VI. MATERIAŁY I METODY
VI.2. Przygotowanie RNA do badań
Przygotowanie cząsteczek RNA do badań po syntezie chemicznej przebiegało w kilku etapach.
VI.2.1. Usunięcie grup ochronnych oraz rozdzielenie cząsteczek RNA
W celu odcięcia oligomerów od podłoża, usunięcia grup zasadolabilnych oraz odsililowania, podłoże traktowano:
A.
Oligomery nie zawierające atomu bromu
40% roztworem CH3NH2 w H2O (2 ml), całość inkubowano ~ 20 godzin w temperaturze pokojowej. Oligomery zawierające atom bromu
32% roztworem NH4OH:EtOH (2ml, 3:1 v/v), całość inkubowano przez 2 dni w temperaturze pokojowej.
Następnie roztwór zbierano znad podłoża, podłoże dokładnie płukano mieszaniną EtOH:CH3CN:H2O (3:1:1 v/v/v). Roztwory łączono i odparowano do sucha (wyparka wirówkowa). Otrzymany osad oligorybonukleotydu rozpuszczono w 0.5 ml trójfluorowodorku trójetyloaminy (1M w THF) i inkubowano przez 20 godzin w temperaturze pokojowej (z wytrząsaniem do momentu rozpuszczenia).
B.
Oligomery - niezależnie od sekwencji
32% roztworem NH4OH:EtOH (2ml, 3:1 v/v), całość inkubowano przez noc w temperaturze ~50°C. Następnie probówkę wymrożono przez 15 minut w temperaturze -20°C, roztwór znad silikażelu przesączono przez sączek, silikażel przepłukano 3 x 0.5 ml wody i przesącz odparowano do sucha. Po dodaniu 30 μl DMF-u i 270 μl (Et)3N·3HF, zapewniając bezwodne warunki, probówkę ogrzewano w temperaturze 55°C przez 2-3 h, mieszając co 10 minut aż do rozpuszczenia osadu. Następnie dodano 5 ml n-butanolu i umieszczono próbkę w temperaturze -20°C w celu strącenia osadu oligomeru. Po 1 godzinie osad został zwirowany w temperaturze 4°C (10 min, 5000 obr/min), roztwór został zlany, a osad wysuszony pod zmniejszonym ciśnieniem.
W celu rozdzielenia oligomerów o różnej długości po syntezie stosowano różne metody:
Cienkowarstwowa chromatografia cieczowa (TLC)
rozdziału (~ 4-5 h) prążki odpowiadające właściwym oligorybonukleotydom wyskrobano z płytek i eluowano 3-krotnie 2 ml wody. Połączone frakcje odparowano do sucha.
W celu usunięcia resztek silikażelu, próbki rozpuszczono w 500 μl wody, następnie wirowano w temperaturze pokojowej przy 12000 obr/min przez 3 minuty, roztwór przeniesiono do nowych probówek (Eppendorf) oraz użyto kolumn zawierających silanizowane podłoże C18 (Sep-Pak, firmy Waters). Oczyszczone oligomery RNA liofilizowano i przechowywano w -20ºC. Otrzymywano 10 – 20 OD z syntezy w skali 1 mikromolowej.
Wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC)
Jest to alternatywna metoda, która była stosowana do oczyszczania cząsteczek RNA. Próbki RNA w ilościach podanych w tabelach 28 i 29 były nastrzyknięte do układu chromatograficznego, a następnie eluowane gradientowo. Czas retencji dla G-CGGCGG-C wynosił w skali analitycznej ~ 16.3 min (20% B), a w skali półprepatratywnej ~ 12 min (8% B) dla 1 piku oraz ~ 19.4 min (43% B) dla 2 piku (rys. 222). Po zakończeniu rozdziału frakcje zawierające główną cząsteczką odparowano do sucha. Czystość sprawdzono wykonując spektrometr mas typu MALDI-TOF.
