Uniwersytet Jagielloński
Wydział Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii
Ochronna rola chemeryny w fizjologii naskórka
mgr Magdalena Banaś
Praca wykonana pod kierunkiem prof. dr hab. Joanny Cichy
w Zakładzie Immunologii
Wydziału Biochemii, Biofizyki i Biotechnologii Uniwersytetu Jagiellońskiego
Kraków 2015
1
Składam serdeczne podziękowania mojemu promotorowi Pani Profesor Joannie Cichy za owocną współpracę, pomoc,
cenne rady oraz wyrozumiałość okazaną podczas przygotowywania niniejszej pracy.
Szczególne podziękowania kieruję do Asi Marczyńskiej oraz Mateusza Kwitniewskiego, bez których niniejsza praca nie mogłaby powstać.
Dziękuję również Anecie Zegar i Kasi Zabiegło za współpracę, oraz całemu Zespołowi
za wspaniałą atmosferę w laboratorium.
2
Dla Moich Rodziców.
Sprawiacie, że wszystko jest możliwe.
3
Spis treści
1. Streszczenie ... 4
2. Abstract ... 6
3. Cele pracy ... 8
4. Regulacja ekspresji chemeryny w naskórku ... 10
5. Potranslacyjne modyfikacje chemeryny w ludzkim naskórku ... 17
6. Funkcja chemeryny w naskórku ... 22
7. Bibliografia ... 26
8. Załączniki: ... 31
4
1. Streszczenie
Chemeryna, białkowy produkt genu TIG2 (ang. tazarotene induced gene 2), to niedawno odkryty czynnik chemotaktyczny regulujący migrację komórek układu immunologicznego, posiadających na swej powierzchni receptor CMKLR1. Chemeryna kontroluje również rozwój i fizjologię komórek tłuszczowych, osteoblastów, miocytów oraz reguluje metabolizm glukozy, co czyni ją łącznikiem pomiędzy procesami metabolicznymi, a układem odporności. Chociaż za głównych producentów chemeryny uważa się wątrobę i tkankę tłuszczową, chemeryna obecna jest również w nabłonkach, np. w naskórku, jednak jej funkcja i forma, w jakiej występuje oraz mechanizmy jej regulacji w tkankach nabłonkowych pozostają niewyjaśnione. Co ciekawe, ekspresja chemeryny w naskórku zanika w łuszczycy, chorobie o podłożu autoimmunizacyjnym, co sugeruje ochronne funkcje chemeryny w tej tkance.
Aby określić mechanizmy regulacji ekspresji chemeryny w naskórku, przygotowano trójwymiarowe (3D), organotypowe hodowle pierwotnych ludzkich keratynocytów, które naśladują morfologicznie i funkcjonalnie wielowarstwowy, ludzki naskórek.
Naskórek stanowi naturalną barierę ciała, w związku z tym oddziałują na tą tkankę zarówno obecne w środowisku mikroorganizmy, jak i czynniki uwalnianie przez komórki układu odporności naciekające skórę w stanach zapalnych. Założono zatem, że wśród czynników wpływających na poziom ekspresji chemeryny w naskórku znajdują się zarówno bakterie, jak również cytokiny o kluczowym znaczeniu w indukcji łuszczycy, a także cytokiny ostrej fazy, których zadanie polega na przywróceniu naturalnej homeostazy organizmu naruszonej w wyniku stanu zapalnego. Wykazano, że chemeryna w hodowlach naskórka, jest różnicowo regulowana przez bakterie. Podczas gdy cytokiny „ostrej fazy” tj. onkostatyna M i/lub IL-1stymulują ekspresję chemeryny w keratynocytach, cytokiny pełniące kluczową rolę w patogenezie łuszczycy, IL-17 i/lub IL-22 hamują syntezę tego białka w naskórku. Zgadza się to z obrazem klinicznym łuszczycy, gdzie ekspresja chemeryny w zmienionym chorobowo naskórku jest zahamowana.
Chemeryna wydzielana jest poza komórkę jako nieaktywna biologicznie cząsteczka,
która ulega aktywacji w wyniku usunięcia hamującej sekwencji zlokalizowanej na
końcu C przez proteinazy serynowe i cysteinowe. Chemeryna występuje w różnych
izoformach, które różnią się długością i stopniem aktywności. Podjęto próbę
5
zidentyfikowania izoformy w jakiej chemeryna występuje w naskórku. Wykazano, iż chemeryna ulega potranslacyjnym modyfikacjom in vitro w wyniku reakcji transglutaminacji katalizowanej przez transglutaminazy naskórkowe. Tego rodzaju modyfikacje mogą być potencjalnie odpowiedzialne za tworzenie wysokocząsteczkowych form chemeryny wykrywanych w naskórku.
Chemeryna pod względem budowy zbliżona jest do katelicydyn, czynników o działaniu antybakteryjnym. Postawiono zatem hipotezę, iż chemeryna może posiadać własności antybakteryjne. Pokazano po raz pierwszy, że zarówno rekombinowana ludzka chemeryna jak i chemeryna wydzielana przez keratynocyty w hodowlach organotypowych hamuje wzrost bakterii. Ponadto, wykazano, że myszy z genetycznym deficytem chemeryny charakteryzują się ograniczoną zdolnością kontroli wzrostu bakterii w modelu infekcji skórnej. Odkryto tym samym zupełnie nową funkcję tego białka. Ponadto zidentyfikowano region Val
66-Pro
85(peptyd 4) zlokalizowany w środkowej części chemeryny, jako fragment głównie odpowiedzialny za własności antybakteryjne całego białka. Syntetyczny peptyd Val
66-Pro
85charakteryzuje się dużym potencjałem bakteriobójczym w porównaniu do znanych czynników przeciwbakteryjnych oraz szerokim spektrum działania.
Podsumowując, w niniejszej pracy zidentyfikowano po raz pierwszy czynniki mogące regulować poziom ekspresji chemeryny w naskórku. Pokazano niebadane do tej pory modyfikacje chemeryny, które mogą wpływać na jej stabilność i funkcję w naskórku. Ponadto zaprezentowano nową, przeciwbakteryjną funkcję tego białka.
Sugeruje to, iż chemeryna jest istotnym czynnikiem biorącym udział w utrzymaniu
homeostazy naskórka.
6
2. Abstract
Chemerin also known as tazarotene induced gene 2 (TIG2) is a ligand for CMKLR1 receptor and is responsible for regulating CMKLR1+ immune cells influx during inflammation. Chemerin is also involved in adiopogenesis, osteoblastogenesis and myogenesis. Moreover, it regulates glucose intake and can serve as a link between metabolism and immunity. Although, liver and fat tissue are the main producers of chemerin, this protein is also present in epithelium, for example in epidermis, where its function, form, and regulation of expression are yet to be determined. Interestingly, chemerin expression in epidermis is strongly downregulated in skin of individuals suffering from psoriasis, an autoinflammatory disease, suggesting that chemerin may play a protective role in epidermis.
In order to determine mechanism(s) that underlay chemerin expression in human epidermis, we developed a model of human epidermis, that consist of primary, human keratinocytes growing in three-dimensional (3D) cell cultures. Because epidermis is a natural body barrier, it has a contact with both, numerous microorganisms that are present in the skin environment, and factors released by immune cells that infiltrate the tissue. Therefore, we hypothesized chemerin expression may be regulated on the one hand, by bacteria, and on the other, by cytokines released during skin inflammation. The latter involves IL-17 and IL-22 that drive keratinocyte pathology in psoriasis, and acute phase mediators oncostatin M (OSM) and IL-1, which mobilize protective responses.
We showed that specific strains of bacteria have different potential to induce chemerin expression in epidermis. Acute phase mediators such as OSM and IL-1also upregulated, whereas IL-17 and IL-22 downregulated chemerin expression in human epidermis. This is consistent with clinical manifestation of psoriasis, where chemerin levels are significantly reduced in epidermis.
Chemerin is produced and secreted in its biologically inactive form, and requires C terminal proteolytic processing in order to gain chemotactic activity. Serine and cysteine proteases are responsible for generation of chemotactively active chemerin isoform(s). Therefore, we asked which chemerin isoform is present in human epidermis.
We determined that chemerin undergoes posttranslational modifications in vitro and
epidermal transglutaminases might be responsible for these modifications, leading to
generation of high-molecular weight chemerin isoforms detected in epidermis.
7
Given that chemerin and antibacterial cathelicidins share similar structure, and that chemerin is present in natural body barriers, we hypothesized that chemerin may posses antimicrobial properties. Indeed, both recombinant chemerin and chemerin released by human primary keratinocytes growing in 3D cultures, was able to inhibit bacteria growth in vitro. Moreover, chemerin deficient mice in cutaneous infection model, were more prone to bacterial infections in comparison to wild type animals. In addition, we identified internal chemerin fragment Val
66-Pro
85(peptide 4) as chemerin domain primarily responsible for chemerin antibacterial activity. Synthetic peptide 4 alone was proven to be a strong antimicrobial agent with wide spectrum of activity toward different strains of bacteria.
