II. CZĘŚĆ LITERATUROWA
II.5. Struktury drugorzędowe cząsteczek zbudowanych z trójnukleoty-
Do tej pory struktura trójnukleotydowych powtórzeń r(CGG)n jest poznana w niewielkim stopniu. Najwięcej danych strukturalnych pochodzi z prac prowadzonych w ICHB PAN, w kilku zespołach badawczych, głównie w Pracowni Biomedycyny Naturalnej, Zespole Struktury i Funkcji Biomolekuł oraz Pracowni Chemii RNA. Dane literaturowe dotyczące struktury cząsteczek zbudowanych z powtórzeń r(CGG)n pochodzą głównie z badań biochemicznych (152;166;172;188-192), krystalografii (1;193) oraz ze spektroskopii UV (152).
Badania rozpoczęte na początku lat 90, przez Pracownię Biomedycyny Naturalnej kierowaną przez prof. W. Krzyżosiaka, nad strukturą cząsteczek RNA, zbudowanych z trójnukleotydowych powtórzeń były pionierskie. W ciągu następnych lat pracownia ta badała
chorób z grupy TREDs. Wśród analizowanych sekwencji znajdowały się powtórzenia typu CGG. Struktura drugorzędowa długich ciągów powtórzeń (CGG)n (n = 17, 20) została ustalona głównie w oparciu o dane pochodzące z badań biochemicznych (sondy chemiczne i mapowanie enzymatyczne) oraz w przypadku cząsteczki (CGG)20 została poparta analizą widm CD i różnicowych (TDS) (152). Obie te cząsteczki tworzyły spinki, jednak cząsteczka RNA zbudowana z 17 powtórzeń typu CGG preferowała tworzenie tzw. "poślizgniętej" struktury spinki (ang. slippery hairpins) (192). W roztworze, w porównywalnych ilościach, występowały dwie formy, które przedstawione są na rys. 77. Trzony spinek zbudowane są z sąsiadujących ze sobą par zasad G:C i C:G przedzielonych niedopasowaniem G:G. Pętla apikalna składa się z czterech lub trzech reszt nukleotydowych.
Rys. 77. Alternatywne struktury spinki utworzone przez powtórzenia r(CGG)17 (192)
Ciągi powtórzeń (CGG)n są bogate w reszty guanozyny i powinny wykazywać tendencję do tworzenia kwadrupleksów, zwłaszcza w obecności kationów potasu. Dla podobnych sekwencji jak (AGG)17 i (UGG)17 zarówno mobilność elektroforetyczna, miejsca cięć, jak i widma TDS i CD wskazywały na formowanie się struktury kwadrupleksu (152). Jednak jak już wspomniałam, próbkowanie enzymatyczne cząsteczki (CGG)20 (152),podobnie jak (CGG)17 (192),wskazywało, iż tworzą one struktury stabilnych spinek. Dla cząsteczki (CGG)20 zarejestrowano także widma różnicowe TDS w obecności kationów Na+
oraz K+, jednak widma te nie dowodziły formowania się struktury kwadrupleksu niezależnie od rodzaju kationu (rys. 78).
Jednak wyniki dalszych eksperymentów wskazywały na nietypowe zachowanie tej cząsteczki, które różniły ją od pozostałych cząsteczek tworzących spinkę, zbudowanych z powtórzeń (CUG)20 i (CCG)20. Podczas gdy widma CD cząsteczek (CCG)20 oraz (CUG)20 nie zmieniały się w zależności od typu kationu obecnego w roztworze (Na+
/K+) (rys. 79 A), w widmie CD cząsteczki (CGG)20 obserwowano zależność intensywności poszczególnych pasm od rodzaju kationu (rys. 79 B), podobnie jak dla cząsteczek (AGG)20 i (UGG)20 tworzących kwadrupleks (rys. 79 C). Widma te dla cząsteczki (CGG)20 są również bardziej złożone niż dla wszystkich pozostałych cząsteczek. W widmie pokazanym na rysunku 79 B pojawiają się dodatkowe pasma, ujemne przy 295 nm oraz dodatnie przy ~ 240 nm, które nie są charakterystyczne dla struktury spinki (152).