Tabela 28. Program gradientowy zastosowany do rozdziału w skali analitycznej
kolumna analityczna - XTerraTM RP185μm (4.6X150mm)
czas przepływ (ml/min) A% B% informacje dodatkowe program gradientowy 1 0 1 100 0 25 1 90 10 0.1 – 0.2 OD RNA 30 1 50 50 32 1 100 A - 10 mM NH4HCO3 47 1 100 B - 10 mM NH4HCO3/CH3CN (1/1 v/v) 47.01 0.10 100 AUFS = 0.2 program gradientowy 2 0 1 100 0 15 1 90 10 27 1 0 100 32 1 100 0 42 1 100 0 42.02 0.10 100 0
Tabela 29. Program gradientowy zastosowany do rozdziału w skali półpreparatywnej
kolumna półpreparatywna - XTerraTM RP187μm (7.8X150mm)
czas przepływ (ml/min) A% B% informacje dodatkowe program gradientowy 0 2 100 0 15 2 90 10 10 OD RNA 27 2 0 100 32 2 100 0 A 10 mM NH4HCO3 42 2 100 0 B 10 mM NH4HCO3/CH3CN (1/1 v/v) 42.02 0.10 100 0 AUFS = 2
A B
Rys. 222. Chromatogramy z rozdziału zanieczyszczonej cząsteczki G-CMeGGCGG-C, otrzymane techniką
HPLC: skala analityczna (A), skala preparatywna (B)
Elektroforeza poliakrylamidowa w warunkach denaturujących (PAGE)
Żel denaturujący 19% na dużą płytę: - mocznik 47.25 g
- żel poliakrylamidowy 40% (19:1) – 56.25 ml - bufor TBEx10 – 11.25 ml
- woda – 11.25 ml - APS - 1 ml
korek: 10 ml roztworu żelu + 10 µl TEMED - TEMED – do reszty 20 μl
- bufor elektroforetyczny - 1×TBE
Elektroforezę preparatywną w warunkach denaturujących stosowano do oczyszczania długiego oligorybonukleotydu (44-meru) syntetyzowanego chemicznie po etapie usunięcia grup ochronnych (grubość żelu 2 mm, rozmiar żelu 30×40 cm). Elektroforezę prowadzono 4 godziny przy mocy prądu 60 W. Główny oligorybonukleotyd eluowano z żelu 7 ml sterylnej, dejonizowanej wody przez 2 dni i następnie odsalano na kolumienkach NAP-25 (elucja sterylną, dejonizowaną H2O). Dla odsolonego oligomeru RNA wykonano widma masowe (MALDI-TOF), w celu sprawdzenia czy otrzymano cząsteczkę o właściwej długości.
VI.2.2. Oczyszczenie cząsteczek RNA od niskocząsteczkowych związków
Stosowane roztwory:
10 mM NH4HCO3
NH4HCO3 = 7 9.8 mg
H2O do 100 ml
W celu odsolenia próbek lub usunięcia innych niskocząsteczkowych zanieczyszczeń używano:
Kolumienki Sep-Pak C18
Kolumny zawierające silanizowane podłoże C18 przemyto 10 ml acetonitrylu, a następnie 10 ml 10 mM roztworu wodorowęglanu amonu. Na tak przygotowane kolumny nakładano próbki rozpuszczone w 10 ml 10 mM roztworu wodorowęglanu amonu. Zebrano trzy frakcje oznaczone odpowiednio:
L – przesącz uzyskany po nałożeniu próbki na kolumnę,
W – przemycie próbki 10 ml 10 mM roztworem wodorowęglanu amonu oraz
C – frakcja właściwa, zawierająca oligorybonukleotyd zebrany przez przemycie kolumny 5 ml 30 % roztworu acetonitrylu w wodzie.
Na płytce TLC wykonano w skali testowej próbę na obecność oligorybonukleotydu w trzech zebranych frakcjach lub badano absorbancję poszczególnych frakcji, a frakcję C zawierającą oligorybonukleotyd odparowano do sucha.
