa reszt cytydyn.
G-CMeGGCIG-C (4), G-CBrGGCIG-C (5), G-CIGCBrGG-C (6), pG-CMeGGCGG-C (7),
pG-CBrGGCGG-C (8)
Zastąpienie w cząsteczkach 1-3 jednej reszty guanozyny inozyną wpływało na równowagę konformacyjną dupleks-kwadrupleks. Dla cząsteczek RNA zawierających resztę inozyny (4-6) w zależności od stężenia NaCl, na podstawie analizy szybkości migracji w żelu w warunkach niedenaturujących, stwierdziłam, iż cząsteczka GCBr
GGCIGC najłatwiej tworzyła kwadrupleks,
niezależnie od warunków solnych, cząsteczka GCMe
GGCIGC formowała kwadrupleks tylko
w obecności 150 mM NaCl, natomiast cząsteczka GCIGCBr
GGC migrowała wyłącznie jako dupleks.
Natomiast dla stężeń RNA stosowanych do pomiarów NMR (~ 10-3 M) wszystkie te cząsteczki asocjowały do form czteroniciowych. Pomimo braku grupy aminowej w reszcie inozyny, obserwowałam tworzenie się stabilnych tetrad X
G(syn):I:XG(syn):I oraz I:XG(syn):I:XG(syn) (X = Br, Me) stabilizowanych sześcioma wiązaniami wodorowymi. Brak objętościowej grupy aminowej, osłaniającej iminowy atom wodoru reszty I3 lub I6, prowadził do jego hydratacji oraz szybkiej wymiany z wodą. Analiza widm dwuwymiarowych wskazała na duże podobieństwo struktur kwadrupleksów tworzonych przez cząsteczkę G-CMe
GGCGG-C oraz G-CMeGGCIG-C.
W przypadku cząsteczek pG-CMeGGCGG-C oraz pG-CBrGGCGG-C, wprowadzenie
dodatkowej grupy fosforanowej wpływało na ich szybszą migracji w żelu, co jest związane najprawdopodobniej z obecnością dodatkowego ładunku. Grupa fosforanowa na końcu 5' zapobiega wtórnej asocjacji kwadrupleksów, natomiast nie wpływa na powstawanie struktury antyrównoległego kwadrupleksu. Dodatkowo widma NMR były łatwiejsze do analizy, gdyż sygnały były lepiej rozseparowane.
CGGCGG-C (10), CGGCGG-CG (11), G-CGGCGG-C (12)
Cząsteczki CGGCGG-C, CGGCGG-CG oraz G-CGGCGG-C nie zawierają modyfikowanych reszt oraz różnią się między sobą położeniem (koniec 5' i/lub 3'), liczbą jak i typem reszt nukleotydowych otaczających dwa powtórzenia CGG. Wykorzystując profile topnienia przy 295 nm oraz widma różnicowe TDS ustaliłam, iż wszystkie te cząsteczki w środowisku zawierającym kationy potasu wykazują tendencję do tworzenia kwadrupleksów. Na podstawie analizy widm 1H NMR
w rejonie iminowym wykazałam, iż tylko cząsteczka G-CGGCGG-C, której sekwencja od strony 5' rozpoczyna się od reszty guanozyny, tworzy dominującą formę kwadrupleksu w obecności kationów K+. Jednak jak się okazało, cząsteczka ta tworzy również struktury wyższych rzędów. Wskazywało na to silne poszerzenie sygnałów w widmach 1H NMR, zarejestrowanych w D2O. Właśnie ze względu na obserwowane w tych warunkach szerokie i mało intensywne sygnały nie udało mi się przypisać kluczowych sygnałów, a tym samym nie mogłam określić topologii tworzącego się kwadrupleksu. Próbowałam znaleźć inne warunki, w których cząsteczka ta tworzyłaby kwadrupleks a jednocześnie nie obserwowałabym np. struktur wyższego rzędu. W widmach CD cząsteczki G-CGGCGG-C, zarówno położenia jak i intensywność pasm, silnie zależały od stężenia i typu soli. Widmo CD, które było najbardziej zbliżone do widma zarejestrowanego w obecności kationów potasu obserwowałam dla 150 mM NaCl. Także w żelu w warunkach niedenaturujących, przy ~ 300 mM stężeniu kationów sodu, obserwowałam pojawienie się prążka, odpowiadającego formie kwadrupleksu (obserwowanego w obecności kationów potasu). Jak pokazała analiza widm 1
H NMR w obecności 150 mM NaCl, ustalała się równowaga pomiędzy strukturą dupleksu i kwadrupleksu. Wraz ze wzrostem stężenia RNA, obserwowałam pojawianie się sygnałów od formy kwadrupleksu i zanik tych charakterystycznych dla dupleksu. Niezależnie od rodzaju kationu jednowartościowego, Na+ czy K+, w rejonie iminowym widma 1H NMR obserwowałam pięć sygnałów od formy kwadrupleksu. Na podstawie szczegółowej analizy sygnałów korelacyjnych, w widmie 2D NOESY zarejestrowanym w H2O, zwłaszcza w rejonie występowania sygnałów od iminowych i aminowych atomów wodoru ustaliłam, iż w obecności kationów Na+
powstaje kwadrupleks (G-CGGCGG-C)4 zbudowany z dwóch G-tetrad, G3:G6:G3:G6 i G4:G7:G4:G7, oraz mieszanych tetrad G:C:G:C (rys. 195). Dodatkowo obecność silnych sygnałów korelacyjnych, G1:H8-G6:H1'i G1:H8-G6:H8, w widmach 2D NOESY jednoznacznie potwierdziła dimeryzację dwóch podjednostek kwadrupleksów. Na podstawie uzyskanych przeze mnie danych eksperymentalnych uważam, że w środowisku kationów K+
powstaje kwadrupleks o takiej samej topologii.