In conclusion, we identified for the first time agents that may regulate chemerin
expression in epidermis, and characterized new posttranslational modifications of
chemerin that may influence chemerin stability, activity and bioavailability in
epidermis. Finally, we identified novel antimicrobial function of chemerin. Together,
these findings suggest that chemerin may play an important role in maintaining skin
homeostasis.
8
3. Cele pracy
Chemeryna jest białkowym chemoatraktantem i adipokiną o istotnej funkcji w procesach zapalnych i metabolicznych. Wydzielana jest w postaci nieaktywnej biologicznie proformy i do uzyskania pełnej aktywności chemotaktycznej wymaga proteolitycznej modyfikacji końca C. Chociaż chemeryna jest wykrywana w naskórku osób zdrowych, a jej stężenie w naskórku drastycznie maleje w niektórych chorobach skóry, to jej funkcja, mechanizmy regulacji ekspresji oraz forma w jakiej występuje w tej tkance pozostawała niewyjaśniona. W niniejszej pracy postawiono następujące cele badawcze:
1. Określenie poziomu ekspresji chemeryny w naskórku w porównaniu do innych tkanek oraz identyfikacja czynników potencjalnie regulujących ekspresję chemeryny w tej tkance. Opis tych badań zawarto w pracy:
Banas M, Zegar A, Kwitniewski M, Zabieglo K, Marczynska J, Kapinska- Mrowiecka M, LaJevic M, Zabel BA, Cichy J. (2015) The expression and regulation of chemerin in the epidermis. Plos ONE 10(2): e0117830 (Załącznik 1)
2. Określenie formy w jakiej chemeryna występuje w ludzkim naskórku oraz opis potencjalnych modyfikacji jakim chemeryna może być poddawana w tej tkance.
Uzyskane wyniki badań przedstawione w niniejszej pracy nie zostały opublikowane.
3. Określenie roli chemeryny w naskórku. Założono, że ze względu na strategiczną pozycję chemeryny w naskórku reprezentującym naturalną barierę ciała, oraz podobieństwo strukturalne do przeciwbakteryjnych katelicydyn, funkcja chemeryny w naskórku będzie polegała na kontroli wzrostu bakterii mających kontakt z tą tkanką. Weryfikacja tej hipotezy zawierała trzy etapy:
a) Zbadanie funkcji rekombinowanej chemeryny jako czynnika
przeciwbakteryjnego oraz identyfikację potencjalnej domeny odpowiedzianej za
przeciwbakteryjną funkcję tego białka. Opis tych badań zawarto w pracach:
9
Kulig P, Kantyka T, Zabel BA, Banas M, Chyra A, Stefanska A, Tu H, Allen SJ, Handel TM, Kozik A, Potempa J, Butcher EC, Cichy J. (2011) Regulation of chemerin chemoattractant and antibacterial activity by human cysteine cathepsins. J Immunol 187: 1403-1410 (Załącznik 2)
Banas M, Zabieglo K, Kasetty G, Kapinska-Mrowiecka M, Borowczyk J, Drukala J, Murzyn K, Zabel BA, Butcher EC, Schroeder JM, Schmidtchen A, Cichy J. (2013) Chemerin is an antimicrobial agent in human epidermis. Plos ONE 8(3): e58709 (Załącznik 3)
b) Zbadanie czy chemeryna wydzielana przez pierwotne, ludzkie keratynocyty posiada własności bakteriobójcze. Opis tych badań zawarto w pracy:
Banas M, Zabieglo K, Kasetty G, Kapinska-Mrowiecka M, Borowczyk J, Drukala J, Murzyn K, Zabel BA, Butcher EC, Schroeder JM, Schmidtchen A, Cichy J. (2013) Chemerin is an antimicrobial agent in human epidermis. Plos ONE 8(3): e58709 (Załącznik 3)
c) Analizę porównawczą podatności na infekcje bakteryjne skóry zwierząt produkujących funkcjonalną chemerynę i zwierząt z deficytem chemeryny. Opis tych badań zawarto w pracy:
Banas M, Zegar A, Kwitniewski M, Zabieglo K, Marczynska J, Kapinska-
Mrowiecka M, LaJevic M, Zabel BA, Cichy J. (2015) The expression and
regulation of chemerin in the epidermis. Plos ONE 10(2): e0117830 (Załącznik
1)
10
4. Regulacja ekspresji chemeryny w naskórku
Chemeryna jest wielofunkcyjnym białkiem głównie znanym ze względu na swoje własności chemotaktyczne oraz regulację różnicowania komórek tłuszczowych.
Gen kodujący chemerynę po raz pierwszy został odkryty w skórze stymulowanej tazarotenem, pochodną kwasu retinowego i nazwany TIG2 (ang. tazarotene induced gene 2) [1]. Chemeryna jest ligandem dla metabotropowego receptora związanego z białkiem G, CMKLR1 (ang. chemokine-like receptor 1) [2, 3, 4] i ma zdolność regulacji napływu komórek, które posiadają na swojej powierzchni receptor CMKLR1.
Należą do nich komórki układu odporności takie jak plazmacytoidalne komórki dendrytyczne (pDC), makrofagi oraz komórki NK [4, 5, 6, 7]. Czyni to chemerynę istotnym czynnikiem biorącym udział w rozwoju odpowiedzi immunologicznej.
Oprócz CMKLR1, z podobnym powinowactwem chemeryna wiąże się z dwoma innymi receptorami, GPR1 (ang. G protein-coupled receptor 1) oraz CCLR2 (ang. CC- motif chemokie like receptor 2). [8, 9]. Wśród wymienionych receptorów związanie chemeryny tylko z CMKLR1 skutkuje internalizacją receptora, mobilizacją jonów wapnia w komórce oraz migracją komórki zgodnie z gradientem chemeryny [3, 10].
Funkcje dwóch pozostałych receptorów pozostają słabo poznane, chociaż istnieją doniesienia, iż GPR1 może brać udział w utrzymywaniu prawidłowego stężenia glukozy we krwi [11], a CCLR2 reguluje lokalny poziom chemeryny poprzez wiązanie i prezentację chemeryny innym komórkom wyposażonym w receptor CMKLR1 [9, 12, 13].
Za głównych producentów chemeryny w organizmie, odpowiedzialnych za
utrzymywanie stosunkowo wysokiego, nanomolowego (~4 nM) stężenia chemeryny
w surowicy [14] uznaje się wątrobę oraz tkankę tłuszczową [10]. Badania ostatnich lat
pokazują, że chemeryna ulega znaczącej ekspresji również w nabłonkach tworzących
naturalne bariery organizmu, w płucach, jelitach oraz skórze [1, 16, 17, 18]. Jednakże
poziom ekspresji w tych barierach na tle innych rezerwuarów chemeryny pozostawał
nieznany. Dlatego w pierwszym etapie tej części badań wykonano analizę porównawczą
mysich tkanek, która ujawniła, że ekspresja genu TIG2 w skórze jest w przybliżeniu
dziesięć i sześć razy niższa w porównaniu do wątroby i tłuszczu (Załącznik 1, Ryc. 1A),
a na poziomie białka stężenie chemeryny w lizatach z tkanek było około dwa i trzy razy
niższe w skórze w odniesieniu do wątroby i tłuszczu (Załącznik 1, Ryc. 1B).
11
Rozwarstwienie skóry na naskórek i skórę właściwą ujawniło, iż to frakcja epidermalna jest głównie odpowiedzialna za produkcję chemeryny w zdrowej skórze, a poziom ekspresji chemeryny w tej tkance zbliżony jest do tego obserwowanego w wątrobie (Załącznik 1, Ryc. 1B). Zgadza się to z danymi literaturowymi, uzyskanymi w oparciu o badania immunohistochemiczne preparatów skórnych, iż chemeryna w zdrowej skórze lokalizuje się głównie w naskórku [16]. Jak opisano to powyżej, chemeryna może się wiązać do trzech receptorów, dlatego też aby zbadać czy poziom chemeryny jest regulowany lokalnie w tkankach poprzez wiązanie się chemeryny do tych receptorów przeprowadzono analizę ekspresji CMLR1, CCLR2 oraz GPR1 w wątrobie, tłuszczu trzewnym oraz skórze i jej frakcjach. Transkrypt dla wszystkich receptorów był obecny w każdej z badanych tkanek. Najwyższą ekspresję CMKLR1 zanotowano w tłuszczu, natomiast poziom mRNA dla CCLR2 i GPR1 najwyższy był w skórze, w szczególności w skórze właściwej (Załącznik 1, Ryc. 1C-1E). Uzyskane wyniki sugerują, że lokalne stężenie chemeryny w skórze może być regulowane poprzez wiązanie się chemeryny do wszystkich receptorów. Potwierdzają to wyniki uzyskane przez innych członków zespołu na zwierzętach z wyciszonymi genami kodującymi CMKLR1 i CCLR2 (Załącznik 1, Ryc. 1F-1G). Myszy z deficytem GPR1 nie były dostępne do wykonania podobnych badań. Analiza porównawcza ekspresji chemeryny i jej receptorów w ludzkich tkankach dała zbliżone wyniki do tych obserwowanych w mysich tkankach, za wyjątkiem braku znaczących różnic w ekspresji CMKLR1, CCLR2 oraz GPR1 pomiędzy naskórkiem, a skórą właściwą (Załącznik 1, Ryc. 2A-2E).
