G- fosfogUiko-/* laiari '
II.1. PRZEGLĄD METOD OZNACZANIA DWUNUKLEOTYDÓW NIKOTYNAMIDOADE NINOWYCH W TKANKACH /DANE Z PIŚMIENNICTWA/
W ponad 30~letniej historii badań nad dwunukleotydami niko- tynamidoadeninowymi stosowano do ilościowego oznaczania tycb z w i ą z k i bardzo dużą ilość metod i modyfikacji wykorzystujących różne rodzaje pomiaru: spektrofotometrię w zakresie nadfioletu '41,8 8,1 14,136,1 5 4»2 0 6,2 6 7/ i światła widzialnego /8 2,2 5 8,2 9 1/, fluorymetrig /8,17,30,41,65,128,139,177,182,183,205,217/, mano metrię /wg 182/, polarografię /9 3/ i technikę izotopową /6 4,2 1 9i/.
&azda metoda oznaczania składa się ogólnie z trzech etapów:
1 ekstrakcji dwunukleotydów z tkanek, 2/ rozdziału poszczegól ni oh postaci dwunukleotydów oraz 3/ oznaczania rozdzielonych dwunukleotydów. Każdy z nich zawiera oddzielne problemy anali-
yczne, jednak różnorodność opisanych metod dotyczy głównie spo sobu końcowego oznaczania ilościowego. V/ niniejszym przeglądzie °Btaną więc omówione oddzielnie poszczególne etapy oznaczania WUllukleotydów nikotynamidoadeninowych w tkankach.
' * * Mistrakc.Ta dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych z tka nek
Dwu-nukleotydy nikotynamidoadeninowe, zarówno utlenione jak edukowane, są łatwo rozpuszczalne w wodzie; wymycie ‘ich
Bezpośrednia pojedyncza ekstrakcja wszystkich postaci dwunukleotydów /HAD+ ,NADP+ ,HADH+H+ , M D P H + H +/ w środowisku wod nym obojętnym lub zbliżonym do obojętnego nie jest jednak możli wa ze względu na bardzo szybki rozpad enzymatyczny dwunukleoty
dów w toku ekstrakcji /8,136/. Zjawisku temu zapobiega NAm /8, 131/, co zostało wykorzystane do badań wewnątrzkomórkowego roz mieszczenia dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych, gdzie niez
będny jest znaczny oki^es czasu do r o z f r a k cjonowania komórki
/10,84,1 3 1,176,252/. Natomiast w metodach oznaczania dwunukleoty dów nikotynamidoadeninowych w nienaruszonych tkankach enzymy rozszczepiające te dwunukleotydy dezaktywuje się przez natych miastowe ogrzanie tkanki w środowisku obojętnym lub zbliżonym do obojętnego /przy ekstrakcji wszystkich postaci dwunukleotydów/ alkalicznym /w trakcie ekstrakcji dwunukleotydów zredukowanych/
lub kwaśnym /w trakcie ekstrakcji dwunukleotydów utlenionych/. •Przy stosowaniu kwasów odbiałczających ekstrakcję prowadzi się w niskich temperaturach /0-20/.
Przeprowadzona równolegle ekstrakcja alkaliczna i kwaśna dwóch części tkanki daje jednocześnie możliwość wykonania w spo- sóo najbardziej pi^osty rozdziału dwunukleotydów utlenionych od zredukowanych i dlatego jest powszechnie stosowana.
W nielicznych tylko metodach stosuje się pojedynczą ekstrak cje wszystkich postaci dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych buforem Tris-HCl o pH 8,2 /183/, buforem węglanowym o pH 7,4 /26?/, zbuforowanym /Tris-HCl o pH 7,2/ nasyconym fenolem /205, 206/ lub zimnym 0,04-N NaOH /21/. Pojedyńczą ekstrakcję kwaśną
dwu-Qukleotydów nikotynamidoadeninowych Held i wsp. /1 0 6/, ozni.c<..3
Óąc produkty rozpadu dwunukleotydów zredukowanych.
