Regulacja ekspresji chemeryny w naskórku

Chemeryna jest wielofunkcyjnym białkiem głównie znanym ze względu na swoje własności chemotaktyczne oraz regulację różnicowania komórek tłuszczowych.

Gen kodujący chemerynę po raz pierwszy został odkryty w skórze stymulowanej tazarotenem, pochodną kwasu retinowego i nazwany TIG2 (ang. tazarotene induced gene 2) [1]. Chemeryna jest ligandem dla metabotropowego receptora związanego z białkiem G, CMKLR1 (ang. chemokine-like receptor 1) [2, 3, 4] i ma zdolność regulacji napływu komórek, które posiadają na swojej powierzchni receptor CMKLR1.

Należą do nich komórki układu odporności takie jak plazmacytoidalne komórki dendrytyczne (pDC), makrofagi oraz komórki NK [4, 5, 6, 7]. Czyni to chemerynę istotnym czynnikiem biorącym udział w rozwoju odpowiedzi immunologicznej.

Oprócz CMKLR1, z podobnym powinowactwem chemeryna wiąże się z dwoma innymi receptorami, GPR1 (ang. G protein-coupled receptor 1) oraz CCLR2 (ang. CC-motif chemokie like receptor 2). [8, 9]. Wśród wymienionych receptorów związanie chemeryny tylko z CMKLR1 skutkuje internalizacją receptora, mobilizacją jonów wapnia w komórce oraz migracją komórki zgodnie z gradientem chemeryny [3, 10].

Funkcje dwóch pozostałych receptorów pozostają słabo poznane, chociaż istnieją doniesienia, iż GPR1 może brać udział w utrzymywaniu prawidłowego stężenia glukozy we krwi [11], a CCLR2 reguluje lokalny poziom chemeryny poprzez wiązanie i prezentację chemeryny innym komórkom wyposażonym w receptor CMKLR1 [9, 12, 13].

Za głównych producentów chemeryny w organizmie, odpowiedzialnych za

utrzymywanie stosunkowo wysokiego, nanomolowego (~4 nM) stężenia chemeryny

w surowicy [14] uznaje się wątrobę oraz tkankę tłuszczową [10]. Badania ostatnich lat

pokazują, że chemeryna ulega znaczącej ekspresji również w nabłonkach tworzących

naturalne bariery organizmu, w płucach, jelitach oraz skórze [1, 16, 17, 18]. Jednakże

poziom ekspresji w tych barierach na tle innych rezerwuarów chemeryny pozostawał

nieznany. Dlatego w pierwszym etapie tej części badań wykonano analizę porównawczą

mysich tkanek, która ujawniła, że ekspresja genu TIG2 w skórze jest w przybliżeniu

dziesięć i sześć razy niższa w porównaniu do wątroby i tłuszczu (Załącznik 1, Ryc. 1A),

a na poziomie białka stężenie chemeryny w lizatach z tkanek było około dwa i trzy razy

niższe w skórze w odniesieniu do wątroby i tłuszczu (Załącznik 1, Ryc. 1B).