Profil ekspresji chemeryny jest inny w skórze zdrowej niż tej dotkniętej
zmianami chorobowymi o podłożu autoimmunizacyjnym, takich jak łuszczyca. Jak
wspomniano wyżej, w zdrowej skórze głównymi producentami chemeryny są komórki
budulcowe naskórka – keratynocyty, natomiast chemeryna nie jest wykrywana w skórze
właściwej. U pacjentów cierpiących na łuszczycę ekspresja chemeryny w naskórku jest
znacząco obniżona, przy jednoczesnej produkcji chemeryny przez komórki tworzące
skórę właściwą, gdzie pełni ona rolę chemoatraktanta dla komórek układu odporności
[1, 15, 16]. Korelacja pomiędzy profilem ekspresji chemeryny w naskórku i skórze
właściwej, a wystąpieniem łuszczycy sugeruje, iż czynniki odpowiedzialne za
patofizjologię tego schorzenia mogą wpływać na regulację produkcji chemeryny
w skórze. Aby to zbadać zastosowano model badawczy ludzkiego naskórka, który
opierał się na hodowlach pierwotnych, ludzkich keratynocytów, tworzących
12
wielowarstwową tkankę, tzw. hodowlach organotypowych lub inaczej hodowlach 3D (Ryc. 1).
Ryc. 1 Schemat organotypowej hodowli pierwotnych, ludzkich keratynocytów (hodowla 3D).
Keratynocyty ściśle porastają dno „koszyka”, który stanowi filtr o porach wielkości 0,4 m. „Koszyk”
umieszczany jest w naczyniu wypełnionym pożywką hodowlaną, która przedostaje się przez pory i odżywia komórki warstwy podstawnej. Górna powierzchnia hodowli ma kontakt z powietrzem co wraz z odpowiednio dobranym składem pożywki hodowlanej umożliwia różnicowanie keratynocytów i tworzenie wielowarstwowego modelu naskórka. Obraz histologiczny takiej hodowli przedstawiony jest w Załączniku 1, Ryc. 4E.
Cytokiny uwalniane przez komórki układu odporności naciekające zmienioną
chorobowo skórę oddziałują w pierwszej kolejności na keratynocyty budujące warstwę
podstawną naskórka, która znajduje się tuż nad skórą właściwą. Aby naśladować
rzeczywisty układ, w którym cytokiny działają na naskórek „od spodu”, badane
czynniki podawane były do medium hodowlanego, w którym następnie zanurzone były
filtry porośnięte przez organotypowe hodowle keratynocytów. Badanymi czynnikami
była IL-17 odgrywająca kluczową rolę w rozwoju stanu zapalnego w zmienionej
łuszczycowo skórze [19, 20] oraz IL-22 odpowiedzialna za nadmierne podziały
keratynocytów, co jest charakterystyczne dla tego schorzenia [21, 22]. Podanie cytokin
skutkowało zahamowaniem ekspresji chemeryny na poziomie transkryptu po 48
godzinach (Załącznik 1, Ryc. 3A i 3C). Ilość chemeryny wydzielonej do medium była
nieznacznie obniżona, jednak uzyskany wynik nie był istotny statystycznie (Załącznik
1, Ryc. 3B i 3D). W przypadku jednoczesnego podania cytokinin obserwowany efekt
nasilał się. Sugeruje to uzupełniające się nawzajem działanie tych cytokin. Te wyniki
uprawdopodabniają tezę, że IL-17 oraz IL-22 mogą być czynnikami bezpośrednio
13
odpowiedzialnymi za zmniejszoną ekspresję chemeryny w zmienionym łuszczycowo naskórku.
Przerwanie integralności skóry może prowadzić do infekcji. Towarzyszące temu powstanie stanu zapalnego ma na celu przeciwdziałać rozwojowi infekcji poprzez napływ komórek układu odporności, aktywować proces gojenia się rany oraz regenerację uszkodzonej tkanki. Komórki w miejscu zapalenia wydzielają tzw. czynniki
„ostrej fazy” mające na celu przywrócenie homeostazy organizmu, zaburzonej w wyniku procesu zapalnego [23]. Jedną z głównych cytokin „ostrej fazy” jest onkostatyna M (OSM), a jej działanie jest często wspomagane przez IL-1 . Co ciekawe, zwiększona ekspresja zarówno OSM jak i IL-1 jest obserwowana w skórze objętej zmianami łuszczycowymi [24, 25, 26]. Zadano sobie pytanie, czy czynniki „ostrej fazy”
będą wpływały na profil ekspresji chemeryny w skórze. Stymulacja keratynocytów za pomocą OSM i IL-1 ujawniła odmienny od IL-17 i IL-22 mechanizm regulacji ekspresji chemeryny w naskórku. OSM samodzielnie oraz w kombinacji z IL-1, silnie stymulowała ekspresję chemeryny w keratynocytach na poziomie mRNA (Załącznik 1, Ryc. 3A i 3C). Na poziomie białka zwiększoną ekspresję chemeryny obserwowano po 24 godzinach od podania OSM, a także OSM z IL- (Załącznik 1, Ryc. 3B). Po upływie 48 godzin różnica pomiędzy próbkami kontrolnymi, a stymulowanymi zmniejszała się (Załącznik 1, Ryc. 3D), choć wykazywała podobną tendencję do tej obserwowanej po 24 godzinnej stymulacji. Celem sprawdzenia czy chemeryna uwalniana do mediów jest wiązana przez receptory obecne na powierzchni keratynocytów zbadano poziom ekspresji CMKLR1, CCLR2 i GPR1, po stymulacji OSM i IL-1 (Załącznik 1. Ryc. 5). 24 godzinna stymulacja IL-1 oraz IL-1 w kombinacji z OSM skutkowała zwiększeniem ekspresji wszystkich receptorów.
W przypadku 48 godzinnej stymulacji tylko IL-1 zwiększała poziom ekspresji CMKLR1 i CCLR2, natomiast poziom GPR1 pozostawał niezmieniony. Przedstawione wyniki pokazują, iż wydzielana przez keratynocyty chemeryna może być wiązana przez receptory obecne na powierzchni komórek i autokrynnie wpływać na ich fizjologię.
Uzyskane wyniki sugerują, że prawdopodobnie istnieją różne ścieżki regulacji ekspresji
chemeryny przez cytokiny zaangażowane w rozwój łuszczycy. IL-17 i IL-22 hamują,
natomiast IL-1 i OSM zwiększają ekspresję chemeryny w keratynocytach, pomimo, iż
rozwojowi łuszczycy towarzyszy zwiększona ekspresja wszystkich tych cytokin [20, 21,
24, 25, 26]. Dodatkowo, istnieją doniesienia, że IL-1 podtrzymuje przewlekły stan
14
zapalny poprzez regulację dojrzewania limfocytów T produkujących IL-17 [27, 28, 29], a OSM hamuje różnicowanie keratynocytów [24], co najprawdopodobniej sprzyja rozwojowi łuszczycy. Z drugiej jednak strony OSM na wczesnych etapach łuszczycy hamuje ekspresję genów zaangażowanych w rozwój stanu zapalnego [26]. Ponadto IL-1 , a w mniejszym stopniu OSM uwrażliwiają naskórek na autokrynne działanie chemeryny poprzez zwiększenie poziomu ekspresji receptorów, co nie było obserwowane w przypadku stymulacji IL-17 i/lub IL-22 (Załącznik 1, Ryc. 5). OSM i IL-1 jako czynniki „ostrej fazy” regulują procesy naprawcze w uszkodzonej tkance, a fakt, że zwiększają również ekspresję chemeryny i jej receptorów sugeruje, iż chemeryna i jej receptory mogą być zaangażowane w poprawę stanu zmienionego łuszczycowo naskórka.