Szybki enzymatyczny rozpad dwunukleotydów nikotynamidoade ninowych w homogenacie tkankowym zwrócił uwagę na możliwość pośmiertnych zmian ich zawartości w tkankach, co należy
uwzględnić przy czynnościach preparatywnych oznaczenia. Jak vyka zano /tabl.4/ całkowita zawartość dwunukleotydów nikotynamidoade ninowych w tkankach nie zmienia się lub zmienia się w sposób praktycznie nieistotny w czasie wystarczającym do wypreparowania
świeżej tkanki. Szybsze zmiany dotyczą jednak poszczególnych po staci dwunukleotydów /szczególnie NADH+H^, co związane jest
z przejściem ze stanu aerobowego do anaerobowego po dekapitacji. W warunkach badania czystej ischemii in situ /zatrzymanie obie
gu krwi/, a także anoksji in vivo lub na wyizolowanych narządach wykazano, że zmiany zawartości NADH+H+ są bardzo duże w takich
tkankach jak mięsień sercowy, mózg, natomiast mniejsze w wątro bie i nerce /por. również poz. 33#87,241/*
Zalany sawartośol dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w tkankach Bzciura pod wpływem niedotlenienia* /Opracowanie własna s danych piśmiennictwa/
Nledotl
~ n
•niania
Kierunek 1 wielkość zmian Indywidualnych dwunukleotydów ora* au»
róinych postaci dwunukleotydów / % /
Sposób cr.no
/■In./
NAD* NADH+H* NADP* NADPH+H* NAD*
NADH+H* NADP* NADPH+H* Zawar tość całko wita Autor 2 1 -3 +16 -7 ♦4 - - - Burch 1 wsp. / 2 3 / 2 2 -19 +19 >- - -14 - - Brosnan i wsp. /15/ 1 rJ 3 -2 ♦77 -42 -6 +13 -21 +1 Jauany /139/ 4 3 - +130 - ♦15 - - - Scholz 1 wap. /240/ 1 4-5 -44 ♦33 -51 -6 -25 -24 -24 Jauany /139/ 1 5 - - -25 ♦5 - -10 - Burcb wap. /22/ 1 6 -22 +46 ♦6 -28 -9 -19 -13 Slatar 1 wap. /258/ 1 4-10 -20 -2 - - -13 - - Splrtaa 1 wap. /267/ 1 60 -29 -1 - - -18 - - Jed.lkln 1 wap. /13 6/ i—1 0 ,5 -25 +1720 -48 +58 +12 -4 +10 Chanc. 1 wap. /35/ 3 -16 +730 -12 ♦44 ♦10 ♦16 +10 5 0,5-2 +5 ♦55 - - +9 - - Lowry 1 wap. 5 8 -13 ♦245
- - +8 - - /180/Dana dla *yazy
. . .
I X Ł J ic iu,dwunuklaotydy nlkotynanldoad.nlnowe z wątroby ekstrahowano natychalast
po upływie cauau wykazanego w tablicyt 2 przerwanie dopływu krwi do wątroby, 3 -parfl^d /95? NZ + 5* C 0 ^ l" V l V 0 ' * " “ ok8* * /95 % " 2 + 5* C02/ narządu wyizolowanego,
ndowanagoj 5 _ zaaraianle głowy natychmiast 1 w wykapanym w tablicy ozaale po
Trudności w porównaniu poszczególnych eksperymentów wyni kają z różnych warunków niedotlenienia i metod badania jak rów nież z faktu, że szybkość pośmiertnych zmian substratów i koen zymów przemiany glukozy jest zależna od wieku i stanu badanych zwierząt /są one mniejsze u zwierząt będących pod narkozą/
/1 8 0/.
Zmiany zawartości dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w tkankach wywołane przez opisane wyżej warunki anokeemiczne
S£* jednak znacznie mniejsze niż nukleotydów adeninowych, fosfo- kreatyny i związków pośrednich przemiany glukozy /15*27.34,180/. Przedstawione dane wykazują, że przy oznaczaniu dwunukleo tydów nikotynamidoadeninowych sposób preparatyki tkanki odgrywa istotną rolę i ten etap postępowania należy brać pod uwagę przy analizie danych z piśmiennictwa.