Kolumny Sephadex G-25
Odsalanie 44-meru przeprowadzono na kolumnie sporządzonej z żelu Sephadex G-25. Prędkość przemieszczania się cząsteczek wzdłuż żelu jest odwrotnie proporcjonalna do ich masy cząsteczkowej. Przed rozdziałem kolumnę przemyto 300 ml wody. Po prawie całkowitym odsączeniu wody znad żelu naniesiono roztwór RNA, a po jego wniknięciu w żel również ostrożnie naniesiono na kolumnę 1 ml wody w celu dalszego wniknięcia tego roztworu do wnętrza żelu. Po wniknięciu i tej porcji, kolumnę nad żelem napełniono ostrożnie sterylną, dejonizowaną wodą i utrzymywano jej objętość na względnie stałym poziomie przez cały czas prowadzenia rozdziału. Po zebraniu pierwszych 20 ml (frakcja bez RNA) podstawiono kolejne probówki na 10 ml, zbierając do nich następne frakcje po 10 ml. W sumie zebrano 9 frakcji zawierających RNA, z czego pierwsze 2 były odsolone, kolejne 7 było nadal zasolonych. Frakcje zasolone odparowano i wykonano dla nich ponownie rozdział na kolumnie. Odsolone RNA odparowano (wyparka wirówkowa).
Wytrącanie RNA
A.
Supernatant usunięto, dodano drugą porcję zawiesiny, ponownie zwirowano i usunięto supernatant. Osad przemyto 3 razy 100 μl suchego acetonu i wysuszono.
B.
Do 4.5 ml n-butanolu dodano ok. 0.5 ml roztworu 44-meru w trójfluorowodorku trójetyloaminy i dokładnie wymieszano. Następnie 5 ml tej zawiesiny umieszczono na 1 godzinę w -20ºC, po czym wirowano w 4 ºC przez 5 minut (5000 obr/min). Supernatant usunięto, a osad dosuszono.
Dializa
woreczek dializacyjny: SpectraIPor®CE(Cellulose Ester), MWCO 500, średnica 5 mm, objętość 1 ml
Do 3-krotnie przemytego sterylną wodą woreczka dializacyjnego dodano roztwór zasolonego oligomeru i woreczek umieszczono w litrowej butelce ze sterylną wodą. Dializę prowadzono przez 24 h w temperaturze 4°C lub temperaturze pokojowej cały czas mieszając. Wodę zmieniano 3 razy. Następnie zawartość woreczka dializacyjnego przeniesiono do próbówki Eppendorf i odparowano do sucha.
Ultrafiltracja
probówki ultrafiltracyjne: Amicon Ultra-4, membrana z regenerowanej celulozy o punkcie odcięcia
3 kDa, objętość 4 ml
Do 3-krotnie przemytej sterylną wodą probówki ultrafiltracyjnej dodano roztwór zasolonego oligomeru i probówkę umieszczono w wirówce. Szybkość wirowania (~ 10800 rpm) w temperaturze 25°C została tak dobrana, aby w ciągu 12 minut przefiltrować ~ 3 ml roztworu. Wodę zmieniano 3-4 razy otrzymując w ten sposób odsoloną próbkę. Metodę ultrafiltracji stosowano także do zmiany buforu. W tym celu odsoloną zawartość probówki przefiltrowano dodatkowo 2 krotnie, używając nowego buforu, a następnie pozostały roztwór przeniesiono do próbówki typu Shigemi i uzupełniono buforem do objętości 300μl. Tak przygotowana próbka była gotowa do dalszych badań.
Obliczanie ilości RNA do badań
Ilość RNA była obliczana spektrofotometrycznie, korzystając z wzorów przedstawionych poniżej:
OD=A·roz·V
A = absorbancja
roz = rozcieńczenie w kuwecie V = objętość całkowita roztworu [ml]
c = A /ε·l
c - stężenie [mol/dm3]
ε - współczynnik ekstynkcji [dm3/mol·cm] l - droga optyczna [cm]
Współczynniki ε obliczano korzystając z kalkulatora na stronie [http://www.ribotask.com/calculator.asp?PageID=40].
RNA OD260 1 = 40 μg/ml
Homogenność otrzymanego preparatu potwierdzano przy pomocy widma 1
H NMR, MALDI-TOF MS lub elektroforetycznie.