Jedno z głównych zadań naskórka jako zewnętrznej bariery organizmu, polega na ochronie przed patogennymi czynnikami obecnymi w środowisku zewnętrznym, takimi jak bakterie. Są wśród nich Staphylococcus aureus – główny czynnik bakteryjnych infekcji skórnych [30] oraz Escherichia coli – bakteria odpowiedzialna za infekcje wynikające z kontaktu skóry z treścią jelitową [31]. Aby uzyskać odpowiedź na pytanie czy mikroorganizmy mają wpływ na ekspresję chemeryny w naskórku, infekowano pierwotne, ludzkie keratynocyty rosnące w trójwymiarowej hodowli organotypowej (model ludzkiego naskórka) oraz mysią skórę za pomocą S. aureus i E. coli. Ponieważ w rzeczywistości bakterie oddziałują na najbardziej zewnętrzne warstwy naskórka (w odróżnieniu od cytokin głównie pochodzących z komórek naciekających skórę), badane czynniki podawane były „od góry” na keratynocyty mające kontakt z powietrzem. Uzyskane wyniki pokazują, iż bakterie indukują produkcję chemeryny przez keratynocyty (Załącznik 1. Ryc. 4A-4D, 7A-7B). Bakterie szczepu S. aureus silniej niż E. coli zwiększały ekspresję chemeryny, pomimo zastosowania takiego samego inokulum (10
7CFU). Mogło to wynikać z lepszej przeżywalności tych bakterii na skórze lub stanowić specyficzną cechę S. aureus.
Celem sprawdzenia niniejszej hipotezy keratynocyty stymulowano za pomocą bakterii,
których wzrost był ograniczony przez obecność antybiotyku. Stężenie ampicyliny
zostało tak dobrane aby bakterie nie ulegały podziałom komórkowym, ale nadal
pozostawały żywe, a liczba bakterii S. aureus hodowanych z antybiotykiem i liczba
E. coli po 24 godzinach były porównywalne. Zarówno S. aureus jak i S. aureus
traktowane ampicyliną charakteryzowały się podobnym potencjałem stymulacji
15
produkcji chemeryny (Załącznik1, Ryc. 4A-4D). Sugeruje to, iż bakterie S. aureus produkują specyficzne dla swojego szczepu czynniki, które silniej niż czynniki produkowane przez E. coli wpływając na ekspresję chemeryny. Aby zbadać czy keratynocyty reagują zwiększoną produkcją chemeryny w odpowiedzi na obecność żywych bakterii, hodowle keratynocytów stymulowano przy pomocy komórek bakteryjnych, które uprzednio zostały zabite pod wpływem inkubacji w wysokiej temperaturze. W istocie, żywe bakterie mocniej niż zabijane termicznie stymulowały produkcję chemeryny (Załącznik 1, Ryc. 4A-4D) co sugeruje, że czynniki specyficzne dla żywych mikroorganizmów mogą brać udział w tym procesie. Na przestrzeni ostatnich lat pojawiły się teorie dotyczące tzw. vita-PAMPs (ang. viability associated pathogen-associated mlecular patterns), czyli czynników obecnych tylko u żywych baterii np. mRNA [32]. Prawdopodobnym wydaje się, że czynniki te mogą brać udział w regulacji ekspresji chemeryny w naskórku. Dodatkowo hodowle keratynocytów były stymulowane płynami pohodowlanymi uzyskanymi po odwirowaniu komórek z 24 godzinnej hodowli bakteryjnej. Zaobserwowano, że nie tylko zawiesiny bakterii, ale i w niektórych przypadkach również czynniki uwalniane do płynu hodowlanego przez bakterie wykazują tendencję do stymulacji ekspresji chemeryny (Załącznik1, Ryc. 4A- 4D). Podsumowując, uzyskane wyniki sugerują, że patogeny obecne w środowisku mogą, angażując różne mechanizmy stymulować keratynocyty do produkcji chemeryny.
Wykonano również analizę immunohistochemiczną organotypowych hodowli keratynocytów traktowanych za pomocą bakterii (Załącznik 1, Ryc. 4E). Naskórek mający kontakt z żywymi bakteriami produkował więcej chemeryny niż hodowla kontrolna. Najwięcej chemeryny wydzielały keratynocyty tworzące warstwę podstawną, co pozwala przypuszczać, że dzielące się keratynocyty w największym stopniu odpowiadają za poziom chemeryny uwolnionej do medium hodowlanego.
Podczas gdy większość badanych czynników bakteryjnych zwiększała ekspresję
chemeryny w naskórku, taki efekt nie był obserwowany w przypadku receptorów
chemerynowych. 24 godzinna stymulacja hodowli keratynocytów za pomocą bakterii
E. coli oraz w mniejszym stopniu S. aureus skutkowała zmniejszeniem ekspresji
CCLR2 oraz GPR1, natomiast poziom mRNA dla CMKLR1 pozostawał niezmieniony
(Załącznik 1, Ryc. 6A). Co ciekawe, ekspresja CMKLR1 oraz CCLR2 wydawała się
być indukowana pod wpływem dłuższego kontaktu keratynocytów - 48 godzin
z żywymi bakteriami S. aureus (Załącznik 1, Ryc. 6B). Tego efektu nie obserwowano
16
w przypadku zastosowania bakterii E. coli ani czynników uwalnianych przez komórki bakteryjne do płynu hodowlanego. Na podstawie uzyskanych wyników można zaproponować istnienie odrębnych mechanizmów, które aktywowane są w naskórku pod wpływem kontaktu z bakteriami. Bakterie S. aureus stymulują wyłapywanie chemeryny przez receptory i prezentację chemeryny na powierzchni komórek tworząc
„tarczę ochronną”, natomiast bakterie E. coli generują pulę wolnej chemeryny,
działającej jak rozpuszczalny czynnik np. chemotaktyczny lub bakteriobójczy. Analiza
ekspresji receptorów dla chemeryny w mysiej skórze pod wpływem kontaktu
z bakteriami pokazała, że bakterie S. aureus zwiększają ekspresję CMKLR1 oraz GPR1
(Załącznik 1, Ryc. 7C i 7D). Bakterie E. coli natomiast zwiększają ekspresję CCLR2
i GPR1 (Załącznik1, Ryc. 7D i 7E). Współgra to z obserwacjami poczynionymi przy
użyciu modelu ludzkiego naskórka, iż keratynocyty w odmienny sposób regulują
ekspresję chemeryny i jej receptorów w odpowiedzi na E. coli i S. aureus.
17
5. Potranslacyjne modyfikacje chemeryny w ludzkim naskórku
Ludzka chemeryna syntetyzowana jest jako prekursor zbudowany ze 163 aminokwasów, a po usunięciu 20 aminokwasowego peptydu sygnałowego, wydzielana jest poza komórkę jako chemeryna 163S (gdzie 163S oznacza terminalną serynę w pozycji 163). Ta obecna w surowicy forma jest nieaktywna biologicznie [33]. Do uzyskania pełnej aktywności niezbędna jest modyfikacja proteolityczna jej końca karboksylowego. Enzymami zaangażowanymi w aktywację chemeryny są białka z rodziny proteaz serynowych biorących udział w reakcjach zapalnych [33, 7] oraz proteaz cysteinowych pochodzących zarówno z własnych komórek [34, 35] jak i niektórych drobnoustrojów [36]. Ilość aminokwasów usuniętych z końca karboksylowego chemeryny bezpośrednio wpływa na jej aktywność chemotaktyczną.
Do najbardziej aktywnych chemotaktycznie form chemeryny należy forma Chem157S, która kończy się na serynie w pozycji 157 i jest krótsza od formy 163S o sześć aminokwasów na końcu C [10].
Ryc. 2 Sekwencja chemeryny. Kolorem żółtym podkreślono peptyd sygnałowy, kolorem czerwonym i niebieskim zaznaczony jest region, który podlega proteolizie w różnych miejscach chemeryny obecnej w płynach zapalnych. Kolorem zielonym zaznaczone są reszty lizyny i glutaminy. Liczbami oznaczono koniec-C form chemeryny, odpowiednio Chem149Y, Chem154F, Chem157S i Chem163S.
Forma w jakiej chemeryna występuje w ludzkim naskórku pozostaje nieznana.
Ponieważ ilość aminokwasów usuniętych z karboksylowego końca chemeryny może
rzutować na jej aktywność biologiczną, istotnym wydawało się zidentyfikowanie formy
w jakiej chemeryna występuje w naskórku. Próbując odpowiedzieć na to pytanie
wykonano analizę Western Blot naskórków pobranych od piętnastu różniących się
wiekiem pacjentów obojga płci. Biorąc pod uwagę, iż forma chemeryny może zależeć
od miejsca pobrania, badano wycinki skórne pochodzące z różnych rejonów ciała.
18
Ponieważ nie zaobserwowano znaczących różnic pomiędzy dawcami materiału ani miejscami pobrania wycinków skóry, wyniki przedstawiono dla trzech reprezentatywnych próbek (Ryc. 3A). Analiza Western Blot prowadzona w warunkach redukujących, chemeryny obecnej w ludzkim naskórku ujawniła dominujący produkt o masie cząsteczkowej (>70 kDa) przekraczającej znacznie masę cząsteczkową rekombinowanego białka Chem157S (~18 kDa). Zaobserwowano również szereg innych produktów, wszystkie o masie przekraczającej masę cząsteczkową rekombinowanej chemeryny. Aby precyzyjniej określić formę w jakiej produkowana jest chemeryna przez keratynocyty, przeprowadzono również analizę Western Blot mediów pochodzących z hodowli organotypowych pierwotnych, ludzkich keratynocytów (Ryc. 3B). Tak jak w przypadku lizatów naskórka, białko uwalniane do medium przez keratynocyty i najsilniej wykrywane przez przeciwciała przeciwko ludzkiej chemerynie miało masę >70 kDa.
