Potranslacyjne modyfikacje chemeryny w ludzkim naskórku

Ludzka chemeryna syntetyzowana jest jako prekursor zbudowany ze 163 aminokwasów, a po usunięciu 20 aminokwasowego peptydu sygnałowego, wydzielana jest poza komórkę jako chemeryna 163S (gdzie 163S oznacza terminalną serynę w pozycji 163). Ta obecna w surowicy forma jest nieaktywna biologicznie [33]. Do uzyskania pełnej aktywności niezbędna jest modyfikacja proteolityczna jej końca karboksylowego. Enzymami zaangażowanymi w aktywację chemeryny są białka z rodziny proteaz serynowych biorących udział w reakcjach zapalnych [33, 7] oraz proteaz cysteinowych pochodzących zarówno z własnych komórek [34, 35] jak i niektórych drobnoustrojów [36]. Ilość aminokwasów usuniętych z końca karboksylowego chemeryny bezpośrednio wpływa na jej aktywność chemotaktyczną.

Do najbardziej aktywnych chemotaktycznie form chemeryny należy forma Chem157S, która kończy się na serynie w pozycji 157 i jest krótsza od formy 163S o sześć aminokwasów na końcu C [10].

Ryc. 2 Sekwencja chemeryny. Kolorem żółtym podkreślono peptyd sygnałowy, kolorem czerwonym i niebieskim zaznaczony jest region, który podlega proteolizie w różnych miejscach chemeryny obecnej w płynach zapalnych. Kolorem zielonym zaznaczone są reszty lizyny i glutaminy. Liczbami oznaczono koniec-C form chemeryny, odpowiednio Chem149Y, Chem154F, Chem157S i Chem163S.

Forma w jakiej chemeryna występuje w ludzkim naskórku pozostaje nieznana.

Ponieważ ilość aminokwasów usuniętych z karboksylowego końca chemeryny może

rzutować na jej aktywność biologiczną, istotnym wydawało się zidentyfikowanie formy

w jakiej chemeryna występuje w naskórku. Próbując odpowiedzieć na to pytanie

wykonano analizę Western Blot naskórków pobranych od piętnastu różniących się

wiekiem pacjentów obojga płci. Biorąc pod uwagę, iż forma chemeryny może zależeć

od miejsca pobrania, badano wycinki skórne pochodzące z różnych rejonów ciała.

18

Ponieważ nie zaobserwowano znaczących różnic pomiędzy dawcami materiału ani miejscami pobrania wycinków skóry, wyniki przedstawiono dla trzech reprezentatywnych próbek (Ryc. 3A). Analiza Western Blot prowadzona w warunkach redukujących, chemeryny obecnej w ludzkim naskórku ujawniła dominujący produkt o masie cząsteczkowej (>70 kDa) przekraczającej znacznie masę cząsteczkową rekombinowanego białka Chem157S (~18 kDa). Zaobserwowano również szereg innych produktów, wszystkie o masie przekraczającej masę cząsteczkową rekombinowanej chemeryny. Aby precyzyjniej określić formę w jakiej produkowana jest chemeryna przez keratynocyty, przeprowadzono również analizę Western Blot mediów pochodzących z hodowli organotypowych pierwotnych, ludzkich keratynocytów (Ryc. 3B). Tak jak w przypadku lizatów naskórka, białko uwalniane do medium przez keratynocyty i najsilniej wykrywane przez przeciwciała przeciwko ludzkiej chemerynie miało masę >70 kDa.

Ryc. 3 Chemeryna produkowana przez keratynocyty występuje w wysokocząsteczkowej formie.