Innym źródłem błędów, które można popełnić w toku ekstrak cji tych związków z tkanek jest zjawisko spontanicznego utlenia nia dwunukleotydów zredukowanych w ekstraktach alkalicznych /8 ,
1Q 1 *182,217/. Aby wyeliminować wpływ tego zjawiska na wyniki oznaczeń w niektórych metodach ilościowo utlenia się enzymatycz nie /1 3 9/ czy nieenzymatycznie /217/ dwunukleotydy zredukowane w ekstrakcie lub oznacza powstające w tym procesie ich postacie
utlenione /8/ albo utrzymuje się wyekstrahowane dwunukleotydy w postaci zredukowanej przez dodanie specyficznego enzymu /177/ bądź także antyutleniaczy jak cysteina /21,181,182/ lub aslcor- binian /2 1/. Neuhoff i wsp. /2 0 6/ uważają, że zjawisko to nie
zachodzi, jeśli ekstrahuje się dwunukleotydy nikotynamidoadeni nowe w obojętnym nasyconym roztworze wodnym fenolu w obecności
cysteiny, Heldt i wsp. /1 0 6/ natomiast proponują pojedynczą ekstrakcję kwaśną i oznaczanie produktów rozpadu dwunukleotydów zredukowanych*
Wie ma w piśmiennictwie zgodności, co do przyczyn tego zja wiska. Sugeruje się nieenzymatyczne utlenianie dwunukleotydów zredukowanych przez wolne flawiny /8/, utleniony glutation /GS3G/ /206/ lub nienaruszoną hemoglobinę /21,181,182/. Proces zamraża nia i odmrażania tkanek ma być istotnym momentem stymulującym utlenianie dwunukleotydów zredukowanych w toku ekstrakcji /2 1, ■204/.
Zagadnienie doboru odpowiednich warunków ekstrakcji dwunu- kleotydów nikotyn midoadeninowych z tkanek jest przedmiotem zain teresowania dopiero od 5 - 1 0 lat, a w wielu pracach nie jest do dzisiaj dostrzegane. Błędy, które mogą powstawać ma tym etapie raają przeciwstawny kierunek/"wzrost” zawartości dwunukleotydów
zredukowanych w trakcie preparatyki tkanek i "spadek” tych posta- _ j
przy nieodpowiednich warunkach ekstrakcji/, co stwarza dodat kowe trudności w analizie danych z piśmiennictwa.
Rozdział czterech postaci dwunukleotydów nikot.ynamido- ądeninowych /KAP*.MAPH+H+.MDP^.MDPH+H*/ w ekstraktach
tkankowych
Wiadomo, że utlenione postacie dwunukleotydów nikotynamido adeninowych są stabilne w środowisku kwaśnym a ulegają rozkłado wi w alkalicznym , odwrotnie postacie zredukowane są stabilne
alkalicznym natomiast podlegają rozkładowi w środowisku kwaś- yu /2 4,2 5ti4 4łi4 6t1Q.j/ł zjawisko to zostało wykorzystane do
rozdziału dwunukleotydów utlenionych od zredukowanych we wszyst kich dotychczas opisanych ilościowych metodach oddzielnego ozna czania wszystkich czterech postaci dwunukleotydów nikotynamido- ^deninowych. Rozdział ten jest wystarczający do oznaczenia indy widualnych dwunukleotydów w technikach opartych na zasadzie re-
cyklicznej oraz bezpośrednich metodach spektrofotometrycznych i iaotopowych, w których oznacza się NAD-* obok NADP+ i NADH+H* °bok HADPH+Bf przy udziale specyficznych enzymów. W metodach bezpośrednich fluorymetrycznych konieczne jest oddzielenie dwu nukleotydu nikotynamldoadeninowego od fosforanu dwunukleotydu nikotynamidowego, ponieważ fluorescencję indukowaną wykazują obydwa dwunukleotydy /144,183/- Rozdziału I4AD+ od NADP* /BADH+H* °d IUDPH+H+/dokonuje się w nich przez ilościową enzymatyczną redukcję /lub utlenienie/ jednej z postaci i specyficzny rozkład W brodowisku kwaśnym lub alkalicznym/rys. 1’Oa/Jedynym wyjątkiem
jest metoda wykorzystująca pomiar fluorescencji natywnej dwunu kleotydów /65/, pozwalająca na oznaczanie HAD‘r / M D H + H +/ i NADP* /KADPh+h+/ obok siebie, ponieważ fluorescencję natywną wykazują wyłącznie dwunukleotydy zredukowane.