Ryc. 3 Chemeryna produkowana przez keratynocyty występuje w wysokocząsteczkowej formie.
Analiza Western Blot: A – chemeryny obecnej w ludzkim naskórku (M37 skroń – skóra pobrana ze skroni 37 letniego mężczyzny, K61 udo – skóra pobrana z uda 61 letniej kobiety, K33 ramię – skóra pobrana z ramienia 33 letniej kobiety), wyniki reprezentatywne dla 15 dawców i 3 powtórzeń, B - chemeryny uwolnionej do medium przez keratynocyty wyizolowane z ucha 15 letniego mężczyzny (medium), wyniki reprezentatywne dla 5 powtórzeń. Jako kontrolę wykorzystano rekombinowaną chemerynę, której sekwencja kończy się na serynie w pozycji 157- 157S (chemeryna). Do detekcji użyto biotynylowanych kozich przeciwciał przeciw ludzkiej chemerynie oraz streptawidyny sprzęgniętej z peroksydazą chrzanową.
19
Uzyskany wynik sugeruje, iż chemeryna produkowana przez keratynocyty łączy się poprzez wiązanie kowalencyjne z innymi białkami, tworząc białkowe kompleksy o dużej masie cząsteczkowej. Odpowiedź na pytanie jaki rodzaj modyfikacji może leżeć u podstaw tworzenia wielkocząsteczkowych produktów chemerynowych pochodzi z wnętrza sekwencji chemeryny (Ryc. 2), w której skład wchodzą liczne reszty lizyny i glutaminy (zaznaczone kolorem zielonym) oraz ko-lokalizacja w naskórku chemeryny i enzymów mających zdolność do tworzenia wiązań pomiędzy resztami lizyny i glutaminy tzw. transglutaminaz [37].
Transglutaminazy (TG), enzymy licznie występujące w tkankach, odpowiedzialne są za potranslacyjne modyfikacje białek - katalizują tworzenie się wiązań peptydowych pomiędzy lizyną, a glutaminą. TG tworzą pewnego rodzaju tarczę ochronną w warstwie rogowej naskórka poprzez wiązanie białek podatnych na proteolizę z inhibitorami proteaz bądź proteoglikanami lub sfingolipidami macierzy zewnątrzkomórkowej. Produkty reakcji transglutaminacji, nierozpuszczalne białka o duże masie cząsteczkowej, charakteryzują się znaczną odpornością na mechaniczne uszkodzenia jak i proteolityczną degradację [38]. Do tej pory zidentyfikowano 8 białek należących do rodziny transglutaminaz [39]. Enzymami ulegającymi ekspresji w skórze są TG1 i 3 (obecne we wszystkich warstwach naskórka) [37], oraz TG5 produkowana głównie przez keratynocyty warstwy ziarnistej [40].
Enzymy proteolityczne obecne w naskórku mają zdolność kształtowania lokalnego środowiska zarówno poprzez degradację białek macierzy zewnątrzkomórkowej jak i regulację procesów zapalnych aktywując prekursory cytokin i chemokin [41]. W stanach chorobowych skóry takich jak łuszczyca czy atopowe zapalenie skóry obserwowana jest zwiększona ilość enzymów proteolitycznych w naskórku [37, 41, 42]. Nadmierna lub nieprawidłowa proteoliza białek może prowadzić to rozwoju stanu zapalnego, którego efektem będą zmiany chorobowe w obrębie tkanki objętej procesem zapalnym. Proces transglutaminacji wydaje się być mechanizmem zaradczym, przeciwdziałającym wzmożonej proteolizie białek [38].
Zwiększona masa cząsteczkowa chemeryny wydzielanej przez keratynocyty, obecność
licznych reszt lizyny i glutaminy w jej sekwencji, ko-lokalizacja chemeryny
i transglutaminaz oraz zbieżność w strukturze chemeryny i cystatyn [14, 43], jednego ze
znanych substratów dla transglutaminaz [44] sugerują, iż chemeryna może być
potencjalnym substratem dla tych enzymów. Celem potwierdzenia tej tezy,
20
rekombinowaną chemerynę inkubowano w obecności medium z hodowli ludzkich keratynocytów, transglutaminaz oraz inhibitorów transglutaminaz. Ponieważ TG1 i TG3, tak jak chemeryna, obecne są we wszystkich warstwach naskórka, i ze względu na wspólną ko-lokalizację z dużym prawdopodobieństwem mogą być zaangażowane w modyfikacje chemeryny w naskórku, w badaniach wykorzystano TG1 i TG3. Wyniki analizy Western Blot produktów transglutaminacji chemeryny zostały przedstawione na Ryc. 4A oraz 4B.
Ryc. 4 Chemeryna jest substratem dla transglutaminaz naskórkowych. Analiza Western Blot produktów reakcji transglutaminacji chemeryny. Badany materiał: A – rekombinowana chemeryna inkubowana z medium z organotypowej hodowli ludzkich keratynocytów w obecności transglutaminaz 1 lub 3 oraz inhibitorów transglutaminaz, B – rekombinowana chemeryna inkubowana w obecności transglutaminaz 1 i 3 oraz inhibitorów. Do detekcji chemeryny użyto biotynylowanych kozich przeciwciał przeciw ludzkiej chemerynie oraz streptawidyny sprzęgniętej z peroksydazą chrzanową.
Wyniki reprezentatywne dla pięciu powtórzeń.
Inkubacja rekombinowanej chemeryny w obecności medium z hodowli keratynocytów skutkowała pojawieniem się dominującego produktu o masie >70 kDa oraz dwóch dodatkowych produktów o masie ~40 kDa i ~55 kDa (Ryc. 4A). Uzyskane wyniki wskazują, iż w medium mogą być obecne transglutaminazy mające zdolność tworzenia wiązań pomiędzy chemeryną, a innymi białkami wydzielanymi do medium.
Dodanie rekombinowanych transglutaminaz powodowało, że przeciwciała skierowane
przeciwko ludzkiej chemerynie silniej wykrywały produkty o masie ~40 kDa i ~55 kDa
oraz wykrywały produkty o masie >100 kDa. Tworzenie się produktów o zwiększonej
21
masie cząsteczkowej hamowane było poprzez dodanie inhibitorów. Obecność produktów o masie ~40 kDa i ~55 kDa, co w przybliżeniu odpowiada kolejno masie dwóch i trzech cząsteczek chemeryny, sugeruje, iż chemeryna potencjalnie może tworzyć produkty transglutaminacji sama ze sobą. Istotnie, wykrywane produkty inkubacji rekombinowanej chemeryny w obecności obu transglutaminaz również miały masę ~40 kDa, ~55 kDa i ~70 kDa (Ryc. 4B). Odpowiada to masie dwóch, trzech i czterech cząsteczek chemeryny. Produkty przekraczające swoją masą 100kDa mogły być efektem powstania wielocząsteczkowych konglomeratów chemeryny lub chemeryny związanej z enzymem (co stanowi produkt pośredni w procesie transglutaminacji). Uzyskane wyniki pokazują, że chemeryna poprzez wiązania kowalencyjne ma zdolność łączenia się sama ze sobą oraz z innymi białkami wydzielanymi przez keratynocyty, a enzymami katalizującymi powstawanie tych połączeń są transglutaminazy naskórkowe. Znaczeniem fizjologicznym obserwowanego procesu może być konieczność ochrony chemeryny przed wzmożoną proteolizą i generowaniem chemotaktycznie aktywnych from. To z kolei może przeciwdziałać nadmiernemu napływowi komórek układu odporności i hamowaniu powstawania stanu zapalnego. Tworzenie agregatów chemerynowych może również wpływać na lokalne zagęszczenie chemeryny, co będzie wspomagało inne niż napływ komórek immunologicznych, funkcje chemeryny w naskórku.
W niniejszej pracy po raz pierwszy podjęto próbę określenia formy w jakiej chemeryna występuje w naskórku. Pokazano, iż chemeryna ma zdolność wiązania się zarówno z innymi białkami macierzy zewnątrzkomórkowej naskórka jak i tworzenia chemerynowych „super-cząsteczek” oraz zidentyfikowano enzymy potencjalnie zaangażowanie w te procesy. Jednakże, uzyskane wyniki są punktem wyjścia do dalszych badań nad modyfikacjami chemeryny w naskórku, gdyż niezbędnym jest określenie składu „super-cząsteczek” chemerynowych przy wykorzystaniu np.
spektroskopii masowej.