Analiza Western Blot: A – chemeryny obecnej w ludzkim naskórku (M37 skroń – skóra pobrana ze skroni 37 letniego mężczyzny, K61 udo – skóra pobrana z uda 61 letniej kobiety, K33 ramię – skóra pobrana z ramienia 33 letniej kobiety), wyniki reprezentatywne dla 15 dawców i 3 powtórzeń, B - chemeryny uwolnionej do medium przez keratynocyty wyizolowane z ucha 15 letniego mężczyzny (medium), wyniki reprezentatywne dla 5 powtórzeń. Jako kontrolę wykorzystano rekombinowaną chemerynę, której sekwencja kończy się na serynie w pozycji 157- 157S (chemeryna). Do detekcji użyto biotynylowanych kozich przeciwciał przeciw ludzkiej chemerynie oraz streptawidyny sprzęgniętej z peroksydazą chrzanową.

19

Uzyskany wynik sugeruje, iż chemeryna produkowana przez keratynocyty łączy się poprzez wiązanie kowalencyjne z innymi białkami, tworząc białkowe kompleksy o dużej masie cząsteczkowej. Odpowiedź na pytanie jaki rodzaj modyfikacji może leżeć u podstaw tworzenia wielkocząsteczkowych produktów chemerynowych pochodzi z wnętrza sekwencji chemeryny (Ryc. 2), w której skład wchodzą liczne reszty lizyny i glutaminy (zaznaczone kolorem zielonym) oraz ko-lokalizacja w naskórku chemeryny i enzymów mających zdolność do tworzenia wiązań pomiędzy resztami lizyny i glutaminy tzw. transglutaminaz [37].

Transglutaminazy (TG), enzymy licznie występujące w tkankach, odpowiedzialne są za potranslacyjne modyfikacje białek - katalizują tworzenie się wiązań peptydowych pomiędzy lizyną, a glutaminą. TG tworzą pewnego rodzaju tarczę ochronną w warstwie rogowej naskórka poprzez wiązanie białek podatnych na proteolizę z inhibitorami proteaz bądź proteoglikanami lub sfingolipidami macierzy zewnątrzkomórkowej. Produkty reakcji transglutaminacji, nierozpuszczalne białka o duże masie cząsteczkowej, charakteryzują się znaczną odpornością na mechaniczne uszkodzenia jak i proteolityczną degradację [38]. Do tej pory zidentyfikowano 8 białek należących do rodziny transglutaminaz [39]. Enzymami ulegającymi ekspresji w skórze są TG1 i 3 (obecne we wszystkich warstwach naskórka) [37], oraz TG5 produkowana głównie przez keratynocyty warstwy ziarnistej [40].

Enzymy proteolityczne obecne w naskórku mają zdolność kształtowania lokalnego środowiska zarówno poprzez degradację białek macierzy zewnątrzkomórkowej jak i regulację procesów zapalnych aktywując prekursory cytokin i chemokin [41]. W stanach chorobowych skóry takich jak łuszczyca czy atopowe zapalenie skóry obserwowana jest zwiększona ilość enzymów proteolitycznych w naskórku [37, 41, 42]. Nadmierna lub nieprawidłowa proteoliza białek może prowadzić to rozwoju stanu zapalnego, którego efektem będą zmiany chorobowe w obrębie tkanki objętej procesem zapalnym. Proces transglutaminacji wydaje się być mechanizmem zaradczym, przeciwdziałającym wzmożonej proteolizie białek [38].

Zwiększona masa cząsteczkowa chemeryny wydzielanej przez keratynocyty, obecność

licznych reszt lizyny i glutaminy w jej sekwencji, ko-lokalizacja chemeryny

i transglutaminaz oraz zbieżność w strukturze chemeryny i cystatyn [14, 43], jednego ze

znanych substratów dla transglutaminaz [44] sugerują, iż chemeryna może być

potencjalnym substratem dla tych enzymów. Celem potwierdzenia tej tezy,

20

rekombinowaną chemerynę inkubowano w obecności medium z hodowli ludzkich keratynocytów, transglutaminaz oraz inhibitorów transglutaminaz. Ponieważ TG1 i TG3, tak jak chemeryna, obecne są we wszystkich warstwach naskórka, i ze względu na wspólną ko-lokalizację z dużym prawdopodobieństwem mogą być zaangażowane w modyfikacje chemeryny w naskórku, w badaniach wykorzystano TG1 i TG3. Wyniki analizy Western Blot produktów transglutaminacji chemeryny zostały przedstawione na Ryc. 4A oraz 4B.