11

Rozwarstwienie skóry na naskórek i skórę właściwą ujawniło, iż to frakcja epidermalna jest głównie odpowiedzialna za produkcję chemeryny w zdrowej skórze, a poziom ekspresji chemeryny w tej tkance zbliżony jest do tego obserwowanego w wątrobie (Załącznik 1, Ryc. 1B). Zgadza się to z danymi literaturowymi, uzyskanymi w oparciu o badania immunohistochemiczne preparatów skórnych, iż chemeryna w zdrowej skórze lokalizuje się głównie w naskórku [16]. Jak opisano to powyżej, chemeryna może się wiązać do trzech receptorów, dlatego też aby zbadać czy poziom chemeryny jest regulowany lokalnie w tkankach poprzez wiązanie się chemeryny do tych receptorów przeprowadzono analizę ekspresji CMLR1, CCLR2 oraz GPR1 w wątrobie, tłuszczu trzewnym oraz skórze i jej frakcjach. Transkrypt dla wszystkich receptorów był obecny w każdej z badanych tkanek. Najwyższą ekspresję CMKLR1 zanotowano w tłuszczu, natomiast poziom mRNA dla CCLR2 i GPR1 najwyższy był w skórze, w szczególności w skórze właściwej (Załącznik 1, Ryc. 1C-1E). Uzyskane wyniki sugerują, że lokalne stężenie chemeryny w skórze może być regulowane poprzez wiązanie się chemeryny do wszystkich receptorów. Potwierdzają to wyniki uzyskane przez innych członków zespołu na zwierzętach z wyciszonymi genami kodującymi CMKLR1 i CCLR2 (Załącznik 1, Ryc. 1F-1G). Myszy z deficytem GPR1 nie były dostępne do wykonania podobnych badań. Analiza porównawcza ekspresji chemeryny i jej receptorów w ludzkich tkankach dała zbliżone wyniki do tych obserwowanych w mysich tkankach, za wyjątkiem braku znaczących różnic w ekspresji CMKLR1, CCLR2 oraz GPR1 pomiędzy naskórkiem, a skórą właściwą (Załącznik 1, Ryc. 2A-2E).

Profil ekspresji chemeryny jest inny w skórze zdrowej niż tej dotkniętej

zmianami chorobowymi o podłożu autoimmunizacyjnym, takich jak łuszczyca. Jak

wspomniano wyżej, w zdrowej skórze głównymi producentami chemeryny są komórki

budulcowe naskórka – keratynocyty, natomiast chemeryna nie jest wykrywana w skórze

właściwej. U pacjentów cierpiących na łuszczycę ekspresja chemeryny w naskórku jest

znacząco obniżona, przy jednoczesnej produkcji chemeryny przez komórki tworzące

skórę właściwą, gdzie pełni ona rolę chemoatraktanta dla komórek układu odporności

[1, 15, 16]. Korelacja pomiędzy profilem ekspresji chemeryny w naskórku i skórze

właściwej, a wystąpieniem łuszczycy sugeruje, iż czynniki odpowiedzialne za

patofizjologię tego schorzenia mogą wpływać na regulację produkcji chemeryny

w skórze. Aby to zbadać zastosowano model badawczy ludzkiego naskórka, który

opierał się na hodowlach pierwotnych, ludzkich keratynocytów, tworzących

12

wielowarstwową tkankę, tzw. hodowlach organotypowych lub inaczej hodowlach 3D (Ryc. 1).

Ryc. 1 Schemat organotypowej hodowli pierwotnych, ludzkich keratynocytów (hodowla 3D).

Keratynocyty ściśle porastają dno „koszyka”, który stanowi filtr o porach wielkości 0,4 m. „Koszyk”

umieszczany jest w naczyniu wypełnionym pożywką hodowlaną, która przedostaje się przez pory i odżywia komórki warstwy podstawnej. Górna powierzchnia hodowli ma kontakt z powietrzem co wraz z odpowiednio dobranym składem pożywki hodowlanej umożliwia różnicowanie keratynocytów i tworzenie wielowarstwowego modelu naskórka. Obraz histologiczny takiej hodowli przedstawiony jest w Załączniku 1, Ryc. 4E.

Cytokiny uwalniane przez komórki układu odporności naciekające zmienioną

chorobowo skórę oddziałują w pierwszej kolejności na keratynocyty budujące warstwę

podstawną naskórka, która znajduje się tuż nad skórą właściwą. Aby naśladować

rzeczywisty układ, w którym cytokiny działają na naskórek „od spodu”, badane

czynniki podawane były do medium hodowlanego, w którym następnie zanurzone były

filtry porośnięte przez organotypowe hodowle keratynocytów. Badanymi czynnikami

była IL-17 odgrywająca kluczową rolę w rozwoju stanu zapalnego w zmienionej

łuszczycowo skórze [19, 20] oraz IL-22 odpowiedzialna za nadmierne podziały

keratynocytów, co jest charakterystyczne dla tego schorzenia [21, 22]. Podanie cytokin

skutkowało zahamowaniem ekspresji chemeryny na poziomie transkryptu po 48

godzinach (Załącznik 1, Ryc. 3A i 3C). Ilość chemeryny wydzielonej do medium była

nieznacznie obniżona, jednak uzyskany wynik nie był istotny statystycznie (Załącznik