22
6. Funkcja chemeryny w naskórku
Chemeryna jest wielofunkcyjnym białkiem zaangażowanym w kierowanie napływu komórek układu odporności do miejsca zapalenia, regulację różnicowania i metabolizmu komórek tłuszczowych [10, 45, 46], ponadto bierze udział w procesach takich jak angiogeneza [47], osteoblastogeneza [48] oraz rozwój komórek mięśniowych [49]. Od wielu lat wiadomo, że chemeryna obecna jest w naskórku [1], jednak funkcja chemeryny w tej tkance pozostawała niewyjaśniona.
Ryc. 5 Izoformy chemeryny i peptydy chemerynowe badane pod kątem własności przeciwbakteryjnych. W sekwencji chemeryny zaznaczono pozycje syntetycznych peptydów (p1 - p14) użytych do zbadania własności antybakteryjnych. Kolorem czerwonym oznaczony został peptyd 4, głównie odpowiedzialny za przeciwbakteryjne własności chemeryny. Liczby nad aminokwasami oznaczają koniec C testowanych izoform chemeryny, odpowiednio Chem125R, Chem157S i Chem163S.
Podobieństwo strukturalne chemeryny i przeciwbakteryjnych katelicytydyn [10, 50] oraz fakt, że chemeryna obecna jest w naturalnych barierach ciała, nie tylko w naskórku ale również w nabłonkach wyściełających płuca oraz jelita [10, 18]
wskazuje, iż chemeryna może pełnić ochronną, niezależną od chemotaksji rolę w tych
tkankach. Analiza form chemeryny o rożnym potencjale chemotaktycznym ujawniła, że
wszystkie te formy mają zdolność hamowania wzrostu bakterii tj. E. coli oraz
K. pneumoniae (Załącznik 2, Fig. 5A). Najniższy potencjał przeciwbakteryjny
wykazywała pro-forma Chem163S. Usunięcie sześciu aminokwasów z końca
karboksylowego, co generuje formę Chem157S o największej aktywności
chemotaktycznej skutkowało również zwiększeniem aktywności bakteriobójczej.
23
Wyniki te sugerują, że tak jak w przypadku funkcji chemotaktycznej, usunięcie hamującego, C-końcowego fragmentu tego białka, jest konieczne do ujawnienia pełnej funkcji antybakteryjnej chemeryny. Co ciekawe, zarówno chemotaktycznie aktywna Chem157S, jak i chemotaktycznie nieaktywna forma Chem125R – forma kończąca się na argininie w pozycji 125, krótsza od form 157S o 22 aminokwasy (Ryc. 5), w równym stopniu hamowały wzrost bakterii (Załącznik 2, Fig. 5D). Sugeruje to, że za funkcje chemotaktyczną i bakteriobójczą chemeryny odpowiedzialne są różne fragmenty tego białka. Testy przeciwbakteryjne z wykorzystaniem zsyntetyzowanych chemicznie 20-aminokwasowych peptydów pokrywających całą sekwencję chemeryny (Ryc. 5) pozwoliły zidentyfikować peptyd 4 (p4) reprezentujący sekwencję Val
66-Pro
85, jako region głównie odpowiedzialny za zabijanie komórek E. coli przez chemerynę (Załącznik 3, Fig. 3). W kolejnym etapie zbadano czy aktywność przeciwbakteryjna peptydu 4 jest specyficzna dla określonych szczepów mikroorganizmów. Prace innych członków zespołu ujawniły, że peptyd 4 charakteryzuje się szerokim spektrum działania (Załącznik 3, Fig. 4 oraz Tab. 3). Dodatkowo wykonano testy przeciwbakteryjne z użyciem bakterii szczepów kolonizujących skórę [51] tj. Pseudomonas, Staphylococcus, Dermabacter, Streptococcus, Corynebacterium i Deinococcus (Ryc. 6).
Wszystkie badane szczepy charakteryzowały się wrażliwością na peptyd 4.
Rozlokowanie chemeryny we wszystkich warstwach naskórka (Załącznik 1, Fig. 4E)
oraz szerokie spektrum działania peptydu 4 (Ryc. 6, Załączniki 3, Fig. 4,) sugerują, że
chemeryna może pełnić ochronę funkcję w naskórku zapobiegając infekcjom
bakteryjnym. Badania nad peptydem 4 ujawniły również, iż najwyższą aktywność
bakteriobójczą wykazuje on w pH zbliżonym do neutralnego oraz w środowisku
o niskiej zawartości soli (Załącznik 2, Fig. 5). pH zdrowej, ludzkiej skóry waha się od 5
w wyższej warstwie rogowej do 7 w niższej warstwie granularnej [52], natomiast
stężenie soli wynosi około 40mM [53] i zależy od ilości wody traconej w wyniku
pocenia się. Oznacza to więc, że peptyd pochodzenia chemerynowego będzie w pełni
aktywny w środowisku zdrowego naskórka. Ze względu na efektywność
i wszechstronność peptydu chemerynowego p4, zaproponowano użycie tego peptydu do
wytwarzania leku o właściwościach ochronnych względem komórek nabłonkowych,
w tym w szczególności do stosowania przeciw zakażeniom bakteryjnym i grzybiczym,
oraz do leczenia chorób związanych ze stanem zapalnym skóry, płuc czy przewodu
pokarmowego. Peptydy chemerynowe, kompozycja farmaceutyczna zawierająca te
peptydy oraz ich zastosowanie stały się przedmiotem zgłoszeń patentowych do
24
Polskiego oraz Europejskiego Biura Patentowego (zgłoszenie numer P.402070 oraz PCT/IB2013/061001).
S tr e fa z a h a m o wa n ia wz ro s tu [ m m ]
P. aeruginosa S. capitis
D. homi nis
S. agalactiae C. simu
lans D. indicus 0
5 10 15
p4 Lizozym
Ryc. 6 Chemerynowy peptyd 4 jest czynnikiem przeciwbakteryjnym o szerokim spektrum działania. Przedstawione na wykresie szczepy bakterii (P. aeruginsa – szczep kliniczny, S. capitis ATCC27840, D. hominis ATCC49369, S. agalactiae ATCC13813, C. simulans DSM44392, D. indicus DSM15307) wykorzystano w teście RDA badającym potencjał przeciwbakteryjny peptydu 4 (100 M) oraz lizozymu (75 M). Badane czynniki przez 3 godziny ulegały dyfuzji w żelu agarozowym z zawiesiną bakterii. Po upływie 24 godzin mierzono średnice stref zahamowania wzrostu bakterii, a wyniki podawano pomniejszone o średnicę otworów do których nakładane były czynniki. Przestawione dane są średnią ± odchylenie standardowe z 4 niezależnych eksperymentów.
W opisanych powyżej badaniach wykazano przeciwbakteryjną funkcję
rekombinowanej chemeryny oraz peptydu chemerynowego p4. Kolejnym etapem było
określenie czy tak jak forma rekombinowana, chemeryna wydzielana przez ludzkie
keratynocyty posiada własności bakteriobójcze. Dodanie medium z hodowli
keratynocytów do hodowli bakterii E. coli znacząco hamowało wzrost bakterii. Aby
zbadać jaką rolę pełni w tym procesie chemeryna zastosowano medium, z którego
usunięto chemerynę poprzez immunoprecypitację (wykorzystano do tego celu królicze
przeciwciało przeciwko ludzkiej chemerynie sprzężone z sefarozą). Kontrolę stanowiło
medium z hodowli keratynocytów traktowane przeciwciałami pochodzącymi
z nieimmunizowanego królika. Użycie medium bez chemeryny w mniejszym stopniu
hamowało wzrost bakterii niż medium kontrolne. Dodanie rekombinowanego białka do
mediów pozbawionych chemeryny przywracało pierwotny efekt bakteriobójczy
(Załącznik 2, Fig. 1C). Uzyskane wyniki pokazują, że ludzkie keratynocyty wydzielają
25
czynniki bakteriobójcze, a chemeryna jest jednym z nich i w znaczący sposób odpowiada za hamowanie wzrostu bakterii w naskórku. Potwierdzeniem tej hipotezy były porównawcze eksperymenty przeprowadzone na myszach z wyciszonym genem kodującym chemerynę oraz zwierzętach typu dzikiego (Załącznik 1, Ryc. 8).
W badaniach wykorzystano bakterie szczepu S. aureus ponieważ są bakteriami
zasiedlającymi skórę oraz odpowiedzialne są za liczne infekcje skóry, przy czym są
wrażliwe na działanie peptydu 4 (dane nieprezentowane). Na skórę myszy nanoszono
zawiesinę bakterii szczepu S. aureus. Po 24 godzinach zawiesina bakterii była
pobierana i wyznaczano CFU/ml oraz określano procent przeżycia komórek
bakteryjnych, względem wyjściowego inokulum. W przypadku zwierząt dzikich
obserwowano prawie całkowite zahamowanie wzrostu bakterii na skórze, natomiast
u zwierząt z deficytem chemeryny nie obserwowano tego efektu. Uzyskane wyniki
jednoznacznie potwierdzają, że chemeryna obecna w naskórku pełni funkcję ochronną
hamując wzrost bakterii.