Znane są jeszcze inne bardziej klasyczne sposoby rozdziału dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych z wykorzystaniem do tego celu chromatografi bibułowej /2 6/, kolumnowej na wymieniaczach jonowych /118,220,246,295/, cienkowarstwowej /2 3 9,2 9 5/ i elektro forezy bibułowej /245/• Metody te nie znalazły zastosowania do rutynowego, ilościowego oznaczania absolutnych zawartości dwunu kleotydów nikotynamidoadeninowych w tkankach bądź ze wzglądu na ezadowalający odzysk poszczególnych postaci po rozdziale /do
tyczy to zwłaszcza dwunukleotydów zredukowanych/, bądź z uwagi na niaką wykrywalność oraz skomplikowaną i czasochłonną proce durę. Wykorzystuje się je głównie do badań metabolizmu dwunu kleotydów nikotynamidcadeninowych techniką izotopową, w których jest konieczny tylko dokładny rozdział dwunukleotydów od ich prekursorów, i pochodnych. Rozdział kwaśnych ekstraktów tkanek na wymieniaczach jonowych w ciągłym gradiencie mrówczanowym
118/ jest przydatny do jednoczesnej analizy utlenionych posta- 01 dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych oraz innych wolnych nukleotydów tkanek i w tym typie badań jest z powodzeniem stoso wany również w Polsce /110,143,175/.
Jedyną ilościową metodę oznaczania wszystkich czterech po staci dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w ekstraktach tkan kowych, opartą na technice jonowymiennej, zaproponowali Heldt
wap. /1 0 6/ ale ani oni sami, ani nikt inny do tej pory się nią nie posługiwał.
1 1 "1 A t -% /
* -^ osciQVJ© oznaczanie rozdzielonych dwunukleotydów niko- tynamidońdeninow.ych w ekstraktach tkankowych
Sposób oznaczania zawartości dwunukleotydów nikotynamidoade 1uowych w ekstraktach tkankowych decyduje o takich parametrach
alitycznych jak wykrywalność i specyficzność oraz praktycznych stopień trudności, czasochłonność i koszt wykonywanych badań 'noj. inooć opisanych w piśmiennictwie metod oznaczania dwunu-
ydów nikotynamidoadeninowych wynika głównie ze sposobu ich nia w ekstrakcie i ten etap może stanowić podstawę kla-
lić na dwie grupyj 1/ Metody recykliczne, które wykorzystują działanie katalityczne dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w cyklu rekacji enzymatycznych. 2/ Metody bezpośrednie, w któ rych końcowy oznaczany produkt występuje w stosunku 1 : 1 z obec nymi w ekstrakcie dwunukleotydarni.
H * 1.3*1. Metody recykliczne. Są to metody enzymatyczne, W których dwunukleotydy nikotynamidoadeninowe są częścią składo wy łańcucha reakcji oksydoredukcyjnych i w dobranych warunkach
znaczania akumulacja końcowego produktu jest wprost proporcjo- alna do stężenia dwunukleotydu oznaczanego w próbie. Ze wzglę-
na technikę pomiaru produktu akumulacji lub jednego z rea~ tantów można je jeszcze podzielić na manometryczne, spektrofo- ometryczne, fluorymetryczne, polarograficzne i izotopowe.
Manometryczne metody recykliczne mają już tylko znaczenie historyczne, jako pierwsze opisane metody oznaczania dwunu- kleotydów nikotynamidoadeninowych /lata 1935-1945/. Obecnie nie
3 stosowane. Z kronikarskiego obowiązku należy odnotować meto- £ Marburga i wsp. /cyt. wg 182/, którzy stosowali system skła- «1ący się a D-glulcozo-6-f osforanu, oksydoreduktazy D-glukozo- fosforansNADP+ oraz "żółtego enzymu” Warburga. Stężenie NADP+ kreślano na podstawie pomiaru manometrycznego ilości zużytkowa n o pr^ez układ tlenu. Jandorf i wsp. oraz Anfinsen /cyt. wg
/ wykorzystali do oznaczenia NAD+ system składający się z D- oktozo-1,6-dwufosforanu oraz enzymów katalizujących przejście
8 substratu do fosfoglicerolu i fosfoglicerynianu. Stężenie ■^AD fil
na podstawie pomiaru CO^ uwolnionego z buforu dwuwęglanowego.
spektrofoto-metrycznym opiaali w 1955 r. Glock i wsp. /d > 2 /. W systemie sto sowanym przez autorów do oznaczania WAD4/WADH+I14/ nadmiar cyto- ćhromu c redukuje się w obecności nadmiaru etanolu, oksydore duktazy alkohol: WAD+/ADH/ oraz oksydoreduktazy zredukowany WAD./akceptor/. W systemie stosowanym do oznaczania WADP+
KADPH+H/ cytochrom c redukuje się w obecności nadmiaru D-gluko- zo-b-ioBforanu, oksydoreduktazy D-glukozo-6-fosforan:WADP4*
oksydoreduktazy zredukowany NADP:/akceptor/. Stopieii redukcji cytochromu c śledzi się spektrofotometrycznie przy 5 5 0nm; jest
n Proporcjonalny do stężenia odpowiednich dwunukleotydów w wa- Unkach oznaczania. Zasadę bej metody przedstawia schematycznie ysunek 9. Jest ona wspólna dla wszystkich technik recyklicznych, m ieniają eię tylko składniki łańcucha reakcji i sposób końcowe go oznaczenia. Zasady opisanych w piśmiennictwie metod recykli cznych zestawiono w tablicy 5.