A B C
Rys. 79. Zależność widm CD dla spinki (A, B), kwadrupleksu (C) od rodzaju kationu (Na+ lub K+); [temperatura pokojowa, bufor podstawowy: 20 mM kakodylan sodu, 0.5 mM EDTA , pH 7.0]; (152)
Najprawdopodobniej cząsteczka (CGG)20 tworzy stabilną spinkę, jednakże w warunkach pomiaru widm CD oprócz tej formy współistnieje również inna konformacja, ale nie jest nią forma kwadrupleksu.
Jak już wspomniałam w normalnym trakcie mRNA co 9-11 powtórzeń CGG występują specyficzne, krótkie zaburzenia o sekwencji AGG. Jednak zaburzenia te nie występują zazwyczaj w ciągu RNA o patogennej licznie powtórzeń CGG. Jak ustalono stosując metody biochemiczne, powtórzenia trójnukleotydowe zawierające od 19 do 28 powtórzeń CGG tworzyły pojedynczą strukturę spinki (172). Jednak w niektórych przypadkach obecność nawet jednej trójki zasad AGG wpływała na zmianę struktury takich cząsteczek (172). Sekwencje zawierające motyw AGG tworzyły najczęściej bardziej skomplikowane układy spinek z dwoma lub trzema pętlami (rys. 80).
Rys. 80. Model struktury 2D dla powtórzeń (CGG)n - bez AGG, z jednym AGG, z dwoma AGG; Kolorem
Ciekawe wyniki otrzymała także inna grupa badaczy (Handa V., Usdin K.) dla cząsteczki o sekwencji (CGG)9AGG(CGG)12AGG(CGG)97, zawierającej fragment zbudowany z ponad 90 niezaburzonych powtórzeń CGG. Grupa ta wskazała na możliwość współistnienia oprócz formy spinki także formy kwadrupleksu (166). Stosując próbkowanie enzymatyczne takimi nukleazami jak T1 oraz S1 zaobserwowano pojawienie się w żelu natywnym szeregu prążków (rys. 81 A) świadczących o powstaniu złożonych struktur i obecności większej liczby konformacji. Wynik analizy profilu migracji fragmentów RNA wskazywał na współobecność kilku struktur spinek, pokazanych na rysunku 81 B. Jednak w wynikudziałania enzymów na tą cząsteczkę obserwowane były w żelu natywnym także prążki odpowiadające cząsteczkom o długości 158 nt oraz 232 nt, których intensywność wzrastała w obecności kationów potasu. Na podstawie tych miejsc cięcia zaproponowano model kwadrupleksu pokazany na rys. 81 B (vi).
A B
Rys. 81. Analiza struktury drugorzędowej cząsteczek (CGG)22 oraz (CGG)120 metodą ograniczonych trawień enzymatycznych z wykorzystaniem RNazy T1 i RNazy S1, (A), proponowane struktury drugorzędowe (B); (166)
Obecność zaburzeń AGG, prowadziła do rozdzielenia się dłuższej spinki na dwie lub trzy krótsze spinki (rys. 81 B ii, iii). Dla porównania cząsteczka (CGG)22, zbudowana ze znacznie mniejszej liczby powtórzeń, która nie zawierała zaburzenia AGG, była trawiona przez nukleazy tylko w środkowej części sekwencji i tworzyła pojedynczą formę spinki (166). Badania przeprowadzone w naszym instytucie prowadziły do podobnych wniosków (rys. 80). Wyniki obydwu eksperymentów dowodzą, iż rola sekwencji zaburzających AGG, może polegać na destabilizacji struktur spinkowych. Jednak nie wykazano, aby obecność 1-2 powtórzeń AGG wpływała na efektywność translacji mRNA zawierającego motyw (CGG)65-66 in vitro ani in vivo (190).
Badania biochemiczne z użyciem białek z rodziny hnRNP także pozwoliły na zgłębienie wiedzy o strukturze drugorzędowej powtórzeń r(CGG). Białka takie jak CBF-A oraz hnRNP A2 destabilizują antyrównoległe, dwucząsteczkowe kwadrupleksy zbudowane z powtórzeń d(CGG)n (75). Dowiedziono, że białka te destabilizują także struktury kwadrupleksów RNA zbudowanych z powtórzeń (CGG)n (188;189). Przykładowo cząsteczka o sekwencji r(CGG)7-CGUGGACUC oprócz formy jednoniciowej tworzyła także dwucząsteczkowy kwadrupleks (188), dla którego stechiometria została ustalona wcześniej (64). W obecności białka hnRNP A2 dwucząsteczkowy kwadrupleks był destabilizowany do formy jednoniciowej (rys. 82). Efektywność destabilizacji kwadrupleksu zależała od rodzaju mutacji wprowadzonej w białku hnRNP A2, przy czym białko niemodyfikowane najefektywniej destabilizowało strukturę kwadrupleksu (~ 76%), w warunkach natywnej elektroforezy (rys. 82) (188).