26
7. Bibliografia
1. Nagpal S, Patel S, Jacobe H, DiSepio D, Ghosn C, et al. (1997) Tazarotene-induced gene 2 (TIG2), a novel retinoid-responsive gene in skin. J Invest Dermatol 109: 91-95.
2. Davenport AP, Alexander SP, Sharman JL, Pawson AJ, Benson HE, et al. (2013) International Union of Basic and Clinical Pharmacology. LXXXVIII. G protein-coupled receptor list: recommendations for new pairings with cognate ligands. Pharmacol Rev 65:
967-986.
3. Wittamer V, Franssen JD, Vulcano M, Mirjolet JF, Le Poul E, et al. (2003) Specific Recruitment of Antigen-presenting Cells by Chemerin, a Novel Processed Ligand from Human Inflammatory Fluids. J Exp Med 198: 977-985.
4. Zabel BA, Silverio AM, Butcher EC (2005) Chemokine-like receptor 1 expression and chemerin-directed chemotaxis distinguish plasmacytoid from myeloid dendritic cells in human blood. J Immunol 174: 244-251.
5. Parolini S, Santoro A, Marcenaro E, Luini W, Massardi L, et al. (2007) The role of chemerin in the colocalization of NK and dendritic cell subsets into inflamed tissues. Blood 109: 3625-3632.
6. Skrzeczynska-Moncznik J, Stefanska A, Zabel BA, Kapinska-Mrowiecka M, Butcher EC, et al. (2009) Chemerin and the recruitment of NK cells to diseased skin. Acta Biochim Pol 56: 355-360.
7. Zabel BA, Ohyama T, Zuniga L, Kim JY, Johnston B, et al. (2006) Chemokine-like receptor 1 expression by macrophages in vivo: regulation by TGF-beta and TLR ligands.
Exp Hematol 34: 1106-1114.
8. Barnea G, Strapps W, Herrada G, Berman Y, Ong J, et al. (2008) The genetic design of signaling cascades to record receptor activation. Proc Natl Acad Sci U S A 105: 64-69.
9. Zabel BA, Nakae S, Zuniga L, Kim JY, Ohyama T, et al. (2008) Mast cell-expressed orphan receptor CCRL2 binds chemerin and is required for optimal induction of IgE-mediated passive cutaneous anaphylaxis. J Exp Med 205: 2207-2220.
10. Zabel BA, Kwitniewski M, Banas M, Zabieglo K, Murzyn K, et al. (2014) Chemerin regulation and role in host defense. Am J Clin Exp Immunol 3: 1-19.
11. Rourke JL, Muruganandan S, Dranse HJ, McMullen NM, Sinal CJ (2014) Gpr1 is an active chemerin receptor influencing glucose homeostasis in obese mice. J Endocrinol.
222(2):201-15.
12. Gonzalvo-Feo S, Del Prete A, Pruenster M, Salvi V, Wang L, et al. (2014) Endothelial cell-
derived chemerin promotes dendritic cell transmigration. J Immunol 192: 2366-2373.
27
13. Monnier J, Lewen S, O'Hara E, Huang K, Tu H, et al. (2012) Expression, regulation, and function of atypical chemerin receptor CCRL2 on endothelial cells. J Immunol 189: 956- 967.
14. Zabel BA, Zuniga L, Ohyama T, Allen SJ, Cichy J, et al. (2006) Chemoattractants, extracellular proteases, and the integrated host defense response. Exp Hematol 34: 1021- 1032.
15. Skrzeczyńska-Moncznik J, Wawro K, Stefańska A, Oleszycka E, Kulig P, Zabel BA, Sułkowski M, Kapińska-Mrowiecka M, Czubak-Macugowska M, Butcher EC, Cichy J.
(2009) Potential role of chemerin in recruitment of plasmacytoid dendritic cells to diseased skin. Biochem Biophys Res Commun 6;380(2):323-7.
16. Albanesi C, Scarponi C, Pallotta S, Daniele R, Bosisio D, et al. (2009) Chemerin expression marks early psoriatic skin lesions and correlates with plasmacytoid dendritic cell recruitment. J Exp Med 206: 249-258.
17. Banas M, Zabieglo K, Kasetty G, Kapinska-Mrowiecka M, Borowczyk J, et al. (2013) Chemerin is an antimicrobial agent in human epidermis. PLoS ONE 8(3): e58709 .
18. Luangsay S, Wittamer V, Bondue B, De Henau O, Rouger L, et al. (2009) Mouse ChemR23 is expressed in dendritic cell subsets and macrophages, and mediates an anti-inflammatory activity of chemerin in a lung disease model. J Immunol 183: 6489-6499.
19. Lowes MA, Russell CB, Martin DA, Towne JE, Krueger JG (2013) The IL-23/T17 pathogenic axis in psoriasis is amplified by keratinocyte responses. Trends Immunol 34:
174-181.
20. Flutter B, Nestle FO (2013) TLRs to cytokines: mechanistic insights from the imiquimod mouse model of psoriasis. Eur J Immunol 43: 3138-3146.
21. Van Belle AB, de Heusch M, Lemaire MM, Hendrickx E, Warnier G, et al. (2012) IL-22 is required for imiquimod-induced psoriasiform skin inflammation in mice. J Immunol 188:
462-469.
22. Boniface K, Bernard FX, Garcia M, Gurney AL, Lecron JC, et al. (2005) IL-22 inhibits epidermal differentiation and induces proinflammatory gene expression and migration of human keratinocytes. J Immunol 174: 3695-3702.
23. Rokita H1, Bereta J, Koj A, Gordon AH, Gauldie J.(1990) Epidermal growth factor and transforming growth factor-beta differently modulate the acute phase response elicited by interleukin-6 in cultured liver cells from man, rat and mouse. Comp Biochem Physiol A Comp Physiol. 95(1):41-5.
24. Boniface K, Diveu C, Morel F, Pedretti N, Froger J, et al. (2007) Oncostatin M secreted by
skin infiltrating T lymphocytes is a potent keratinocyte activator involved in skin
inflammation. J Immunol 178: 4615-4622.
28
25. Gazel A, Rosdy M, Bertino B, Tornier C, Sahuc F, et al. (2006) A characteristic subset of psoriasis-associated genes is induced by oncostatin-M in reconstituted epidermis. J Invest Dermatol 126: 2647-2657.
26. Kupper TS, Lee F, Birchall N, Clark S, Dower S (1988) Interleukin 1 binds to specific receptors on human keratinocytes and induces granulocyte macrophage colony-stimulating factor mRNA and protein. A potential autocrine role for interleukin 1 in epidermis. J Clin Invest 82: 1787-1792.
27. Ghoreschi K, Laurence A, Yang XP, Tato CM, McGeachy MJ, et al. (2010) Generation of pathogenic T(H)17 cells in the absence of TGF-beta signalling. Nature 467: 967-971.
28. Sutton CE, Lalor SJ, Sweeney CM, Brereton CF, Lavelle EC, et al. (2009) Interleukin-1 and IL-23 induce innate IL-17 production from gammadelta T cells, amplifying Th17 responses and autoimmunity. Immunity 31: 331-341.
29. Uribe-Herranz M, Lian LH, Hooper KM, Milora KA, Jensen LE (2013) IL-1R1 signaling facilitates Munro's microabscess formation in psoriasiform imiquimod-induced skin inflammation. J Invest Dermatol 133: 1541-1549.
30. Lowy F.D. (1998) Staphylococcus aureus infections. N. Engl. J. Med. 339:520–532.
31. Gläser R, Harder J, Lange H, et al. (2005) Antimicrobial psoriasin (S100A7) protects human skin from escherichia coli infection. Nat Immunol.; 6:57–64.
32. Sander LE, Davis MJ, Beokschoten MV, Amsen D, Dascher CC, et al. (2011) Detection of prokaryotic mRNA signifies microbial viability and promotes immunity. Nature 474: 385- 389.
33. Zabel BA, Allen SJ, Kulig P, Allen JA, Cichy J, et al. (2005) Chemerin activation by serine proteases of the coagulation, fibrinolytic, and inflammatory cascades J Biol Chem 280:
34661–34666.
34. Kulig P, Kantyka T, Zabel BA, Banas M, Chyra A, et al. (2011) Regulation of chemerin chemoattractant and antibacterial activity by human cysteine cathepsins. J Immunol 187:
1403–1410.
35. Cash J L, Hart R, Russ A, Dixon J P, Doran J, et al. (2008) "Synthetic chemerin-derived peptides suppress inflammation through ChemR23. J Exp Med 767-775.
36. Kulig P, Zabel BA, Dubin G, Allen SJ, Ohyama T, et al. (2007) Staphylococcus aureus- derived staphopain B, a potent cysteine protease activator of plasma chemerin. J Immunol 178: 3713–3720.