TKA N kr NAD? NADH NADP*NADf>H C ytocH rom C J ł ticllA ' . WvirVy g U < o jo 6 fo *(o -. - ro a < / > * E L >
K J
[ o l u k o n o - i - l a - k t o r t - 6 - fo & f o l ...;j Ł S n .~ J cyłochrom C u tle n io n y ^ n a d n iia *') *10^0 T T I dtthydyosericuoi luhydrogemna glukozo-(5-fosforanowo. imdwkowarucjo NADPtylocWłom C <ilaaol 1
(«odnV>av) | fNAD+L / * *»Wl>Aotł«tty
„ ak w m w
-ciehy clyogtuazu
alkoholowa zyedkłUouairtego NRP
fasada oznaczania dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych w tkań
kacb metodą recykliczną Glocka 1 wsp, /82/. /Własne opracowanie
Metody recykllczne oznaczania dwunukleotydów nlkotynamldoadeninowycb
w tkankach) ayatemy cyklów enzymatyoznyoh. /Zestawienia w l«an« danych
* piśmiennictwa/
Autor
Oznaozany
'•“unukleotyd SubBtrat w nadmiarze Enzym lub czynnik katalizujący
reakcj, Produkt pośredni 1 akumulujący sly
/podkreślono/ Pomiar* mol.XX /w pró- bl»/ Slo<* 1 wap. /82/ NAD lub NADH*Hł Etanol
Cytochrom c utl. ADHDH zred. WAD NADHtH*
Cytochrom c Łrod* A 10~9 --- . NADP+lub »ADPHtHł O-6-p
Cytochrom o utl. DH 0-6-P DH zred.NADP NADPHłH*
cytochrom c zred. 550n« Slatar 1 wnP./258/ HAD+lub NADH+H* Etanol
DCPIP H.r.ADH NADHłH*
DCPIP zred. A
VIII*
«ADP+iUb
NADPH+H+ 0-6-PDCPIP DH G-ć-P
H.F. NADPH+H* DCPIP zred.
600 nm 10
/291/ NAD+l„bn a d h+r Etanol
DCPIP ADH
Dlaforaza z Clostrldlum kluyveri
NADHtH* DCPIP zred. * 10-9 * — _ _ _ _ _ _ NADP+lub NAl)PH+H+ <3-6-P DCPIP DH 0-6-P
Dlaforaza z Cloatrldlum kluyverl NADPH+H* DCPIP zrud*
®*">«nbaua
1 VBP./93/
NAD+lub
n a d h+h* EtanolTlen ADH
M.r. NADH+H* P 1 0 - 11 ■---- ■ NADP+lub h a d p h+h* 0-6-P Tlen DH G-ć-P M.F. NADPH+H* Lov,rJ i wsp. /182/ NADHtH* lub NAD* 2-0ksoglutaran,HHj mleczan NADH+H* DH glutumlnianowa LDH ŁDH NAD* plrpgronlan NAD 1 0 -15 a,a«a«tti NADPHtH* lub NAD P+ 2-oknoglutaran.NH G~6-P NADP DH glutamtnlanowa DH 0-6-P DH 6-P-glukon NADP* 6-P-glukon NADPHłH* r 1 '"‘P./88/ c a r t u r /JO/ n a o p h+h* G-6-P GSSG Dwutłopirydyna DH 0-6-P reduktaza OSSG Reakcja nleenzymatyczna NADPK+H* OSH tioDlrvdon k ^*3 na io- 11
n a d h+h^ RezazurynaEtanol ADH
M.F. KADH+H* rezoruflna F 1 0 - 11 Kaneko NADP lub NADPH+H* G-6~p Razazuryna DH 0-6-p M.F. NADPH+H* 1 v «P./1ł2/
lub NAD* mleczan-ł- c H-okaoglutarantNH~ ,
' plrogrontan-1- c DH glutamlnlanowa LDH DH plrogronlanowa MAD+ 14 jslrogronlan-1- C ™CO.. R 5*10' 12
i I ■ pomiar flu or e a c e n o j 1 j R, pomiar radioaktywności) P, poalar polarograflczny
. ' ' ; : f . 1
>
- 31
-Enzymatyczne systemy recykliczne mają wiele zalet. Są one
zupełnie specyficzne przy stosowaniu dostatecznie czystych pre
Paratów enzymatycznych, proste w wykonaniu i szybkie. Zasada
oznaczania eliminuje w pewnym stopniu błędy wynikające ze spon
Panicznego utleniania dwunukleotydów zredukowanych w ekstrakcie.