Cząsteczkowość kwadrupleksu (G-CGGCGG-C)4 potwierdziłam także niezależnie na podstawie widma masowego, stosując ~ 70 μM stężenie próbki. W warunkach pomiaru (jonizacja poprzez elektrorozpraszanie) czteroniciowy kwadrupleks wiązał dwa kationy NH4+. Jednak, jak wynikało z porównania profili migracji cząsteczki G-CGGCGG-C w żelach natywnych, obecność kationów amonowych nie sprzyjała powstawaniu struktury kwadrupleksu.
pG-CGGCGG-C (13)
Podczas gdy dodatkowa reszta fosforanowa na końcu 5' zapobiegała powstawaniu struktur wyższego rzędu w przypadku cząsteczki zawierającej resztę 8-metyloguanozyny, to dodanie grupy fosforanowej do cząsteczki G-CGGCGG-C (pG-CGGCGG-C) uniemożliwiało tworzenie
W zależności od stężenia RNA i temperatury obserwowałam różną równowagę pomiędzy parami zasad G(syn):G(anti) a G(anti): G(syn).
G-CGGCGGCGGCGG-C (15)
W obecności kationów Na+ cząsteczka G(CGG)4C, nie tworzyła jednej konformacji i migrowała w żelu natywnym w postaci dwóch pasm. Szybkość migracji jednego z nich była porównywalna do dupleksu, natomiast drugie pasmo migrowało znacznie wolniej i odpowiadało
najprawdopodobniej formie czteroniciowej. Jednak jak pokazały widma 1H NMR, w obecności
kationu Na+ cząsteczka 15 zbudowana z 4 powtórzeń CGG, tworzyła głównie dupleks lub spinkę. Natomiast w buforze zawierającym kationy K+ powstaje kwadrupleks, co potwierdziłam na podstawie analizy widm UV i 1H NMR. Zależnie od sposobu topnienia próbki zmieniała się równowaga pomiędzy formą kwadrupleksu a dupleksu/spinki. Umieszczenie próbki po grzaniu przez 5 minut w 90ºC bezpośrednio w lodzie prowadziło do powstania w przewadze spinki/dupleksu, natomiast jej wolniejsze schładzanie sprzyjało tworzeniu kwadrupleksu.
G(CGG)nC/G(CCG)nC (n=2,3,4)
Wraz ze wzrostem ilości powtórzeń cząsteczki otrzymane przez równomolowe zmieszanie dwóch komplementarnych nici G(CGG)nC i G(CCG)nC (n=2,3,4), migrowały w żelach natywnych coraz wolniej. Jest to najprawdopodobniej spowodowane zwiększoną tendencję dłuższych cząsteczek do tworzenia struktur czteroniciowych zbudowanych wyłącznie z tetrad G:C:G:C. Nie udało mi się jednak tego jednoznacznie potwierdzić przy pomocy metod stosowanych w pracy.
Budowa G-tetrad w kwadrupleksach
Wszystkie cząsteczki (1-8) zawierające modyfikowane reszty: Br
G, MeG, I oraz pG tworzą
dupleksy, które mogą asocjować tworząc struktury czteroniciowych kwadrupleksów. Kluczowa dla
asocjacji takich dupleksów do antyrównoległych kwadrupleksów jest preorganizacja niekanonicznej
pary zasad G:G. Dupleksy, w których jedna z reszt guanozyny w parze G:G występuje w konformacji syn, mogą asocjować do nietypowych kwadrupleksów zawierających pojedyncze G-tetrady, bez konieczności rearanżacji zawiązanych już wiązań wodorowych. Każdy taki antyrównoległy kwadrupleks zawiera dwie G-tetrady różniące się kierunkowością wiązań wodorowych (tab. 24). Z kolei kwadrupleks (G-CGGCGG-C)4, który nie zawiera modyfikowanych reszt nukleotydowych, tworzy się z jednakowo zbudowanych G-tetrad, w których wszystkie reszty guanozyny występują w konformacji anti (tab. 24). Wszystkie przedstawione w tabeli 24 cząsteczki oprócz G-tetrad zawierają jeden typ mieszanych tetrad G:C:G:C.
Tabela. 24. Budowa tetrad występujących w badanych przeze mnie kwadrupleksach
sekwencja zasad (3:6) para w dupleksie
typ tetrady (3:6:3:6) tetrada (3:6:3:6) kierunkowość
G-CMeGGCGG-C pG-CMeGGCGG-C G-CBrGGCGG-C pG-CBrGGCGG-C Me G3:G6 BrG3:G6 G3(syn):G6(anti):G3(syn):G6(anti) X = Br, Me kierunkowość zgodna z ruchem wskazówek zegara G-CMeGGCIG-C G-CBrGGCIG-C MeG3:I6 Br G3:I6 G3(syn):I6(anti):G3(syn):I6(anti) X = Br, Me kierunkowość zgodna z ruchem wskazówek zegara G-CGGCBrGG-C G3:BrG6 G3(anti):G6(syn):G3(anti):G6(syn) kierunkowość przeciwna do ruchu wskazówek zegara
G-CIGCBrGG-C I3:BrG6 I3(anti):G6(syn):I3(anti):G6(syn)
kierunkowość przeciwna do ruchu wskazówek zegara
G-CGGCGG-C G3:G6 G3(anti):G6(anti):G3(anti):G6(anti) G4(anti):G7(anti):G4(anti):G7(anti) kierunkowość przeciwna do ruchu wskazówek zegara cząsteczki 1-8 cząsteczka 12 G:C G:C:G:C