1, Ryc. 3B i 3D). W przypadku jednoczesnego podania cytokinin obserwowany efekt

nasilał się. Sugeruje to uzupełniające się nawzajem działanie tych cytokin. Te wyniki

uprawdopodabniają tezę, że IL-17 oraz IL-22 mogą być czynnikami bezpośrednio

13

odpowiedzialnymi za zmniejszoną ekspresję chemeryny w zmienionym łuszczycowo naskórku.

Przerwanie integralności skóry może prowadzić do infekcji. Towarzyszące temu powstanie stanu zapalnego ma na celu przeciwdziałać rozwojowi infekcji poprzez napływ komórek układu odporności, aktywować proces gojenia się rany oraz regenerację uszkodzonej tkanki. Komórki w miejscu zapalenia wydzielają tzw. czynniki

„ostrej fazy” mające na celu przywrócenie homeostazy organizmu, zaburzonej w wyniku procesu zapalnego [23]. Jedną z głównych cytokin „ostrej fazy” jest onkostatyna M (OSM), a jej działanie jest często wspomagane przez IL-1  . Co ciekawe, zwiększona ekspresja zarówno OSM jak i IL-1  jest obserwowana w skórze objętej zmianami łuszczycowymi [24, 25, 26]. Zadano sobie pytanie, czy czynniki „ostrej fazy”

będą wpływały na profil ekspresji chemeryny w skórze. Stymulacja keratynocytów za pomocą OSM i IL-1 ujawniła odmienny od IL-17 i IL-22 mechanizm regulacji ekspresji chemeryny w naskórku. OSM samodzielnie oraz w kombinacji z IL-1, silnie stymulowała ekspresję chemeryny w keratynocytach na poziomie mRNA (Załącznik 1, Ryc. 3A i 3C). Na poziomie białka zwiększoną ekspresję chemeryny obserwowano po 24 godzinach od podania OSM, a także OSM z IL- (Załącznik 1, Ryc. 3B). Po upływie 48 godzin różnica pomiędzy próbkami kontrolnymi, a stymulowanymi zmniejszała się (Załącznik 1, Ryc. 3D), choć wykazywała podobną tendencję do tej obserwowanej po 24 godzinnej stymulacji. Celem sprawdzenia czy chemeryna uwalniana do mediów jest wiązana przez receptory obecne na powierzchni keratynocytów zbadano poziom ekspresji CMKLR1, CCLR2 i GPR1, po stymulacji OSM i IL-1  (Załącznik 1. Ryc. 5). 24 godzinna stymulacja IL-1  oraz IL-1  w kombinacji z OSM skutkowała zwiększeniem ekspresji wszystkich receptorów.

W przypadku 48 godzinnej stymulacji tylko IL-1  zwiększała poziom ekspresji CMKLR1 i CCLR2, natomiast poziom GPR1 pozostawał niezmieniony. Przedstawione wyniki pokazują, iż wydzielana przez keratynocyty chemeryna może być wiązana przez receptory obecne na powierzchni komórek i autokrynnie wpływać na ich fizjologię.