A B
Rys. 82. Zależność procentowego udziału dwucząsteczkowego kwadrupleksu od stężenia białka hnRNP A2
(A), profil migracji formy jednoniciowej (SS, ang. single strand) oraz kwadrupleksu (G'2) w natywnym żelu
w zależności od obecności oraz typu mutacji w białku hnRNP A2 (B)(188)
Długie ciągi powtórzeń CGG w 5'-UTR mRNA (zakres premutacji) przyjmują stabilną strukturę spinki czy kwadrupleksu, co utrudnia przebieg translacji, gdyż powstawanie takich struktur może prowadzić między innymi do obniżonej zdolności wiązania mRNA z polirybosomami. Wykazano, że poziom translacji wzrastał w obecności pewnych białek z rodziny hnRNP, które są znane ze swoich właściwości destabilizujących strukturę kwadrupleksów, zbudowanych z powtórzeń CGG. Przykładowo, w obecności białka hnRNP A2 lub CBF-A wzrastała wydajność translacji in vivo dla fragmentów RNA o sekwencji (CGG)10AGG(CGG)9AGG(CGG)12, (CGG)66 oraz (CGG)99 (rys. 83). Efekt ten był największy dla długiego ciągu powtórzeń (CGG)99 obejmującego już zakres premutacji. Wzrost wydajności translacji był możliwy dzięki destabilizacji struktury kwadrupleksu do formy jednoniciowej RNA (189).
A B C
Rys. 83. Porównanie wydajności translacji w zależności od ilości mRNA bez dodatkowego białka (A),
Na rysunku 84 przedstawiłam zależność wydajności translacji (CGG)n-FL mRNA dla różnej długości powtórzeń (CGG)n, w zależności od obecności białka CBF-A i/lub pochodnej porfiryny TMPyP4.
wzór strukturalny TMPyP4 Rys. 84. Graficzne przedstawienie wpływu ilości powtórzeń (CGG)n oraz obecności białka CBF-A lub
pochodnej porfiryny TMPyP4 na wydajność translacji (CGG)n-FL mRNA in vivo (191)
Dla sekwencji (CGG)30, obecność białka CBF-A oraz TMPyP4 nie miała większego wpływu na wydajność translacji (rys. 84), jednak stosując to samo białko łącznie z TMPyP4 dla cząsteczki (CGG)99, zawierającej znacznie większą ilość powtórzeń, uzyskano znaczący wzrost wydajności translacji w stosunku do próby odniesienia (191). Zdecydowanie inne zachowanie cząsteczek RNA, zbudowane z ponad 90 powtórzeń CGG, z białkami z rodziny hnRNP może świadczyć, iż dłuższe cząsteczki łatwiej tworzą kwadrupleksy.
Do tej pory nie ma żadnych danych strukturalnych o cząsteczkach zbudowanych z powtórzeń r(CGG), uzyskanych metodami NMR. Dotychczas ukazało się jedynie pojedyncze doniesienie literaturowe, w którym zawarte są nieliczne eksperymenty NMR w postaci fragmentów widm 2D NOESY. Wyniki badań dla pokazanych poniżej trzech sekwencji RNA sugerują, że cząsteczki zawierające powtórzenia CGG tworzą dupleksy z parami zasad G:G (rys. 85 A) lub zawiązują struktury typu spinki (rys. 85 B-C).2
Obecność dodatkowej sekwencji zaburzającej, AGG, w ciągu powtórzeń CGG, nie wpływa na stabilność spinki w fizjologicznym stężeniu jonów magnezu (194).
Rys. 85. Schematyczna struktura dupleksu, sekwencja flankująca GG-X-C (A), spinki, sekwencja flankująca GG-X-CC, pętla ACUUCGGU (B), spinki z zaburzeniem AGG, sekwencja flankująca GG-X-CC, pętla ACUUCGGU (C)