Madą metod stosujących sztuczne barwniki red-ox i cytochrom c
jest występowanie w większości ekstraktów tkankowych substancji
redukujących /np. glutation, askorbinian/ przeszkadzających
w normalnym przebiegu cyklu reakcji i wymagających specjalnego
systemu prób ślepych / 4 1 ,258,291/.
System recykliczny opisany przez L o w r y ’ego i wsp. /1B2/ jest najczulszą z opisanych dotychczas metod oznaczania dwunu kleotydów nikotynamidoadeninowych. Skomplikowana procedura
i konieczność udziału aż 4 enzymów ogranicza jednak praktyczne
zastosowanie tej techniki.
II.1.3.2. Metody bezpośrednie. Posługują się techniką spe
ktrofotometry czną, fluorjmetryczną i izotopową.
Metody spektrofotometryczne wykorzystują zmianę widma
absorpcyjnego NAD+ i ImA D P + przy przejściu w odpowiednie po s t a
cie zredukowane i polegają na specyficznej, enzymatycznej, iloś
ciowej redukcji dwunukleotydów utlenionych lub utlenieniu zredu
kowanych oraz na pomiarze zmiany absorpcji przy 340ruu /specy
ficzne maksimum pochłaniania dwunukleotydów nikotynamidoadenino-
wych zredukowanych/.
Najbardziej znane opracowania tej zasady przedstawia ta blica 6.
ośrednie metody spektrofotometryczne oznaczania dwunukleotydów
'ukotynanidoadeninowych w tkankach; specyficzne układy enzymatyczne. /Zestawienie własne danych z piśmiennictwa/
Autor Oznaczany dwun ukleotyd Układ enzymatyczny /enzym - substrat/ Pomiar^ C i o U i i wsp. NAD* HADP* NA D H + H + NADP1I+H* NADPH+H* ADH - etanol DH izocytryfcianowa - izocytrynian ADH - aldehyd octowy
DH zred, HADP - cytochrom c utl. reduktaza GSSG - GSSG + + “ w 1 NA D + NADP* NADH+H* NADPH+H* ADH - etanol DH G -6-P - G -6-P DH glicero-3-fosforanowa - fosfo- dwuhydroksyaceton
DH glutaminianowa (NAD /P/] - 2-ok- soglutaran, HH^ + + / l ^ f r i b e r g NAD* NADP* NADH+H* NADPH +H* ADH - etanol DH G-6- F - G-6-P LDH - pirogronian
DH glutaminianowa (NAD /?/\ - 2 -ok-soglutaran, NH/4* + + NeuUoff i wsp. /206/ NAD* NADP* n a d h+h* n a d.p h+h‘ ADH - etanol DH G-6-P - g-6-P LDH - pirogronian reduktaza GSSG ~ GSSG + + + +
Metody bezpośrednie spektrofotometryczne są proste i szyb kie. Wymagają jednak stosowania wielu enzymów i ich czułość
Jest stosunkowo niewielka /przy standardowych warunkach pomiaru spektrofotometrycznego w kuwecie 10 x 10 mm można wykryć ilości w i§ksze niż. 10 ^ mola w próbie oznaczanej/. Poza tym istnieje £
zawsze niebezpieczeństwo spontanicznego utleniania się dwunu
kleotydów zredukowanych w ekstrakcie alkalicznym. jj Metody fluorymetryczne wykorzystują zdolność niektórych
; i
związków /mocny ług, aceton, keton metylowo-etylowy/ do wywoły wania fluorescencji dwunukleotydów nikotynamidoadeninowych ,a w jednej metodzie /6 5/ fluorescencję natywną dwunukleotydów zre dukowanych. 0 ile pierwsze próby zastosowania acetonu i ketonu
I