Ryc. 4 Chemeryna jest substratem dla transglutaminaz naskórkowych. Analiza Western Blot produktów reakcji transglutaminacji chemeryny. Badany materiał: A – rekombinowana chemeryna inkubowana z medium z organotypowej hodowli ludzkich keratynocytów w obecności transglutaminaz 1 lub 3 oraz inhibitorów transglutaminaz, B – rekombinowana chemeryna inkubowana w obecności transglutaminaz 1 i 3 oraz inhibitorów. Do detekcji chemeryny użyto biotynylowanych kozich przeciwciał przeciw ludzkiej chemerynie oraz streptawidyny sprzęgniętej z peroksydazą chrzanową.

Wyniki reprezentatywne dla pięciu powtórzeń.

Inkubacja rekombinowanej chemeryny w obecności medium z hodowli keratynocytów skutkowała pojawieniem się dominującego produktu o masie >70 kDa oraz dwóch dodatkowych produktów o masie ~40 kDa i ~55 kDa (Ryc. 4A). Uzyskane wyniki wskazują, iż w medium mogą być obecne transglutaminazy mające zdolność tworzenia wiązań pomiędzy chemeryną, a innymi białkami wydzielanymi do medium.

Dodanie rekombinowanych transglutaminaz powodowało, że przeciwciała skierowane

przeciwko ludzkiej chemerynie silniej wykrywały produkty o masie ~40 kDa i ~55 kDa

oraz wykrywały produkty o masie >100 kDa. Tworzenie się produktów o zwiększonej

21

masie cząsteczkowej hamowane było poprzez dodanie inhibitorów. Obecność produktów o masie ~40 kDa i ~55 kDa, co w przybliżeniu odpowiada kolejno masie dwóch i trzech cząsteczek chemeryny, sugeruje, iż chemeryna potencjalnie może tworzyć produkty transglutaminacji sama ze sobą. Istotnie, wykrywane produkty inkubacji rekombinowanej chemeryny w obecności obu transglutaminaz również miały masę ~40 kDa, ~55 kDa i ~70 kDa (Ryc. 4B). Odpowiada to masie dwóch, trzech i czterech cząsteczek chemeryny. Produkty przekraczające swoją masą 100kDa mogły być efektem powstania wielocząsteczkowych konglomeratów chemeryny lub chemeryny związanej z enzymem (co stanowi produkt pośredni w procesie transglutaminacji). Uzyskane wyniki pokazują, że chemeryna poprzez wiązania kowalencyjne ma zdolność łączenia się sama ze sobą oraz z innymi białkami wydzielanymi przez keratynocyty, a enzymami katalizującymi powstawanie tych połączeń są transglutaminazy naskórkowe. Znaczeniem fizjologicznym obserwowanego procesu może być konieczność ochrony chemeryny przed wzmożoną proteolizą i generowaniem chemotaktycznie aktywnych from. To z kolei może przeciwdziałać nadmiernemu napływowi komórek układu odporności i hamowaniu powstawania stanu zapalnego. Tworzenie agregatów chemerynowych może również wpływać na lokalne zagęszczenie chemeryny, co będzie wspomagało inne niż napływ komórek immunologicznych, funkcje chemeryny w naskórku.

W niniejszej pracy po raz pierwszy podjęto próbę określenia formy w jakiej chemeryna występuje w naskórku. Pokazano, iż chemeryna ma zdolność wiązania się zarówno z innymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej naskórka jak i tworzenia chemerynowych „super-cząsteczek” oraz zidentyfikowano enzymy potencjalnie zaangażowanie w te procesy. Jednakże, uzyskane wyniki są punktem wyjścia do dalszych badań nad modyfikacjami chemeryny w naskórku, gdyż niezbędnym jest określenie składu „super-cząsteczek” chemerynowych przy wykorzystaniu np.

spektroskopii masowej.

22