Uzyskane wyniki sugerują, że prawdopodobnie istnieją różne ścieżki regulacji ekspresji

chemeryny przez cytokiny zaangażowane w rozwój łuszczycy. IL-17 i IL-22 hamują,

natomiast IL-1 i OSM zwiększają ekspresję chemeryny w keratynocytach, pomimo, iż

rozwojowi łuszczycy towarzyszy zwiększona ekspresja wszystkich tych cytokin [20, 21,

24, 25, 26]. Dodatkowo, istnieją doniesienia, że IL-1 podtrzymuje przewlekły stan

14

zapalny poprzez regulację dojrzewania limfocytów T produkujących IL-17 [27, 28, 29], a OSM hamuje różnicowanie keratynocytów [24], co najprawdopodobniej sprzyja rozwojowi łuszczycy. Z drugiej jednak strony OSM na wczesnych etapach łuszczycy hamuje ekspresję genów zaangażowanych w rozwój stanu zapalnego [26]. Ponadto IL-1  , a w mniejszym stopniu OSM uwrażliwiają naskórek na autokrynne działanie chemeryny poprzez zwiększenie poziomu ekspresji receptorów, co nie było obserwowane w przypadku stymulacji IL-17 i/lub IL-22 (Załącznik 1, Ryc. 5). OSM i IL-1  jako czynniki „ostrej fazy” regulują procesy naprawcze w uszkodzonej tkance, a fakt, że zwiększają również ekspresję chemeryny i jej receptorów sugeruje, iż chemeryna i jej receptory mogą być zaangażowane w poprawę stanu zmienionego łuszczycowo naskórka.

Jedno z głównych zadań naskórka jako zewnętrznej bariery organizmu, polega na ochronie przed patogennymi czynnikami obecnymi w środowisku zewnętrznym, takimi jak bakterie. Są wśród nich Staphylococcus aureus – główny czynnik bakteryjnych infekcji skórnych [30] oraz Escherichia coli – bakteria odpowiedzialna za infekcje wynikające z kontaktu skóry z treścią jelitową [31]. Aby uzyskać odpowiedź na pytanie czy mikroorganizmy mają wpływ na ekspresję chemeryny w naskórku, infekowano pierwotne, ludzkie keratynocyty rosnące w trójwymiarowej hodowli organotypowej (model ludzkiego naskórka) oraz mysią skórę za pomocą S. aureus i E. coli. Ponieważ w rzeczywistości bakterie oddziałują na najbardziej zewnętrzne warstwy naskórka (w odróżnieniu od cytokin głównie pochodzących z komórek naciekających skórę), badane czynniki podawane były „od góry” na keratynocyty mające kontakt z powietrzem. Uzyskane wyniki pokazują, iż bakterie indukują produkcję chemeryny przez keratynocyty (Załącznik 1. Ryc. 4A-4D, 7A-7B). Bakterie szczepu S. aureus silniej niż E. coli zwiększały ekspresję chemeryny, pomimo zastosowania takiego samego inokulum (10

CFU). Mogło to wynikać z lepszej przeżywalności tych bakterii na skórze lub stanowić specyficzną cechę S. aureus.

Celem sprawdzenia niniejszej hipotezy keratynocyty stymulowano za pomocą bakterii,

których wzrost był ograniczony przez obecność antybiotyku. Stężenie ampicyliny

zostało tak dobrane aby bakterie nie ulegały podziałom komórkowym, ale nadal

pozostawały żywe, a liczba bakterii S. aureus hodowanych z antybiotykiem i liczba