37. Fisher J, Koblyakova Y, Latendorf T, Wu Z, Meyer-Hoffer U (2012) Cross-linking of
SPINK6 by transglutaminases protects epidermal proteases. JID 2012.482.
29
38. Griffin M, Casadio R, Bergamini CR. (2002) Transglutaminases: Nature's biological glues.
Biochem. J. 368(377–396).
39. Grenard, P., Bates, M.K. and Aeschlimann, D. (2001) Evolution of transglutaminase genes:
identification of a transglutaminase gene cluster on human chromosome 15q15. Structure of the gene encoding transglutaminase x and a novel gene family member, transglutaminase z.
J. Biol. Chem. 276, 33066–33078.
40. Cassidy AJ, van Steensel MA, Steijlen PM, et al. (December 2005). "A homozygous missense mutation in TGM5 abolishes epidermal transglutaminase 5 activity and causes acral peeling skin syndrome". Am. J. Hum. Genet. 77 (6): 909–17.
41. Meyer-Hoffer U. (2009) Reddish, scaly, and itchy: how proteases and their inhibitors contribte to inflammatory skin diseases. Arch Immunol Ther Exp 57:345-54.
42. Yamasaki K, Di Nardo A, Bardan A et al. (2010) Increased serine protease activity and cathelicidin promotes skin inflammation in rosacea. Nat Med 13:975-80.
43. Sodung J. (2005) Protein homology detection by HMM-HMM comparison.
Bioinformatiocs; 21 :951-960.
44. Zeeuwen PL, Van Vlijmen-Willems IM, Jansen BJ, Sotiropoulou G, et al. (2001) Cystatin M/E expression is restricted to differentiated epidermal keratinocytes and sweat glands: a new skin-specific proteinase inhibitor that is a target for cross-linking by transglutaminase.
J Invest Dermatol.116(5):693-701.
45. Bnude B, Wittmer V, Parmentier M (2011) Chemerin and its receptors in leukocyte trafficking, inflammation and metabolism. Cytokine Growth Facotr Rev 22: 331-338.
46. Takahashi M, Okimura Y, Iguchi G, Nishizawa H, Yamamoo M, et al (2011) Chemerin regulates beta-cell function in mice. Sci Rep 1: 123.
47. Kaur J, Adya R, Tan BK, Chen J and Randeva HS. (2010) Identification of chemerin receptor (ChemR23) in human endothelial cells: chemerin-induced endothelial angiogenesis. Biochem Biopys Res Commun 391: 1762-1768.
48. Muruganandan S, Parlee SD, Rouke JL, Ernst MC, Gorlski KB and Sinal CJ. (2011) Chemerina, a novel peroxisome proliferator-activated receptor gamma (PPARgamma) target gene that promotes mesenchymal stem cell adipogenesis. J Biol Chem 286: 23982- 23995.
49. Issa ME, Muruganandan S, Ernst MC, Parlee SD, Zabel BA, Butcher EC, Sinal CJ and Goralski KB. (2012) Chemokine-like receptor 1 regulates skeletal muscle cell miogenesis.
AM J Physiol Cell Physiol 302: C1621-1631.
50. Allen SJ, Zabel BA, Krikpatrick J, Butcher EC, Nietlispach D, et al. (2007) NMR
assignment of human chemerin, a nowel chemoatraktant. Biomol NMR Assign 1: 171-173.
30
51. Gao Z1, Tseng CH, Strober BE, Pei Z, Blaser MJ. (2008) Substantial alterations of the cutaneous bacterial biota in psoriatic lesions. PLoS One. 2008 Jul 23;3(7):e2719.
52. Ohman H, Vahlquist A (1994) In vivo studies concerning a pH gradient in human stratum corneum and upper epidermis. Acta Derm Venereol 74: 375–379.
53. Schittek B, Hipfel R, Sauer B, Bauer J, Kalbacher H, et al. (2001) Dermcidin: a novel
human antibiotic peptide secreted by sweat glands. Nat Immunol 2: 1133-1137.
31
8. Załączniki:
1. Banas M, Zegar A, Kwitniewski M, Zabieglo K, Marczynska J, Kapinska- Mrowiecka M, LaJevic M, Zabel BA, Cichy J. (2015) The expression and regulation of chemerin in the epidermis. Plos ONE 10(2): e0117830.
2. Kulig P, Kantyka T, Zabel BA, Banas M, Chyra A, Stefanska A, Tu H, Allen SJ, Handel TM, Kozik A, Potempa J, Butcher EC, Cichy J. (2011) Regulation of chemerin chemoattractant and antibacterial activity by human cysteine cathepsins. J Immunol 187: 1403-1410.
3. Banas M, Zabieglo K, Kasetty G, Kapinska-Mrowiecka M, Borowczyk J,
Drukala J, Murzyn K, Zabel BA, Butcher EC, Schroeder JM, Schmidtchen A,
Cichy J. (2013) Chemerin is an antimicrobial agent in human epidermis. Plos
ONE 8(3): e58709.
RESEARCH ARTICLE
The Expression and Regulation of Chemerin in the Epidermis
Magdalena Banas1, Aneta Zegar1, Mateusz Kwitniewski1, Katarzyna Zabieglo1,
Joanna Marczynska1, Monika Kapinska-Mrowiecka2, Melissa LaJevic3,4, Brian A. Zabel4, Joanna Cichy1*
1 Department of Immunology, Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology, Jagiellonian University, Kraków, Poland, 2 Department of Dermatology, Zeromski Hospital, Kraków, Poland, 3 Stanford University School of Medicine, Department of Pathology, Stanford, California, United States of America, 4 Palo Alto Veterans Institute for Research, VA Palo Alto Health Care System, Palo Alto, California, United States of America
*Joanna.Cichy@uj.edu.pl
Abstract
Chemerin is a protein ligand for the G protein-coupled receptor CMKLR1 and also binds to two atypical heptahelical receptors, CCRL2 and GPR1. Chemerin is a leukocyte attractant, adipokine, and antimicrobial protein. Although chemerin was initially identified as a highly expressed gene in healthy skin keratinocytes that was downregulated during psoriasis, the regulation of chemerin and its receptors in the skin by specific cytokines and microbial fac- tors remains unexplored. Here we show that chemerin, CMKLR1, CCRL2 and GPR1 are expressed in human and mouse epidermis, suggesting that this tissue may be both a source and target for chemerin mediated effects. In human skin cultures, chemerin is signifi- cantly downregulated by IL-17 and IL-22, key cytokines implicated in psoriasis, whereas it is upregulated by acute phase cytokines oncostatin M and IL-1β. Moreover, we show that human keratinocytesin vitroand mouse skin in vivorespond to specific microbial signals to regulate expression levels of chemerin and its receptors. Furthermore, in a cutaneous infec- tion model, chemerin is required for maximal bactericidal effectsin vivo. Together, our find- ings reveal previously uncharacterized regulators of chemerin expression in skin and identify a physiologic role for chemerin in skin barrier defense against microbial pathogens.
Introduction
Chemerin, also known as tazarotene induced gene 2 (Tig2) or retinoic acid receptor responder protein 2 (RARRES2), is a broadly expressed leukocyte attractant ligand for serpentine, G pro- tein-associated receptor CMKLR1 (chemokine-like receptor 1) [1,2,3]. CMKLR1+ plasmacy- toid dendritic cells (pDCs), macrophages and NK cells are critical in bridging the innate and adaptive immune responses [3,4,5,6]. Chemerin is secreted as an inactive precursor protein (Chem163S, with number and capital letter referring to the terminal amino acid position and single amino acid code, respectively). Chem163S can be converted to chemotactically active
PLOS ONE | DOI:10.1371/journal.pone.0117830 February 6, 2015 1 / 19
OPEN ACCESS
Citation: Banas M, Zegar A, Kwitniewski M, Zabieglo K, Marczynska J, Kapinska-Mrowiecka M, et al.
(2015) The Expression and Regulation of Chemerin in the Epidermis. PLoS ONE 10(2): e0117830.
doi:10.1371/journal.pone.0117830
Academic Editor: Bernhard Ryffel, French National Centre for Scientific Research, FRANCE Received: October 1, 2014
Accepted: December 31, 2014 Published: February 6, 2015
Copyright: © 2015 Banas et al. This is an open access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution License, which permits unrestricted use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original author and source are credited.
Data Availability Statement: All relevant data are within the paper.
Funding: This work was supported in part by grants from Polish National Science Center 0724/B/P01/
2011/40, UMO-2014/12/W/NZ6/00454 and the Foundation for Polish Science TEAM/2010-5/1, co- financed by the European Union within European Regional Development Fund (to JC); The Faculty of Biochemistry, Biophysics and Biotechnology of the Jagiellonian University is a beneficiary of the structural funds from the European Union (grant No:
POIG.02.01.00-12-064/08). This work was also supported by DoD grant W81XWH-11-1-0512 and