E. coli po 24 godzinach były porównywalne. Zarówno S. aureus jak i S. aureus

traktowane ampicyliną charakteryzowały się podobnym potencjałem stymulacji

15

produkcji chemeryny (Załącznik1, Ryc. 4A-4D). Sugeruje to, iż bakterie S. aureus produkują specyficzne dla swojego szczepu czynniki, które silniej niż czynniki produkowane przez E. coli wpływając na ekspresję chemeryny. Aby zbadać czy keratynocyty reagują zwiększoną produkcją chemeryny w odpowiedzi na obecność żywych bakterii, hodowle keratynocytów stymulowano przy pomocy komórek bakteryjnych, które uprzednio zostały zabite pod wpływem inkubacji w wysokiej temperaturze. W istocie, żywe bakterie mocniej niż zabijane termicznie stymulowały produkcję chemeryny (Załącznik 1, Ryc. 4A-4D) co sugeruje, że czynniki specyficzne dla żywych mikroorganizmów mogą brać udział w tym procesie. Na przestrzeni ostatnich lat pojawiły się teorie dotyczące tzw. vita-PAMPs (ang. viability associated pathogen-associated mlecular patterns), czyli czynników obecnych tylko u żywych baterii np. mRNA [32]. Prawdopodobnym wydaje się, że czynniki te mogą brać udział w regulacji ekspresji chemeryny w naskórku. Dodatkowo hodowle keratynocytów były stymulowane płynami pohodowlanymi uzyskanymi po odwirowaniu komórek z 24 godzinnej hodowli bakteryjnej. Zaobserwowano, że nie tylko zawiesiny bakterii, ale i w niektórych przypadkach również czynniki uwalniane do płynu hodowlanego przez bakterie wykazują tendencję do stymulacji ekspresji chemeryny (Załącznik1, Ryc. 4A-4D). Podsumowując, uzyskane wyniki sugerują, że patogeny obecne w środowisku mogą, angażując różne mechanizmy stymulować keratynocyty do produkcji chemeryny.

Wykonano również analizę immunohistochemiczną organotypowych hodowli keratynocytów traktowanych za pomocą bakterii (Załącznik 1, Ryc. 4E). Naskórek mający kontakt z żywymi bakteriami produkował więcej chemeryny niż hodowla kontrolna. Najwięcej chemeryny wydzielały keratynocyty tworzące warstwę podstawną, co pozwala przypuszczać, że dzielące się keratynocyty w największym stopniu odpowiadają za poziom chemeryny uwolnionej do medium hodowlanego.

Podczas gdy większość badanych czynników bakteryjnych zwiększała ekspresję

chemeryny w naskórku, taki efekt nie był obserwowany w przypadku receptorów

chemerynowych. 24 godzinna stymulacja hodowli keratynocytów za pomocą bakterii

E. coli oraz w mniejszym stopniu S. aureus skutkowała zmniejszeniem ekspresji

CCLR2 oraz GPR1, natomiast poziom mRNA dla CMKLR1 pozostawał niezmieniony

(Załącznik 1, Ryc. 6A). Co ciekawe, ekspresja CMKLR1 oraz CCLR2 wydawała się

być indukowana pod wpływem dłuższego kontaktu keratynocytów - 48 godzin

z żywymi bakteriami S. aureus (Załącznik 1, Ryc. 6B). Tego efektu nie obserwowano

16

w przypadku zastosowania bakterii E. coli ani czynników uwalnianych przez komórki bakteryjne do płynu hodowlanego. Na podstawie uzyskanych wyników można zaproponować istnienie odrębnych mechanizmów, które aktywowane są w naskórku pod wpływem kontaktu z bakteriami. Bakterie S. aureus stymulują wyłapywanie chemeryny przez receptory i prezentację chemeryny na powierzchni komórek tworząc

„tarczę ochronną”, natomiast bakterie E. coli generują pulę wolnej chemeryny,

działającej jak rozpuszczalny czynnik np. chemotaktyczny lub bakteriobójczy. Analiza

ekspresji receptorów dla chemeryny w mysiej skórze pod wpływem kontaktu

z bakteriami pokazała, że bakterie S. aureus zwiększają ekspresję CMKLR1 oraz GPR1

(Załącznik 1, Ryc. 7C i 7D). Bakterie E. coli natomiast zwiększają ekspresję CCLR2

i GPR1 (Załącznik1, Ryc. 7D i 7E). Współgra to z obserwacjami poczynionymi przy

użyciu modelu ludzkiego naskórka, iż keratynocyty w odmienny sposób regulują

ekspresję chemeryny i jej receptorów w odpowiedzi na E. coli i S. aureus.

17